一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

本研究旨在解决外泌体研究中的一个关键且尚未满足的需求，即开发一种可大规模、可重复生产的外泌体模拟物制备方法。由于天然细胞外囊泡（EVs）产量较低，研究人员已采用尺寸排阻和基于离心的过滤等方法制备外泌体模拟物（EMs）作为替代。目前，大多数外泌体模拟物是通过全细胞直接挤出获得，虽具有类似的生物学功能，但不可避免地受到细胞碎片和细胞器的污染。

细胞外囊泡在生物医学研究中备受关注，尤其在疾病治疗领域。然而，传统的细胞外囊泡分离技术（如超速离心法、排阻色谱法和亲和层析法）存在产量低、重复性差、质量不稳定等问题，且需要昂贵且依赖专业人员操作的生产设备，难以满足临床对细胞外囊泡的需求。本研究提供了一种简单且低成本的方法，用于放大生产外泌体模拟物。

我们利用了一项独特的生物学发现，即磁性纳米颗粒只能被细胞内的内体所吸收，而不会进入其他细胞器。因此，我们可以将内体转化为均一的纳米囊泡。该方法可有效提高外泌体的产量并降低成本。

首先，在六孔板中使用含有10%胎牛血清（FBS）和5%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基培养细胞。将培养物置于37°C、5%二氧化碳环境中过夜孵育。次日，用10纳米浓度的聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs）与细胞共培养。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育12小时。孵育结束后，每孔加入0.5毫升胰蛋白酶，消化3分钟。然后，每孔加入1毫升完全培养基以终止消化。

将细胞悬液在1,000 G离心五分钟，弃去上清液，然后用PBS重悬沉淀。随后，将沉淀重悬于8毫升新鲜配制的低渗溶液中，孵育15分钟。将细胞悬液转移至玻璃试管中，使用玻璃匀浆器以1,000 RPM进行20次破碎，以释放细胞器。

匀浆后，取一毫升细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。将试管置于磁分离器中一小时，以完全分离载有IONP的内体与其他细胞器及细胞碎片。收集内体时，弃去管中液体，并加入三毫升PBS重悬内体。

然后，使用移液枪吹打，重悬位于磁力架旁离心管接触面上的棕色沉淀。进行高速匀浆时，将内体溶液转移至15毫升离心管中。将冰盒置于管子下方，然后将管子放在高速匀浆器上。

将10毫升探头放入试管中，注意不要触碰到管底。在匀浆机屏幕上，将速度调节至140 G，时间设置为五分钟。按下确认按钮，然后按下启动按钮。

高速匀浆后，将纳米囊泡悬液转移至1.5毫升离心管中，并将离心管置于磁性分离器中静置1小时。最后，在不扰动磁架附近表面的情况下，收集含有目标外泌体模拟物（EMs）的液体。通过NTA和TEM分析BMSC-EMs的形态，结果显示其具有典型的碗状、囊泡样结构，由脂质双分子层包被。

BMSC-EMs 和 293T-EMs 的流体动力学直径与天然 EVs 相似。Western 印迹结果表明，BMSC-EMs 含有与 EVs 相同的蛋白生物标志物，且几乎无质膜污染。EMs 的得率显著高于通过超速离心法制备的天然 EVs。

EMs 的蛋白质组成与天然 EVs 相似。