Name: 使用 离体 实时成像研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂和运动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习使用双光子显微镜对小鼠门齿进行离体实时成像技术，追踪牙上皮细胞的动态分裂与运动。该方法为研究牙齿组织更新与干细胞行为提供了重要的活体观察手段。

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我们感谢加州纳米系统研究所的加州大学洛杉矶分校先进光学显微镜/光谱学实验室和徕卡显微系统卓越中心（RRID:SCR_022789）提供双光子显微镜技术支持。AS 由以色列科学基金会（ISF）资助（项目编号 604-21）。JH 由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）资助（项目编号 R03DE030205 和 R01DE030471）。AS 和 JH 还获得了美国-以色列双边科学基金会（BSF）资助（项目编号 2021007）。

所有小鼠均饲养于加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）或耶路撒冷希伯来大学（HUJI）的无病原体动物设施中。涉及小鼠的所有实验均依照各机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的规定和方案进行（UCLA：ARC-2019-013；HUJI：MD-23-17184-3）。实验步骤的总体工作流程见图2A。有关本方案中使用的所有仪器、试剂和材料的详细信息，请参见材料表。
1. 溶液与凝胶的制备
<ol>
	<li>解剖培养基：使用含0.5%葡萄糖的DMEM/F12新鲜配制，并在37 °C保温，待步骤2.4中使用。 
	注意：我们使用不含酚红的DMEM/F12，以减少活体成像过程中的自发荧光。</li>
	<li>1x 培养基：使用50% DMEM/F12、50% 大鼠血清、1x 谷氨酰胺替代物、1x MEM必需氨基酸、1% 葡萄糖、0.1 mg/mL L-抗坏血酸和0.5% 青霉素-链霉素新鲜配制培养基。在37 °C保温，待步骤5.5中使用。该培养基用于活体成像过程中门齿外植体的培养。 
	注意：大鼠血清应为高质量产品，由研究人员专门制备或购自商业来源，用于全组织培养。特别需要注意的是，血液必须在凝血开始前进行离心（室温下1,200 × g 离心5分钟）。离心后应挤压并弃去形成的纤维蛋白凝块33。</li>
	<li>培养凝胶：凝胶的作用是在成像过程中固定样本，需新鲜配制。
	<ol>
		<li>通过微波将200 mg低熔点琼脂糖溶解于10 mL DMEM/F12中，配制成2%凝胶。将2%凝胶保持在37 °C。</li>
		<li>通过混合50%大鼠血清、1x 谷氨酰胺替代物、1x MEM必需氨基酸、1% 葡萄糖、0.1 mg/mL L-抗坏血酸和0.5% 青霉素-链霉素，配制不含DMEM/F12的2x培养基。将该2x培养基（不含DMEM/F12）预热至37 °C。</li>
		<li>将等体积的2%凝胶与2x培养基（不含DMEM/F12）混合，配制成1%培养凝胶。将1%培养凝胶在37 °C保温，待步骤5.1中使用。 
		注意：混合前确保所有溶液均已预热，以避免提前凝固。我们发现1%凝胶适用于成年小鼠门齿的培养。若培养其他组织，凝胶浓度应通过实验确定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 成年小鼠下颌骨的提取
<ol>
	<li>按照IACUC批准的标准操作程序，在所需年龄处死小鼠。 
	注意：此处我们采用CO2&#160;窒息法，随后进行颈椎脱位。不同地区对动物安乐死的规定可能有所不同。研究人员在开展实验前应获得必要的机构批准，并确保遵守当地的动物护理法规。</li>
	<li>使用70%乙醇对小鼠进行消毒。</li>
	<li>将小鼠断头，并取出左右下颌骨。
	<ol>
		<li>将小鼠腹部朝下放置，使用#9单刃工业剃刀片在颈部区域切割，将头部与身体其余部分分离。 
		注意：如果还需采集咽部或颈部组织，则不应进行断头操作，可直接进入步骤2.3.2。</li>
		<li>将小鼠翻转，使其腹侧朝上，以便于接触下颌骨。</li>
		<li>用拇指和食指轻轻夹住动物头部，固定其位置。</li>
		<li>使用剃刀片沿下颌中线做矢状切口，从下唇开始沿皮肤切至颈部轮廓线。 
		注意：也可使用#15外科刀片进行切口及后续解剖操作（步骤2.3.6–2.3.9）。</li>
		<li>切开过程中，用拇指和食指将切开的皮肤向两侧拨开，暴露下方的肌肉和下颌骨。</li>
		<li>使用剃刀片切断下颌骨颊侧的咬肌，使左右半下颌骨外侧完全脱离肌肉附着。</li>
		<li>沿下颌骨内侧切断颏舌骨肌，以去除该区域的肌肉附着。</li>
		<li>在连接两个半下颌骨的下颌联合处再做一切口。切断后，下颌骨即分为左右两半。</li>
		<li>将剃刀片插入下颌头与颞下颌关节之间，小心地将半下颌骨从头部其余部分分离出来。 
		注意：我们发现，在切割时同时轻轻牵拉门齿有助于操作。需注意避免折断下颌骨，并防止损伤内部软组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即将解剖得到的下颌骨转移至含有预热解剖液（步骤1.1）的培养皿中，并使用#15外科刀片去除残留的肌肉组织。 
	注意：将样本保存在低温液体中会减缓细胞活性，可能导致活体成像过程中某些细胞活动（如增殖或细胞运动）延迟甚至无法恢复。</li>
</ol>
3. 小鼠完整门齿的分离
注意：门齿的进一步分离需在明亮视野解剖显微镜下进行。
<ol>
	<li>目视识别下颌骨上覆盖门齿齿槽并容纳门齿顶端部分的椭圆形区域。</li>
	<li>将下颌骨放置成内侧（舌侧）表面朝上。</li>
	<li>用锯齿镊固定下颌骨，使用#15手术刀片从髁突向磨牙方向削除椭圆形区域上方的覆层膜性骨，从而形成一个窗口，暴露内侧表面的门齿顶端软组织。</li>
	<li>翻转下颌骨，使其外侧（颊侧）表面朝上。</li>
	<li>按照步骤3.3所述方法，在下颌骨外侧的椭圆形区域开窗&#160;，并用手术刀尖清除边缘残留的骨碎片。确保牙齿的顶端部分从内外两侧均可见。 
	注意：削骨时避免过度施压，以防损伤下方软组织。</li>
	<li>系统性地切除门齿周围骨组织，以完整分离整个门齿。
	<ol>
		<li>在紧邻门齿顶端的平面进行整齐切割，首先去除髁突。 
		注意：注意不要切入门齿内部。</li>
		<li>在第三磨牙后方但门齿背侧进行第二次切割，避免损伤牙齿，从而去除包含冠突的骨组织。</li>
		<li>从角突尖端开始，朝门齿方向逐段切割，逐步分步去除下颌骨腹侧部分。 
		注意：牙上皮及相关的牙周组织常与骨组织粘连紧密，若一次性切除大块腹侧骨组织，易导致软组织撕脱。为分离骨组织与门齿软组织，可在门齿顶端处将手术刀（或一对锋利无齿镊）插入两种组织之间，轻柔地向前滑动器械。</li>
		<li>切除附着磨牙的齿槽骨及仍与门齿相连的任何残留骨组织。</li>
		<li>此时门齿已完全分离。将完整解剖出的门齿转移至盛有清洁温热解剖液的培养皿中（步骤1.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要重复步骤3.2–3.6&#160;，以分离更多门齿。 
	注意：小鼠的上颌（上）门齿同样含有成体干细胞，可用于牙齿再生研究34。牙科研究人员通常更关注下门齿，因其更易接近且较上颌门齿更易于解剖。下颌与上颌门齿前体细胞之间的差异仍有待明确。</li>
</ol>
4.&#160;去除牙周组织以暴露切牙上皮颈环
<ol>
	<li>将整个切牙侧卧于其舌侧面，用锯齿状镊子固定牙齿位置，再使用5号精细镊子开始轻轻拨动覆盖在切牙根尖部及颈环区域的牙周组织。</li>
	<li>小心剥离根尖芽周围的牙周组织，使颈环的侧面（或其他感兴趣区域）在显微镜下清晰可见。 
	注意：操作时应避免损伤牙上皮或使其与间充质分离。若切牙在目标区域具有荧光信号，且具备荧光解剖显微镜，可利用荧光信号辅助区分不同组织类型并指导解剖操作。应高效完成第2至第4步，以便样本能迅速转移至培养基中，并通过组织块培养法进行适当维持（见下文）。</li>
</ol>
5. 外植体培养的组织包埋
<ol>
	<li>向24孔板的一个孔中加入500 µL温热且未凝固的培养凝胶，并迅速将分离的完整门齿转移至该孔中。轻轻晃动孔板数次，以冲洗门齿。</li>
	<li>向培养皿中加入400 µL温热且未凝固的培养凝胶，并将冲洗后的门齿转移至培养皿中。 
	注意：我们使用一种 commercially available 的培养皿，该培养皿与灌流装置兼容。替代方案详见步骤6.4。</li>
	<li>调整门齿方向，使颈环区域（或其他感兴趣区域）位于培养皿中央（图2A、B），并调节门齿顶端的倾斜角度，以获得所需的成像平面。 
	注意：应在凝胶完全凝固前迅速完成组织定位。</li>
	<li>待凝胶凝固后，使用精细镊子去除覆盖在感兴趣区域上方的凝胶，确保该区域不被凝胶覆盖。</li>
	<li>沿培养皿边缘缓慢加入足量的温热培养基，使其刚好覆盖样品（约150 µL）。</li>
	<li>将组织块培养物转移至37 °C细胞培养孵育箱中，静置1小时，使组织沉降并适应培养条件。</li>
</ol>
6. 切牙外植体的延时显微成像
注意：本实验中，我们使用了一台配备25倍水浸物镜的直立显微镜，该物镜的数值孔径为1.0。通常情况下，高数值孔径的水浸镜头最适合深层组织成像。
<ol>
	<li>打开显微镜和双光子激光器。</li>
	<li>将培养皿固定在载物台适配器上，并将灌流适配环安装在上方（图2C）。</li>
	<li>将载物台适配器连接至温度控制器，并设定为维持培养环境在 37 °C。</li>
	<li>将适配环的进液口和出液口连接至微灌流泵，并开始灌流培养基，将泵的灌流速度设置为 20。这将在样品表面产生缓慢的培养基流动（约 5 mL/h）（图2C）。 
	注意：有关维持组织处于稳定可控环境的系统详情，请参见材料表。也可使用其他系统。例如，结合使用 37 °C 加热板和自制的灌流培养皿（补充图S1），该培养皿带有连接至注射泵的进液口和出液口，亦可达到相同效果。</li>
	<li>将大气控制屏障环（ACBR）放置在适配环上方，并降低物镜穿过ACBR，直至与培养基液面接触（图2D）。</li>
	<li>将激光波长调节至 920 nm，以同时观察 GFP 和红色荧光（如 tdTomato）信号。</li>
	<li>通过目镜定位样品，然后在显微镜软件中进行确认。</li>
	<li>使用软件设置Z轴层扫、多点成像及时间间隔。按照本方案操作时，建议使用 4 μm 的 Z轴步进大小 和 5 min 的 时间间隔，持续成像 14 h。 
	注意：我们发现，若时间间隔超过 5 min，通常不足以捕捉到平滑的细胞运动和分裂过程。</li>
	<li>启动延时成像。 
	注意：样品位置可能在第一个小时内发生偏移，可能需要进一步调整。</li>
	<li>保存文件以用于后续数据处理和分析。</li>
</ol>

Live Tracking of Dental Cells via Two-Photon Microscopy

作者声明无利益冲突。

活体组织成像是一种重要技术，可使我们在细胞处于其微环境时研究其动态过程和行为41理想情况下，应进行活体成像 体内 具有高时空分辨率。然而， 体内 由于组织难以接近、光学不透明以及难以长时间固定动物或器官，对哺乳动物器官进行成像可能具有挑战性42组织外植体可规避其中部分挑战，已被成功应用于多项研究中，用于追踪细胞行为，例如在牙齿形态发生及外胚层器官发育过程中。26在此，我们展示了一种相对简单且稳健的方案，用于对培养的成年小鼠完整门齿进行活体深层组织成像。该技术的应用将有助于我们理解牙齿再生过程中细胞运动、命运决定及组织构建的调控机制。
由于细胞分裂是易于观察的事件，且是再生组织的特征性表现，本研究聚焦于追踪分裂中的细胞，以展示该实验方案的一种应用。我们发现门齿上皮前体细胞可进行垂直分裂和水平分裂，因此与其他上皮组织相似43。阐明调控分裂角度的机制，并探究分裂方...

在过去的二十年中，小鼠门齿已成为研究成体干细胞调控和牙齿再生原理的宝贵平台1,2。小鼠门齿能够终生持续生长并自我更新，其机制依赖于维持上皮和间充质干细胞的存在，这些干细胞具有自我更新能力，并可分化为牙齿中的多种细胞类型1,2。牙源性上皮干细胞分化为成釉细胞，分泌釉质基质；而牙源性间充质干细胞则分化为成牙本质细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞，分别形成牙本质、牙骨质和牙周韧带3,4,5,6。这种持续的新细胞供应维持了组织稳态，并可替换因咀嚼磨损或损伤而丢失的老旧细胞7,8。因此，阐明调控牙源性干细胞维持与分化的细胞和分子机制，对于理解日益受到关注的牙齿再生领域至关重要。
从解剖学上看，成年小鼠门齿的大部分被包裹在颌骨内。虽然牙齿的切缘部分暴露在外，但门齿的尖端嵌入牙槽中，并通过牙周韧带和结缔组织牢固地附着于周围骨组织（图1A，B）。门齿的尖端同时也是牙齿的生长区域，在此区域的上皮层和间充质牙髓中均维持着牙源性干细胞及其前体细胞9,10,11,12,13。具体而言，牙源性上皮干细胞位于上皮组织末端膨大的部分，即所谓的尖端芽体，也称为唇侧颈环（图1C）。与肠道上皮和表皮类似，门齿上皮的更新主要依赖于活跃增殖的干细胞及其高度增殖的中间后代细胞，即过渡性扩增细胞14,15,16,17，这些细胞均位于颈环的内侧部分。然而，目前尚不清楚门齿上皮是否含有静息状态的干细胞，并在再生过程中加以利用。相比之下，在尖端牙髓中已鉴定出活跃型和静息型两种牙源性间充质干细胞，其中静息型干细胞作为储备细胞群，在组织损伤修复过程中被激活13,18。
小鼠门齿再生与更新生物学的许多发现源于组织学研究，这些研究在不同时间点获取样本，经固定、处理后，沿特定平面切成微米级薄片。通过对可实现谱系示踪或基因扰动的不同小鼠模型进行组织切片的详细分析，科学家已鉴定出各类前体细胞群体的细胞谱系，以及调控门齿稳态和损伤修复的遗传与信号通路19,20,21。然而，组织切片中非活性细胞的静态二维（2D）图像无法完整呈现活体组织中细胞行为和空间结构的全貌，例如细胞形态变化、迁移运动及细胞动力学过程。检测并量化这些在组织切片时间尺度上难以分辨的快速细胞变化，需要采用不同的策略。此外，获取此类信息对于理解牙源性细胞之间如何相互作用、响应不同信号刺激，以及如何自我组织以维持组织结构与功能也至关重要。
双光子显微镜实现的四维（4D）深层组织成像的进展22一种将三维空间信息与时间分辨率相结合的技术，通过实现对培养的组织外植体、类器官甚至组织的时空动态观察，克服了传统组织学分析的固有局限性 原位23,24,25,26例如，对发育中牙上皮进行的4D活体成像揭示了细胞分裂与迁移的时空模式，这些模式协调了组织生长、信号中心形成以及牙上皮形态发生过程27,28,29,30,31,32在成年小鼠门齿中，4D成像技术近期已被应用于研究牙上皮损伤修复过程中的细胞行为。活体成像显示，基底层上方的中间层细胞可直接转化为基底层中的成釉细胞，以再生受损的上皮组织，这一发现挑战了传统的上皮损伤修复模式15.
本文介绍了成年小鼠门齿的分离、培养和成像方法，重点关注唇侧颈环中的上皮细胞（图1）。该技术可维持牙源性细胞活力超过12小时，并允许在单细胞分辨率下对荧光标记的细胞进行活体示踪。该方法可用于在正常培养条件下，或在遗传、物理和化学干扰条件下，研究细胞运动与迁移行为，以及细胞形态和分裂方向的动态变化。

<table><tbody><tr><td>24 孔平底组织培养板</td><td>Olympus plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>25倍 HC IRAPO motCORR 水浸物镜</td><td>Leica</td><td>11507704</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸（维生素 C）</td><td>Acros Organics</td><td>352685000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖 bioxtra&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Delta T 系统&amp;nbsp;</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4</td><td>包含温度控制、培养皿和灌流装置</td></tr><tr><td>解剖显微镜 - LEICA S9E</td><td>Leica</td><td>LED300 SLI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11039047</td><td>不含酚红的基础培养基</td></tr><tr><td>Feather 外科刀片（#15）</td><td>Feather</td><td>72044-15</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>F.S.T</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>谷氨酰胺替代物</td></tr><tr><td>配备 25倍 HC IRAPO motCORR 水浸物镜的 Leica SP8-DIVE 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>NuSieve</td><td>50080</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100倍浓缩液）</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Gen Clone</td><td>32-107G</td><td>90 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大鼠血清</td><td>Valley Biomedical</td><td>AS3061SC</td><td>适用于活体成像处理</td></tr><tr><td>剃刀刀片 #9</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>F.S.T</td><td>37133</td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>F.S.T</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

不断生长的小鼠门齿正成为研究成年上皮和间充质干细胞调控机制及牙齿再生的一个高度可操作的模型系统。这些祖细胞群体能够活跃地分裂、迁移并分化，以响应性地维持组织稳态并再生丢失的细胞。然而，传统的基于固定组织切片的分析方法无法捕捉细胞运动与相互作用的动态过程，限制了我们对这些调控机制的研究。本文介绍了一种将完整小鼠门齿维持在离体培养系统中的方案，并利用多光子延时显微成像技术对牙源性上皮细胞进行活体示踪。该技术丰富了牙科研究现有的技术工具箱，使研究人员能够在活体组织中获取有关细胞行为与组织结构的时空信息。我们预期该方法将有助于科研人员进一步探索牙齿更新与再生过程中动态细胞活动的调控机制。

成年小鼠门齿的顶端区域被下颌骨包裹（图1），因此无法直接观察和活体追踪位于生长区域内的前体细胞。为此，我们建立了一种方法，可将整个门齿从颌骨中完整取出，并在组织外植体培养系统中进行双光子延时显微成像（图2）。本文描述了代表性实验结果，记录了牙上皮唇侧颈环区域中细胞增殖与迁移的动态过程。
为了展示实验步骤，我们使用了两种不同的小鼠模型，其牙源性上皮表达绿色荧光。第一种小鼠品系为 K14Cre;R26rtTA;tetO-H2B-GFP，其中 K14Cre（MGI:2680713）在角蛋白14（Keratin 14）启动子驱动下表达Cre重组酶35，从而在上皮组织中激活来自 R26rtTA 等位基因36（MGI:3584524）的反向四...

离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。

不断生长的小鼠门齿正成为研究成年上皮和间充质调控机制的一个高度可操作的模型系统……

为了在器官更新过程中维持正确的细胞结构，组织中的细胞会以特定的方向和模式进行移动和分裂。因此，理解这些动态细胞事件的调控机制至关重要。小鼠门齿是成体干细胞研究的一个新兴模型，该系统拥有多种遗传工具，可用于研究基因功能，并对细胞进行标记以实现谱系示踪。迄今为止，大多数研究使用的是在特定时间点采集并固定的成年牙齿样本，这限制了我们对活细胞行为的观察。在本实验方案中，我们描述了一种追踪成年小鼠门齿中细胞生活状态的方法，该技术将有助于未来研究动态细胞行为如何参与牙组织的更新与修复。首先，将已实施安乐死的小鼠翻转，使其腹侧朝上，以便于暴露下颌骨。用拇指和食指轻轻固定小鼠的头部。从下唇开始，沿中线向颈部方向使用剃须刀片在下颌皮肤上做一矢状切口。切开过程中，用拇指和食指撑开切口处的皮肤，暴露下方的肌肉和下颌骨。接着，在下颌骨的颊侧切断咬肌。沿下颌骨内侧切断下颌舌骨肌，并去除肌肉附着。在下颌联合处做另一切口，连接两侧半下颌骨，将其分离为左侧和右侧两部分。将剃须刀片插入下颌髁突与颞下颌关节之间，仔细分离半下颌骨与头部其余部分。立即将分离出的下颌骨转移至含有预热解剖液的培养皿中。随后，在明场解剖显微镜下，使用15号外科刀片去除肌肉组织。确定下颌骨上覆盖门齿齿槽并容纳门齿顶端部分的卵圆形区域。将下颌骨摆放至内侧或舌侧表面朝上的位置。用有齿镊夹持下颌骨，同时使用15号外科刀片，从髁突向磨牙方向刮除覆盖的膜性骨，从而在卵圆形区域形成一个窗口。这将暴露内侧表面切牙根尖处的软组织。接下来，翻转下颌骨，使外侧或颊侧表面朝上。参照下颌骨内侧的操作方法，在下颌骨外侧的椭圆形区域制作一个窗口。使用镊子清除边缘残留的骨碎片，确保牙齿的根尖端从两侧均可见。为分离整个牙齿，在紧邻根尖门齿的平面进行整齐切割，以去除髁突。然后在第三磨牙后方但门齿背侧的位置进行第二次切割，注意不要损伤牙齿，以去除冠突。从下颌角突尖端开始，依次向切牙方向进行连续切割，逐步去除下颌骨腹侧部分。接着，切除附着磨牙的齿槽骨以及任何仍与切牙相连的残留骨骼。将完全分离的切牙转移至含有预温解剖液的培养皿中。打开荧光显微镜，利用组织的荧光信号引导去除牙周组织。将内侧切牙置于其舌侧，用有齿镊子固定牙齿位置。然后使用一对5号精细镊子，开始剥离覆盖在切牙根尖部及颈环区域的牙周组织。小心地剥离牙周组织，使颈环的侧面可见。首先，在24孔板的一个孔中加入500 µL温热的培养凝胶。迅速将从小鼠分离出的完整切牙转移至该孔中。轻轻晃动培养皿数次以冲洗切牙。向培养皿中加入 400 µL 温热的培养凝胶，并将冲洗后的切牙转移至培养皿中。调整切牙的方向，使颈环区域位于培养皿中央，并调整切牙顶端的倾斜角度，以获得所需的成像平面。凝胶凝固后，使用一对精细镊子去除目的区域上方的凝胶。沿培养皿边缘加入约 150 微升温热的培养基，以覆盖样本。将组织块培养物置于 37 摄氏度环境中，使组织沉降。一小时后，打开显微镜和双光子激光器。将培养皿固定在载物台适配器上，并将灌流适配环置于其上。将载物台适配器连接至温度控制器，以维持培养环境为 37 摄氏度。将适配环的入口和出口连接至微灌流泵。设置灌流速度为20，并启动培养基对样品的灌流。将ACBR置于适配环上方，并升高载物台，使物镜穿过ACBR与培养基接触。将激光波长调至920纳米以观察GFP。通过目镜定位样品后，使用显微镜软件进行观察，然后设置Z轴步长为4 µm，时间间隔为5分钟，持续14小时。启动延时成像，并保存后续的样品管以用于下游数据分析。在对 k14-Cre、R26-rtTA、tetO-H2B-GFP 颈环进行延时显微成像时，H2B-GFP 信号主要出现在颈环的过渡扩增区域，表明存在活跃的细胞分裂。此外，观察到有丝分裂细胞中染色体在中期板上的凝集与排列，随后在后期分离并进入两个子细胞。大多数细胞分裂方向垂直于基底膜或与其呈斜角，平行于基底膜的水平分裂较少见。在K14-Cre、R26-mT/mG颈环中，所有上皮细胞膜均被标记为绿色，细胞分裂事件同样明显。通过细胞变圆及随后的胞质分裂可识别有丝分裂细胞。在K14-Cre、R26-mT/mG颈环中，还观察到水平和垂直方向的细胞分裂。

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发育生物学

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离体 培养咽弓以研究心脏与肌肉前体细胞及其微环境

的 离体 直立液滴培养是现有方法的一种替代方案 体外 和 体内 实验技术。该方案易于操作，所需试剂用量较少，同时能够操控并研究胎儿的血管形成、形态发生和器官发生。...

使用 离体 直立式液滴培养法培养小鼠胎儿完整器官以研究器官发生过程中的发育机制

本实验方案旨在描述一种功能缺失和功能获得的方法，可用于鉴定新生素（neogenin）作为植入前小鼠胚胎中滋养外胚层和内细胞团分化的阶段特异性受体。...

利用功能缺失与功能获得方法研究小鼠着床前胚胎早期细胞命运决定因子

结合细胞移植、细胞骨架标记以及基因功能缺失/获得实验方法，本实验方案描述了如何利用迁移中的斑马鱼前脊索板前体细胞来分析候选基因的功能 体内 细胞迁移...

分析 体内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

学习使用双光子显微镜对小鼠门齿进行离体实时成像技术，追踪牙上皮细胞的动态分裂与运动。该方法为研究牙齿组织更新与干细胞行为提供了重要的活体观察手段。

使用离体活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

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使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

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