Name: 使用分叉 A4F 微流控装置从大体积样品中单步分离细胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习使用分叉A4F微流控装置从大体积生物流体中单步分离细胞外囊泡的方法。该技术实现连续流动与自动化，可与生物反应器集成，提高临床应用的实用性。

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感谢所有参与本研究的捐赠者，以及拉脱维亚基因组数据库工作人员提供的样本。拉脱维亚大学固体物理研究所作为卓越中心，获得了欧盟“地平线2020”框架计划H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2（资助协议编号739508）项目CAMART2的资助。本研究得到了拉脱维亚科学委员会项目No. lzp-2019/1-0142和项目No. lzp-2022/1-0373的支持。

样本采集已获得拉脱维亚大学生命与医学科学研究伦理委员会批准（决定编号 N0-71-35/54）
注意：本研究中使用的材料包含在材料清单文件中。
1. 三维（3D）打印模具的制备
<ol>
	<li>在 CAD 软件中设计一个蛇形双负模具，上通道尺寸如下：高度 0.5 mm，宽度 1 mm，长度 210 mm。下通道采用相同设计，宽度为 1.5 mm，高度为 0.6 mm，长度为 210 mm。模具的宽度、长度、高度等尺寸及设计等轴测图如图1所示。将设计保存为 .stl 文件。</li>
	<li>在 Z-Suite 中准备该文件，无需添加支撑。使用耐黑色树脂，通过紫外光液晶显示器（UV LCD）3D 打印机打印模具。</li>
	<li>打印完成后，小心地将模具从打印机表面取下。在异丙醇（IPA）中进行超声清洗 20 分钟。</li>
	<li>用 N2 吹干模具。</li>
	<li>使用 ND33 滤光片对模具进行泛光曝光 810 秒，然后将其放入 60 °C 的烘箱中固化 48 小时。</li>
</ol>
2. PDMS 模具的制备
<ol>
	<li>按10:1的质量比称取PDMS（每个模具使用16 g弹性体基础剂和1.6 g交联剂）。在行星式离心混合器中混合组分，以500 RPM转速混合1分钟。</li>
	<li>将混合后的PDMS浇注至3D打印模具中，并在-800 mbar的真空干燥器中脱气30分钟，或直至观察不到气泡。</li>
	<li>在液态PDMS表面小心放置一层100 µm厚的聚氯乙烯衬层。 
	NOTE: 应从一侧缓慢覆盖衬层至另一侧，以避免产生气泡。</li>
	<li>将含有PDMS的模具放入原位成型夹具（Mold-in-Place Jig）中，并使用设定为0.3 Nm扭矩的扭矩扳手拧紧夹具。</li>
	<li>将夹具放入60 °C烘箱中加热3小时，使PDMS固化。</li>
	<li>使用六角扳手拆卸夹具，并从夹具中取出3D打印模具。</li>
	<li>小心地将PDMS模具从3D打印的母模上脱模，先用手术刀沿模具边缘划开，再用镊子取下模具。 
	&#8203;NOTE: 为便于脱模，可使用异丙醇（IPA）；但之后需将模具在60 °C加热10分钟，以蒸发残留的IPA。</li>
</ol>
3. OSTE-COC 上层通道的制备
<ol>
	<li>按1.09:1的质量比称取OSTE（制备5个装置需要1.56 g A组分和1.44 g B组分）。将组分在行星式离心混合器中混合：以750 RPM转速混合5分钟，然后以750 RPM转速脱气5分钟。</li>
	<li>将混合好的OSTE转移至离心管中，在真空干燥器中于-800 mbar条件下脱气30分钟。</li>
	<li>将带有2个16个微型鲁尔接头的COC载片在异丙醇（IPA）中超声清洗10分钟，随后用N2小心吹干。</li>
	<li>将清洁后的COC载片放入等离子体刻蚀仪中，使平面朝上放置，并在700 W功率、0.133 mbar压力下使用800 SCCM氧气等离子体处理表面2分钟。</li>
	<li>将经氧化处理的COC载片放置在用于上层通道的PDMS模具上，确保处理过的表面与PDMS的结构化表面接触。将组件装入原位成型夹具中，并使用设定为0.3 Nm扭矩的扭矩扳手拧紧夹具。</li>
	<li>将压力系统连接至6 bar的压缩空气管线。取装有脱气后OSTE的离心管，按照压力系统的说明，使用内径（ID）为0.8 mm的聚四氟乙烯（PTFE）管进行组装。</li>
	<li>将PTFE管连接至PDMS模具的入口，利用压力系统中压电泵维持的1000 mbar压力填充装置。将夹具玻璃面朝上放入掩模对准仪中，使用ND33滤光片进行850 mJ剂量的曝光。</li>
	<li>曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，并小心地将带有结构化OSTE层的COC载片从PDMS模具上取下。</li>
	<li>将结构化的OSTE与一片25 mm × 75 mm、孔径为50 nm、孔密度为11.8%的膜接触，确保通道完全被膜覆盖。 
	注：在操作过程中尤其需要注意保持膜尽可能平整。</li>
	<li>将组件膜面朝上置于设定为60°C的加热板上，在膜上方放置一块干净的玻璃载片，并从上方施加1.6 kPa的压力以确保均匀键合。加热过夜。 
	&#8203;注：此步骤之后，尤其需要评估键合效果和通道形变情况。</li>
</ol>
4. OSTE-COC 底层通道的制备与装置组装
<ol>
	<li>按1.09:1的质量比混合OSTE（制备5个装置需要1.56 g的A组分和1.44 g的B组分）。在行星式离心混合器中混合组分：以750 RPM转速混合5分钟，然后以750 RPM转速脱气5分钟。</li>
	<li>将混合好的OSTE转移至离心管中，在真空干燥器中于-800 mbar下脱气30分钟。</li>
	<li>将COC载片在异丙醇（IPA）中超声清洗10分钟，并用N2小心吹干。</li>
	<li>将清洁后的COC载片放入等离子刻蚀仪中，在700 W功率、0.133 mbar压力条件下，使用800 SCCM的氧气等离子体处理表面2分钟。</li>
	<li>将经氧化处理的COC载片放置在PDMS模具上，用于底部通道，确保处理过的表面与PDMS的结构化表面接触。将组件放入原位成型夹具中，使用扭矩扳手以0.3 Nm的扭矩拧紧夹具。</li>
	<li>取装有脱气后OSTE的离心管，按照压力系统说明，使用内径为0.8 mm的PTFE管进行组装。</li>
	<li>将PTFE管连接至PDMS模具的入口，利用1000 mbar的压力填充装置。将夹具玻璃面朝上放入光刻对准仪中，使用ND33滤光片进行1100 mJ剂量的曝光。</li>
	<li>曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，并小心地将带有结构化OSTE层的COC载片从PDMS模具上取下。</li>
	<li>将结构化的OSTE层与顶部通道组件结合，使顶部和底部层的设计相互对齐，并确保OSTE底层与膜接触。</li>
	<li>将组件插入原位成型夹具中，使用鳄鱼夹均匀施加1.6 kPa的压力。将夹具置于60°C烘箱中过夜。 
	&#8203;注意：夹子位置不均匀可能导致键合不均。</li>
</ol>
5. 设备评估
<ol>
	<li>键合完成后，使用显微镜对器件进行目视检查，观察是否存在可视缺陷，例如通道变形或键合失败。</li>
	<li>通过施加 30 mbar 压力，使 0.02 µm 过滤的去离子水流经无缺陷器件的通道，进行测试。观察流道和鲁尔接口是否存在泄漏以及水流情况。 
	&#8203;注意：若未检测到泄漏且通道内水流畅通无阻，可认为器件适用于后续实验。</li>
</ol>
6. 设备设置
<ol>
	<li>用两个5 mL注射器各吸入2 mL经过20 nm滤膜过滤的3% H2O2，并将注射器安装到注射泵上（使用移动箭头调整至所需位置，插入注射器，并用顶部压杆固定）。 
	警告！操作H2O2时务必小心。请穿戴实验服、防护橡胶手套和护目设备。</li>
	<li>使用注射器针头将14 cm长、内径800 µm的PTFE管连接至注射器，并通过鲁尔接头将其连接至装置的入口。</li>
	<li>将20 cm长、内径200 µm的聚醚醚酮（PEEK）管连接至出口。</li>
	<li>将PEEK管的另一端连接至废液容器。装置设置如图3所示。</li>
	<li>启动注射泵，设置每个入口的流速为500 µL/min（在仪器屏幕上操作：设置 &#62; 系统设置 &#62; 注射器（制造商：医用注射器，注射器：5 mL）&#62; 返回按钮 &#62; 参数（选择：推注，重复：1，体积：1.5 mL，流速：500 µL/min）&#62; 返回按钮 &#62; 返回按钮）。将流出液收集至废液容器中。</li>
	<li>取两个新的5 mL注射器，各吸入2 mL经过20 nm滤膜过滤的70%乙醇。</li>
	<li>将先前的注射器更换为装有乙醇的注射器，并按照步骤6.5所述相同参数启动注射泵。</li>
	<li>使用新的5 mL注射器，各吸入5 mL经过20 nm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>将先前的注射器更换为装有PBS的注射器，并重复步骤6.1和6.5，用4 mL PBS冲洗装置。 
	注意：请确保将系统设置参数更改为体积：4 mL（在仪器屏幕上操作：设置 &#62; 参数 &#62;（选择：体积：4 mL））。</li>
	<li>断开装置上的管路，并用鲁尔封堵头封闭每个入口和出口。 
	注意：保持装置内留有PBS，并在封闭前使用移液枪向每个入口和出口补充少量PBS，以避免引入气泡。</li>
	<li>将装置在室温（RT）下避光静置过夜。</li>
	<li>次日，用4 mL经过20 nm滤膜过滤的PBS冲洗装有PBS的装置（操作如步骤6.8所述）。</li>
	<li>从两个出口收集最后1 mL流出液，置于2 mL低吸附蛋白管中，4 °C保存，作为装置引入颗粒的空白对照。</li>
	<li>移除装有PBS的注射器，更换为装有空气的新的5 mL注射器。</li>
	<li>用4 mL空气吹扫装置，直至所有液体完全排出装置和管路。</li>
</ol>
7. 使用标准化乳胶微球进行设备测试
<ol>
	<li>使用1.0 µm聚苯乙烯微球和0.1 µm羧基微球制备标准化微球样品。向一个15 mL离心管中加入500 µL的1.0 µm聚苯乙烯微球标准品、1 µL的0.1 µm羧基微球标准品以及9499 µL的20 nm滤过的PBS缓冲液（最终1.0 µm和0.1 µm微球混合液的浓度分别为5 × 10⁸ 个微球/mL和3.6 × 10¹⁰ 个微球/mL）。</li>
	<li>将微球样品涡旋振荡30秒，不使用时置于+4 °C保存。</li>
	<li>取两个新的5 mL注射器，其中一个加入1.5 mL标准化微球混合液，另一个加入1.5 mL的20 nm滤过的PBS缓冲液。</li>
	<li>移除先前连接的注射器，将装有微球混合液的注射器连接至第一进样管路，另一个装有PBS的注射器连接至第二进样管路。</li>
	<li>移除废液容器，并为每条出样管路准备至少五个0.5 mL的微量离心管。</li>
	<li>将注射泵系统的启动参数设置为体积：1 mL；流速：250 µL/min。 
	注意：根据用户需求，可设置不同的流速，例如250 µL/min、200 µL/min、150 µL/min、100 µL/min和50 µL/min。建议进行预实验以选择最适合目标结果的流速。</li>
	<li>启动注射泵，收集流出液——每个微量离心管中收集5至6滴。 
	&#8203;注意：若同一装置需多次使用，请按照步骤6.8所述冲洗装置，并更换所有连接件、堵头和针头。将使用过的连接件、堵头和针头置于20 nm滤过的70%乙醇中浸泡至少30分钟；随后转移至含有20 nm滤过的去离子水的离心管中，充分震荡，再转移至含有20 mL 20 nm滤过的去离子水的培养皿中。将培养皿置于摇床上以100 rpm振荡至少30分钟，之后将各部件转移至干燥的培养皿中静置干燥（至少12小时），方可再次使用。</li>
</ol>
8. 使用尿液样本进行设备测试
<ol>
	<li>按照步骤 6.1–6.15 所述准备设备。</li>
	<li>使用无菌尿液容器收集每位供体的晨尿 100 mL，并在采集后 2 小时内送至实验室进行处理。</li>
	<li>将每份尿液样本分装至两个 50 mL 离心管中，在室温下以 2'000 x g 离心 15 分钟。</li>
	<li>收集上清液，弃去沉淀。</li>
	<li>将上清液在室温下以 10'000 x g 离心 30 分钟，以去除大颗粒和细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液，弃去沉淀。</li>
	<li>按照步骤 6.6 所述清洗设备。</li>
	<li>将 5 mL 注射器更换为装有预处理尿液样本的 20 mL 注射器（用于样品入口），以及另一个装有 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 DEPC-PBS 的 20 mL 注射器（用于缓冲液入口）。将注射泵设置更改为 BDPlastipak；注射器：cc；体积：20 mL；流速：250 µL/min（最佳流速），设置方法与步骤 6.2 所述相同。启动注射泵，并将每个出口的穿流液分别收集至不同的 50 mL 管中。</li>
	<li>使用 100,000 分子量截留浓度管，在 4 °C 条件下以 3,000 x g 将每份穿流液分别浓缩至 100 µL。</li>
	<li>将浓缩液转移至 0.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>涡旋震荡浓缩样品 30 秒，然后离心 10 秒。</li>
	<li>将样品分装，每管转移 25 µL，做好标记后于 -80 °C 冻存以长期保存。</li>
</ol>
9. 使用条件培养基进行设备测试
<ol>
	<li>按照步骤 6.1–6.15 所述准备设备。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 的加湿环境中培养，直至总细胞数达到 1 亿，具体参照 Bajo-Santos 等人20 的方法。将细胞传代至一个 T175 悬浮培养瓶中，加入 100 mL 无血清培养基（补充 2% B-27 血清替代物），在 37 °C、5% CO2 的加湿环境中继续培养 48 小时。</li>
	<li>收集细胞悬液，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，以去除细胞。</li>
	<li>收集上清液，并在 +4 °C 下以 3,000 x g 再次离心 30 分钟，以去除大颗粒和细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液并置于 +4 °C 保存，直至进行分离操作，但保存时间不得超过 3 小时。</li>
	<li>将样品入口的 5 mL 注射器更换为装有已制备条件培养基的 20 mL 注射器，缓冲液入口更换为装有 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 的 20 mL 注射器。</li>
	<li>按照步骤 7.8 所述设置泵站参数。</li>
	<li>启动注射泵，分别用独立的 50 mL 离心管收集每个出口的流出液。</li>
	<li>使用 100,000 分子量截留的浓缩管，在 +4 °C 下以 3,000 x g 将每份流出液分别浓缩至 150 µL。</li>
	<li>将浓缩液转移至 0.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>涡旋震荡浓缩样品 30 秒。</li>
	<li>将浓缩样品短暂离心 10 秒。</li>
	<li>将样品分装，每管转移 25 µL，标记后于 -80 °C 冻存，用于长期保存。</li>
</ol>
10. 使用超速离心法分离细胞外囊泡
<ol>
	<li>使用固定角转子离心机，在 +4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 20 mL 尿液或条件培养基 70 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于 20 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。</li>
	<li>再次离心，操作同步骤 10.1 所述。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于 12 mL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。</li>
	<li>使用水平转子，在 +4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 70 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。 
	注意：此次弃去上清液时需格外小心，建议使用移液器操作。</li>
	<li>将沉淀重悬于 100 µL 经 20 nm 滤膜过滤的 PBS 中。</li>
	<li>分装样品后，进入第 12 节进行细胞外囊泡（EV）表征；否则，将样品储存于 -80 °C 待后续使用。</li>
</ol>
11. 使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离EVs
<ol>
	<li>使用100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤装置，在+4 °C、3,000 x g条件下离心15分钟，将20 mL尿液或条件培养基浓缩至500 µL。</li>
	<li>将浓缩液转移至尺寸排阻色谱柱（SEC柱，上样范围35 nm）。</li>
	<li>将经20 nm滤膜过滤的PBS加入色谱柱，并收集15个0.5 mL的组分。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用动态光散射（DLS）系统分析各组分。</li>
	<li>合并选定的组分；选择衰减系数低于11且大于40 nm的颗粒占总颗粒数至少30%的组分。</li>
	<li>使用3 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤装置，在+4 °C、14,000 x g条件下离心15分钟，将选定组分浓缩至100 µL。</li>
	<li>分装样品，并进入第12节进行细胞外囊泡（EV）表征；否则，储存于-80 °C备用。</li>
</ol>
12. 细胞外囊泡表征
<ol>
	<li>从冷冻柜中取出待测样品，并在冰块上或 +4 °C 条件下缓慢解冻。</li>
	<li>进行纳米颗粒追踪分析（NTA）以测定颗粒大小分布及数量13。采用高亲和力T细胞膜蛋白4（TIM-4）双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）14，确认样品中外泌体（EV）的存在。</li>
</ol>
13. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
<ol>
	<li>将解冻的EV样本涡旋振荡30秒，离心10秒，然后取1 µL转移至含有999 µL经20 nm滤膜过滤的PBS的2 mL微量离心管中，进行1000倍稀释。另保留1 mL用于稀释的PBS，以检测其中是否含有颗粒物。将所有样品在测量前储存于+4 °C。 
	注意：使用前需将PBS通过0.02 nm滤膜过滤。</li>
	<li>将EV样本或空白对照涡旋振荡30秒，用注射器将其注入检测模块。向模块中加入约0.7 mL样本，并将其放入仪器中。</li>
	<li>按照仪器制造商的操作说明，使用纳米颗粒分析仪对样本进行测量。</li>
</ol>
14. 针对EV标志物的双抗夹心ELISA
<ol>
	<li>配制浓度为 1 µg/mL 的 TIM4-Fc 蛋白溶液。向每个所需孔中加入 100 µL 溶液，于 +4 °C 摇床中以 200 RPM 振荡孵育过夜。</li>
	<li>次日，配制洗涤液（1× TBS + 0.05% Tween20 + 2 mM CaCl2）。</li>
	<li>弃去各孔中的全部液体。向每孔加入 200 µL 洗涤液，在室温下以 200 RPM 振荡 5 分钟后弃去液体。重复此步骤两次。</li>
	<li>配制封闭液（1× TBS + 0.05% Tween20 + 1% 牛血清白蛋白）。向每孔加入 200 µL 封闭液，室温下以 200 RPM 振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。</li>
	<li>在洗涤缓冲液中配制每种样品稀释液各 220 µL（最佳 EV 浓度为 2.7 × 105 EVs/µL）。每孔加入 100 µL 稀释后的样品，设置两个重复孔。室温下以 200 RPM 振荡孵育 90 分钟。</li>
	<li>按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。</li>
	<li>向每孔加入 100 µL 对应的一抗抗体。使用适当的 EV 标记物以确认 EV 及污染物4。室温下以 200 RPM 振荡孵育 2 小时。注意：若使用二抗抗体，则重复步骤 14.7–14.8，但将二抗抗体的孵育时间缩短至 1 小时。</li>
	<li>按步骤 14.3 所述方法洗涤各孔。</li>
	<li>向每孔加入 100 µL 辣根过氧化物酶底物，混匀 1 分钟后，室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>向每孔加入 1 M H2SO4 以终止反应。</li>
	<li>使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。</li>
</ol>

Microfluidic Device for Continuous Extracellular Vesicle Isolation from Human Urine

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<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
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</ol>

A.A.、G.M. 和 R.R. 是 Cellbox Labs, LLC 的创始人、董事会成员及股权持有者

本文介绍的微流控装置为从生物液体中分离和提取细胞外囊泡（EVs）提供了一种颇具前景的方法，解决了现有金标准方法（如超速离心法UC和尺寸排阻色谱法SEC）的一些关键局限性12。已知UC和SEC方法操作繁琐、耗时较长，且产率较低，因此在需要大量EVs的高通量应用中适用性较差21,22。相比之下，所描述的微流控装置能够以极少的人工干预连续处理多达20 mL的生物液体，有望成为工业或临床环境中的变革性工具。该微流控装置的一个关键优势在于，相较于涉及人工操作的传统方法，它能够实现EV分离过程的标准化并提高可重复性。通过大规模生产减少EV分离装置制造过程中的变异性，可更有效地控制装置性能并保持一致性，这对于基于EV的治疗和诊断应用至关重要。此外，该装置可通过适合的基材进行反应注塑成型，兼容大体积制造，进一步增强了其在规模化生产和广泛应用方面的潜力。
为了确保可重复性和稳定的性能，必须制定详尽且明确的实验方案，以规范芯片的制备及其在实验中的使用。该芯片在设计时已考虑工业化生产的可行性。然而，在实验室环境中进行器件制备时，需特别注意避免气泡的产生，确保键合精确且牢固，并在高于实际实验预期的流速下进行充分测试。这一预防措施对于COC-OSTE器件尤为重要，因为若键合不成功，尤其是在较高流速下，器件容易发生泄漏。此外，由于OSTE是一种光敏材料，器件制备过程应在黄光环境下进行，以避免不必要的紫外光暴露。由于该技术仍处于初期发展阶段，研究人员应尝试不同的流速，以确定其特定应用下的最佳参数设置，因为目前尚未建立针对这一新型方法的标准化操作流程，且根据我们的结果，液体黏度会显著影响EV的分离效率。遵循这些指导原则并解决标准化方面的挑战，将有助于充分发挥该微流控器件在各类科研领域和应用中的潜力。
利用微流控装置分离细胞外囊泡（EV）的方法具有高度可调性和可优化性，便于针对性能进行广泛改进和故障排查。为提高颗粒分离效果，研究人员可尝试更长的通道、不同孔隙率和孔密度的膜材料，以及调整通道尺寸。若小颗粒出口处出现大量大颗粒，可尝试提高缓冲液入口流速；而若大颗粒出口中混有较多小颗粒，则建议尝试更长的通道或使用孔径更大的膜。针对颗粒吸附问题，可通过调节流速、表面修饰、调整OSTE材料组分或改变紫外光曝光时间来解决。对于存在不稳定或泄漏问题的装置，降低流速并确保正确粘合是关键步骤。为尽量减少EV的损伤，研究人员可降低流速、在装置灭菌后更彻底地用PBS洗涤，并考虑采用更小孔径的膜或改进模具设计技术与材料。通过上述优化措施，可对微流控装置进行精细调节，充分释放其在EV研究及相关领域中的广泛应用潜力。此外，为优化装置性能，可在上游对样品进行表征，包括密度和黏度测定，以相应调整流动参数。同时，必须特别关注样品本身的性质，因为生物流体本身已被证实不具备无菌性23。&#160;因此，在临床应用中使用前，应对样品进行灭菌处理予以充分考虑。
尽管存在这些挑战，微流控装置在各个研究领域仍具有巨大的潜力。该装置能够从大量高度异质的样本中持续分离细胞外囊泡（EVs），为自动化创造了条件，有助于实现高通量应用，并推动对来自多种来源的EVs进行更深入的分析。将这一微流控模块整合到不同的设备中，例如中空纤维细胞生物反应器 cartridge 或高分辨率流式细胞仪，可使EVs的应用更贴近工业需求，并推动药物递送、诊断学和化妆品等领域的创新4。总体而言，这一微流控装置代表了EVs研究领域的重要进展，为EVs的分离提供了一种高效且标准化的方法，在广泛的科研和工业应用中展现出广阔前景。

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞来源的膜包被颗粒，主要包括两种类型：外泌体（30–200 nm）和微囊泡（200–1000 nm）1。外泌体通过多泡体（MVB）内内涵体膜向内出芽形成，当MVB与细胞膜融合时，将腔内小泡（ILVs）释放到细胞外空间1。相比之下，微囊泡则是通过细胞膜向外出芽并发生断裂而生成2。EVs通过转运蛋白质、核酸、脂质和代谢物，在细胞间通讯中发挥关键作用，反映细胞的生理状态，包括生长、血管生成、转移、增殖以及治疗耐药性3。因此，EVs已成为包括癌症在内的多种疾病的潜在生物标志物和治疗靶点，凸显了其在诊断和药物递送系统中的应用前景4。
为了充分将细胞外囊泡（EVs）应用于疾病诊断和治疗，从各种生物液体中高效分离EVs至关重要5。&#160;常用的方法包括超速离心法（UC）、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、过滤法以及免疫捕获法6。超速离心法是一种广泛应用的技术，但可能共沉淀出与EVs密度相似的非EV颗粒，并可能导致EV聚集7。尺寸排阻色谱法因其可根据颗粒大小而非密度进行分离，从而获得更高纯度的样品，近年来受到广泛关注8。然而，为最大限度减少乳糜微粒和低密度脂蛋白等非目标颗粒的共分离，必须谨慎选择SEC色谱柱的合适孔径，并优化色谱条件8。尽管这两种方法均有效，但它们耗时较长，且难以实现自动化，尤其对于细胞培养上清或尿液等大体积样本，限制了其在工业规模应用中的可扩展性9。
近年来，非对称场流分离技术（A4F）已发展成为一种强大的分离方法，可用于基于粒径和浮力的微米及纳米级颗粒分离10。A4F 的工作原理依赖于一种在其底部带有微孔膜的微流控通道，该结构可产生指向膜方向的力，称为横向流10。当横向流与系统固有的布朗运动和泊肃叶流相结合时，由于不同颗粒在流动动力学中的位置差异，可实现高效的颗粒分离11。尽管该方法具有诸多优势，但其仅适用于微升级别的样品体积12，且需要额外的聚焦步骤，从而延长了整个过程的时间10。
在过去十年中，微流控技术作为一种快速、高效且临床可靠的细胞外囊泡（EV）分离工具，已受到广泛关注13。然而，大多数为EV分离设计的微流控方法均针对小体积、高浓度的EV样本进行优化，或依赖复杂的分离流程14。此外，在微流控领域，聚二甲基硅氧烷（PDMS）因其光学透明性、生物相容性和易于使用而被公认为金标准材料15。尽管如此，PDMS已知会吸附包括EV在内的小型亲脂性分子，这可能对其在EV研究领域的应用造成不利影响13。
环烯烃共聚物（COC）由于具有良好的生物相容性、对分子的低吸附性以及高化学稳定性，是微流控领域中常用的材料15。然而，COC器件的制备通常涉及复杂的工艺或需要专用设备16。相比之下，非化学计量比的硫醇-烯（OSTE）材料是一种有前景的PDMS替代材料，因其对小分子的吸附更低、化学稳定性更优、易于加工，并且可实现规模化生产17,18。然而，由于与管路连接较为复杂，器件可能发生泄漏19。
本研究旨在设计并制备一种结合OSTE与COC材料以及分叉流场流分离（A4F）原理的微流控装置，用于从尿液或细胞培养基等大体积样本中分离细胞外囊泡（EV）。

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m 羧酸盐 FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>储存浓度：3.6 x 1013 个微珠/毫升（依批号而定）</td></tr><tr><td>0.5 mL 微型离心管</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 鲁尔锥形注射器，一次性使用，不带针头</td><td>射线</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &amp;micro;m 多苯乙烯荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>储存浓度：1 × 10¹⁰ 个微珠/毫升（依批号而定）</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL（100k）Amicon Ultra 离心滤器</td><td>默克密理博</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 蛋白质低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>BD PlastikPak</td><td>10569215</td><td></td></tr><tr><td>250 &amp;micro;m ID 聚醚醚酮管</td><td>达尔文微流控</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa 截留分子量离心过滤装置</td><td>默克密理博，</td><td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 医用注射器（无针头）</td><td>安徽宏宇五洲医疗</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 一次性离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti 固定角转子超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>800 &amp;micro;m ID 聚四氟乙烯管</td><td>达尔文微流控</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板，平底，中等结合力</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>ELISA 板</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓度），无血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas 显微镜载玻片平台</td><td>微流控芯片店</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas 显微镜载玻片平台 2 x 16 Mini Luer&amp;nbsp;</td><td>微流控芯片店</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 压力控制器</td><td>Elvesys 集团</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头</td><td>达尔文微流控</td><td>&amp;nbsp;CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Suss MA/BA6 掩模对准器</td><td>SUSS MicroTec 集团</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>马尔文帕纳科</td><td>NS300</td><td>纳米颗粒分析仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光学显微镜 Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 水晶透明</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS片剂，无钙/无镁，Fisher Bioreagents，100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC膜（50 nm孔径，11.8%密度）</td><td>it4ip 股份有限公司，比利时，鲁汶-拉-讷夫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>等离子体灰化仪 GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 nm 柱</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC柱</td></tr><tr><td>QSIL 216 硅胶弹性体试剂盒</td><td>PP&amp;amp;S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>树脂增韧型黑色</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti 摆动转子超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 悬浮培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc 蛋白</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>辣根过氧化物酶底物</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Optima L100XP 超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪 P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用微孔板分光光度计</td><td>Bio-Tek 仪器</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>尿液采集杯，150 mL，无菌</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 注射器滤器</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>马尔文帕纳科</td><td></td><td>动态光散射（DLS）系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用分流式a4f微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

细胞外囊泡（EVs）在多种生物医学应用中具有巨大潜力，包括诊断、药物递送和再生医学。然而，目前分离EVs的方法仍面临诸多挑战，例如操作复杂、耗时较长，且需要大型设备，这些因素限制了其在临床中的转化应用。为克服这些局限性，我们致力于开发一种基于环烯烃共聚物-非化学计量比硫醇-烯（COC-OSTE）的创新性微流控系统，以实现从大体积样本中连续高效地分离EVs。通过利用基于尺寸和浮力的分离原理，本研究所采用的技术相较于现有方法，在尿液和细胞培养基样本中获得了更窄的EV尺寸分布，从而为未来应用中特定尺寸EV亚群的靶向分离提供了可能。我们创新的COC-OSTE微流控芯片设计，结合分支式非对称流场流分离技术，为大体积样本提供了一种简便且连续的EV分离方案。此外，该微流控芯片具备大规模制造的潜力，可实现良好的可扩展性和一致性，使其有望被整合到常规临床诊断和工业流程中，满足高一致性和高通量的关键需求。

我们采用3D打印的双负模（图1），通过软光刻技术（图2A）制备了一种微流控装置，用于基于分支场流分离（bifurcated A4F）原理的高通量EV分离（图2B、C）。该装置需要配备泵和流通池站（图3），以实现EV的自动化分离。首先，为验证该装置的概念可行性，我们制备了直径分别为100 nm和1000 nm的聚苯乙烯微球混合物，分别代表囊泡和细小细胞碎片10。对微球混合物在有无分支流条件下，以不同流速进行了实验，以研究线性流速对分离效率的影响。在所有实验中，小尺寸微球的回收率始终保持稳定且高于90%10，表明该装置在EV回收方面具有良好的潜力。
随后，我们评估并比较了 COC-OSTE 装置从复杂生物流体中无需过多预处理即可分离大量（>1 mL）外泌体（EVs）的潜力。为此，采用来自10名健康供体的尿液（图4）以及两种不同前列腺细胞系的细胞培养上清液（图5）作为样本模板，同时采用三种不同方法平行分离 EVs：超速离心法（UC）、尺寸排阻色谱法（SEC）以及基于 A4F 微流控技术的 OSTE-COC 装置。分离后，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定颗粒总数及其粒径分布。平均而言，与 UC 相比，OSTE-COC 装置从生物流体中回收的总颗粒数更高；但仅当合并两个出口的颗粒数时，差异才具有统计学意义（图4A）。为与其他系统进行性能比较，应将 R 与 L 出口合并考虑。如 图4 所示，L 与 R 出口联合回收 EVs 的性能优于 UC 和 SEC。其中，L 出口设计用于捕获小尺寸 EV 组分，而 R 出口则用于收集较大尺寸 EV 组分及其他尺寸相近的分子。有趣的是，使用 OSTE-COC 装置的 R 出口进行回收的效率略高于单独使用 SEC 或 UC（图4A）。CD63 表达水平也呈现出类似趋势（图4C）。该结果表明，OSTE-COC 装置在总 EV 回收方面更具效率。除 UC 外，不同方法获得的 EV 粒径分布相似，而 UC 的粒径分布更偏向较大颗粒（图4B）。
在细胞培养基培养中也观察到了类似的结果。在两种情况下，与SEC或UC方法相比，该装置两个端口的总颗粒回收率均表现出更优的性能（如图5A、B所示）。值得注意的是，源自PC3细胞的EVs表现出独特的粒径分布特征，与其他实验组相比，L-PORT端口的分布更为均一（图5C、D）。此外，对CD63表达的分析进一步证实了使用COC-OSTE装置可实现更高的EV回收率（如图5E、F所示）。本研究中所比较的不同方法在分离特性方面的总结见表1。
<img alt="微流控装置示意图，包含设计尺寸，用于流体控制和芯片实验室实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：3DP 蛇形双负模具的尺寸与等距视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控器件制备；PDMS，OSTE/COC工艺；分离腔示意图；细胞碎片，EVs。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：COC-OSTE微流控器件。（A）OSTE-COC器件制备主要步骤示意图。（B）器件工作原理。（C）完成器件的图像。比例尺：15 mm。本图经Priedols等10和Bajo-Santos等20许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="带有自动进样器的色谱系统；分析化学实验室实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：装置的实验配置。 注射泵位于左侧，OSTE-COC装置位于中间，回收站位于右侧。该图已获许可修改自 Priedols 等人10 和 Bajo-Santos 等人20。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用条形图和箱形图进行颗粒分析，显示分布、大小和CD63表达水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：采用超速离心法（UC）、尺寸排阻色谱法（SEC）和COC-OSTE装置从10名供体尿液中分离的细胞外囊泡（EV）的粒径分布及颗粒回收率。（A）通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定各分离方法回收的颗粒数量。数据以均值±标准差表示。统计学显著性以 * 表示（p&lt;0.05）。（B）箱形图显示通过NTA评估的所有尿液样本中平均颗粒尺寸分布，须线表示最小值和最大值。P值来源于与UC组的比较，**** 表示高度显著性（p&lt;0.0001）。（C）采用双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）评估各分离方法回收样本中CD63的平均含量，并计算其在所有样本中的中位数与范围。L-port：左端口；R-port：右端口。本图经Bajo-Santos等20许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="颗粒分析图；总数量、大小及CD63表达水平；PC3与LNCaP比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：采用不同方法从PC3和LNCaP细胞中分离的细胞外囊泡（EVs）的表征结果。（A）通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定的从PC3培养基中回收的颗粒数量，以均值±标准差表示。（B）通过NTA测定的从LNCaP细胞培养基中回收的颗粒数量，表示为均值±标准差。（C）通过NTA测定PC3培养物来源EVs的中位颗粒尺寸分布及其范围。（D）从LNCaP培养物中分离的EVs的中位尺寸分布及其范围。（E）采用双夹心酶联免疫吸附测定法（dsELISA）检测每种分离方法获得的PC3细胞系来源EV中CD63表达的中位值及范围。（F）每种分离方法获得的LNCaP来源EV中CD63表达的中位值及范围（通过dsELISA测定）。UC：超速离心；SEC：尺寸排阻色谱；L-port：左端口；R-port：右端口。本图经Bajo-Santos等20许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SEC</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每样本处理时间</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>通量</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每样本成本</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯度</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>自动化程度</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV 得率</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尺寸选择性</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 三种方法（UC、SEC和COC-OSTE装置）分离EVs特性的比较。 UC：超速离心；SEC：尺寸排阻色谱；COC-OSTE：环烯烃共聚物-非化学计量硫醇-烯。+：低；++：中；+++：高。* 取决于装置。

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

细胞外囊泡（EVs）在多种生物医学应用中具有巨大潜力，包括疾病诊断、药物递送和再生医学。

我们看到了细胞外囊泡的潜力，但也认识到其分离的困难，尤其是在从大量生物流体（如生物反应器培养基）中分离时尤为明显。在本研究中，我们测试了是否可以利用非对称场流分离技术来分离细胞外囊泡。目前，尚无法实现从生物流体中直接以连续流动方式分离细胞外囊泡并将其整合到生物反应器中。相反，生物流体必须首先经过采集和处理，这增加了操作的复杂性和工作量。我们的装置专为从大体积生物流体中分离细胞外囊泡而设计，可与生物反应器集成，实现连续流动和自动化操作。我们发现，液体黏度可能影响采用不对称场流分离技术进行细胞外囊泡分离的效果。我们正在探索通过调整生物流体和缓冲液的流速以适应其黏度，是否能够提高分离效率。首先，将一片氧化的环烯烃共聚物（COC）载玻片放置在聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具上，用于装置的上层通道。然后将该组件放入原位模具夹具中。然后使用扭矩扳手将夹具拧紧至 0.3 牛·米。将聚四氟乙烯管连接至模具的进样口。通过压力系统中的皮索电动泵，向装置内施加并维持 1,000 毫巴的压力。将带有玻璃片的夹具放入掩模对准仪中，使用ND33滤光片照射，剂量为850毫焦。然后将结构化的OSTE与孔密度为11.8%的膜接触，确保通道完全被膜覆盖。在膜上方放置一片干净的玻璃片。从顶部施加 1.6 千帕的压力，以确保均匀粘合。然后将组件膜面朝上放置于 60 摄氏度的加热板上。接着，将 OSTE 层结构与顶部通道组件对齐。确保顶层和底层对齐，且 OSTE 底层与膜接触。使用显微镜直观评估装置是否存在任何缺陷。完成后，用过氧化氢填充两支 5 毫升注射器，每支 2 毫升。将注射器安装到注射泵上。接着，使用注射器针头将14厘米长的PTFE管连接到注射器上。使用鲁尔接头将管路连接至装置的入口。将20厘米长的PEEK管连接至设备的出口，再将PEEK管的另一端连接至废液容器。在仪器屏幕上，按下“设置”，然后选择“系统设置”，接着选择“注射器”。然后点击返回按钮，选择参数并输入500微升/分钟的流速。将流出液收集到废液容器中。接着，用两个新的5毫升注射器各吸取2毫升乙醇。将使用过的注射器更换为装有乙醇的注射器，然后启动泵。同样，用五毫升经20纳米滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）填充注射器。将其连接至泵，并用四毫升PBS溶液冲洗装置。将管路从设备上拔下，并用堵头封闭进液口和出液口。次日，用四毫升过滤后的 PBS 缓冲液冲洗充满 PBS 的设备。将两个出口流出的最后1毫升流穿液收集到一个2毫升的低吸附蛋白管中，在4摄氏度下保存，作为设备引入颗粒的空白对照。将装有PBS的注射器更换为充满空气的注射器。然后用四毫升空气冲洗装置，直至所有液体从装置和管路中排出。检测尿液样本时，首先用无菌容器收集每位供体的晨尿100毫升。将每份样本分装至两个50毫升的离心管中。将离心管在室温下以 2,000 G 离心 15 分钟，然后收集上清液。再将上清液在室温下以 10,000 G 离心 30 分钟，以去除任何颗粒物。将上清液收集到新的离心管中。用制备好的尿液样本填充一支20毫升的注射器，然后将其连接至设备的样本入口。接下来，用另一个20毫升注射器吸取20毫升过滤后的DEPC处理PBS，并将其连接到装置的缓冲液入口。将流出液分别转移至100,000分子量截留浓度的浓缩管中，离心浓缩至每管100微升。然后将浓缩液转移至0.5毫升微量离心管中。将浓缩物涡旋振荡30秒，然后在离心机中离心10秒。取每个样品25 µL转移至新标记的离心管中。于-80 °C下冷冻保存，用于长期储存。与超速离心法相比，OSTE COC 装置在生物流体中的总颗粒回收率更高。使用 OSTE COC 装置的 R 端口进行回收时，其回收率略高于尺寸排阻色谱法和单独的超速离心法。除超速离心法显示出更大的颗粒尺寸分布外，其他不同方法之间的颗粒尺寸分布基本一致。从两个设备端口的总颗粒回收率表现出更优的性能。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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