Name: 一种用于大规模生产内体衍生囊泡的磁分离辅助高速均质化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 学习磁分离辅助高速均质化方法用于大规模生产内体衍生囊泡。该技术可提高外泌体模拟物产量并降低成本，为细胞外囊泡研究和生物医学应用提供可扩展的解决方案。

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作者感谢中国科学院基础医学与癌症研究所（IBMC）共享仪器核心设施提供的仪器支持。本研究得到国家自然科学基金委员会（NSFC；82172598）、中国浙江省自然科学基金（LZ22H310001）、中国浙江省卫生健康委员会551卫生人才培养项目、杭州市科学技术局农业与社会发展研究项目（2022ZDSJ0474）以及钱塘交叉学科研究基金的资助。

注意：该方法的示意图见图1。
1. 透射电镜样品制备与分离
<ol>
	<li>磁性纳米颗粒的细胞内化
	<ol>
		<li>细胞培养
		<ol>
			<li>重悬 1 × 106 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）、293T细胞或小鼠卵巢上皮癌细胞（ID8），置于含10%胎牛血清（FBS）和5%青霉素-链霉素溶液（P/S）的DMEM完全培养基中，每六孔板加入2 mL（参见 材料表).</li>
			<li>在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞过夜2. 
			注意：贴壁后细胞数量约为 1 × 106.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磁性纳米颗粒的内吞作用
		<ol>
			<li>将每个六孔板中的培养基体积减少至1 mL。用10 nm聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs）与细胞共培养（参见 材料表) 浓度为 100 µg/1 × 106 细胞并在含5% CO₂的环境中37 °C孵育2 孵育12小时，以使细胞充分内吞IONPs。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内体的分离与匀浆化
	<ol>
		<li>细胞低渗处理
		<ol>
			<li>用0.5 mL/孔胰蛋白酶消化已完全内吞IONPs的细胞，持续3分钟，然后加入1 mL/孔完全培养基终止消化。</li>
			<li>在 1000 x 离心 g 5 分钟后弃去上清液。将细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，反复离心洗涤两次，以去除残留的培养基和未吸收的IONPs。</li>
			<li>最后，将沉淀重悬于8 mL预配制的低渗溶液（71.4 mM氯化钾，1.3 mM柠檬酸钠，pH 7.2–7.4）中，孵育15分钟（参见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>低速匀浆释放细胞器
		<ol>
			<li>将细胞悬液转移至含有低渗溶液的玻璃试管中，并使用玻璃匀浆器释放细胞器（参见 材料表以每分钟1000转进行20次震荡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磁分离法获取内体
		<ol>
			<li>将1 mL匀浆后的细胞溶液转移至1.5 mL微量离心管中，置于磁分离器中1 h，以充分分离载有IONP的内体与其他细胞器（如细胞核和线粒体）及细胞碎片。</li>
			<li>收集位于磁力架旁微量离心管接触面上的棕色沉淀物（参见 材料表），即载有IONP的内体。弃去微量离心管中的液体，加入3 mL PBS重悬内体。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高速均质化
	<ol>
		<li>将含有内体的溶液转移至15 mL离心管中，液体体积控制在3–10 mL之间。</li>
		<li>延长高速匀浆器的10 mm探头（参见 材料表)至离心管底部，但不要接触管底。调整 速度 屏幕下方的按钮，将速度设置为 140 x 克， 并调整 时间 按钮，设置时间为5分钟，然后按下 好的 按钮。</li>
		<li>按压 开始 将样品置于冰盒上后，按下按钮进行匀浆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性分选用于EMs
	<ol>
		<li>将通过高速均质化获得的含有纳米囊泡的溶液转移至1.5 mL微量离心管中，置于磁分离器中静置1 h。</li>
		<li>收集含有目标EMs的液体。注意不要触碰磁力架附近管壁表面，该表面吸附了游离的IONPs及载有IONPs的EMs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 透射电镜表征（图 2 和 图 3）
<ol>
	<li>动态光散射（DLS）分析
	<ol>
		<li>沿比色皿壁加入1 mL EMs样品（20 µg/mL），并将其放入DLS仪器的样品槽中（参见材料表）。</li>
		<li>打开DLS软件，选择粒径测试，开始检测。</li>
		<li>使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒追踪分析（NTA）
	<ol>
		<li>用PBS将EMs稀释至1 × 107-1 × 108 个颗粒/mL的溶液，并使用1 mL注射器以500-1000 µL/min的流速注入NTA仪器的检测室（参见材料表）。</li>
		<li>打开488激光通道，确保软件界面中EMs的数量在100-300之间，并呈现布朗运动。</li>
		<li>根据制造商的操作说明，选择合适的标准操作程序（EV-488），以确保仪器的灵敏度适用于EMs的检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）检测
	<ol>
		<li>用等体积的5%戊二醛固定EMs（1 mg/mL），固定30分钟，并通过BCA蛋白检测试剂盒测定EMs浓度为1 mg/mL。</li>
		<li>将10 µL EMs滴加至铜网的碳膜面，静置10分钟后用滤纸从边缘吸去多余液体；加入10 µL PBS，立即用滤纸吸干，重复两次以去除多余的戊二醛。</li>
		<li>滴加5 µL醋酸铀染色液，负染1分钟，吸去多余染色液；用去离子水洗涤三次，室温（RT）下干燥。</li>
		<li>在100 kV加速电压下，使用透射电子显微镜记录图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western blotting）
	<ol>
		<li>向样品中加入100 µL细胞裂解缓冲液和5 µL 50倍浓缩的蛋白酶抑制剂混合液（参见材料表），用移液器轻轻混匀，冰上孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以1000 x g离心10分钟，使用BCA蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度，并收集上清。</li>
		<li>将100 µL上清液与25 µL 5倍蛋白上样缓冲液混合，在95 °C加热10分钟。</li>
		<li>根据预浇注凝胶的说明书制备凝胶，每孔上样15 µg蛋白，以80 V进行凝胶电泳；待样品进入分离胶后，电压调至100 V，随后在冰浴条件下以100 V转膜60分钟至硝酸纤维素膜上。</li>
		<li>通过蛋白质印迹法检测非EV特异性标志物（Calnexin）和EV生物标志物（Annexin和CD63）（参见材料表）。 
		&#8203;注：抗体稀释比例按照制造商推荐进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体外 EM功能检测
<ol>
	<li>EMs 标记
	<ol>
		<li>将 1 µL PKH26 与 250 µL 稀释液 C 混合（1:250），配制 2 倍染色液（4 × 10-6 M）（参见 材料表）。</li>
		<li>将 250 µL EMs（1 mg/mL）与 250 µL 2 倍染色液混合，并用移液枪迅速吹打混匀。</li>
		<li>室温下轻轻翻转离心管，孵育 2–5 分钟。</li>
		<li>加入等体积血清或 1% 牛血清白蛋白，孵育 1 分钟以终止染色反应。</li>
		<li>使用 1000 KD 超滤管在 3000 x g 条件下超滤 30 分钟以去除多余的 PKH26，并加入 PBS 重复洗涤三次。将残留液体用 PBS 重悬至 500 µL，经 0.22 µm 滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞摄取实验
	<ol>
		<li>细胞接种：在含 10% 胎牛血清和 5% 青霉素-链霉素的 1 mL DMEM 培养基中，将 1 × 106 个细胞接种于 35 mm 共聚焦培养皿中，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
		<li>使用 0.22 µm 无菌注射器滤膜过滤 EMs，以去除潜在污染物。</li>
		<li>用 PKH26 标记的 EMs（109 粒子/mL）处理细胞，孵育 8 小时。</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次，加入 DAPI（10 ng/mL），室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>在共聚焦激光扫描荧光显微镜下，使用 405 nm 和 561 nm 激光通道采集荧光图像（参见 材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Magnetic High-Yield Production of Endosome-Derived Nanovesicles

<ol><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), eaau6977(2020).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAL-1+controls+multivesicular+body+biogenesis+and+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion.</a> J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).</li>
<li>Farooqi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+biogenesis%2C+bioactivities+and+functions+as+new+delivery+systems+of+natural+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds.</a> Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).</li>
<li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+opportunity%2C+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Castilletti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+induction+of+IFN-alpha+and+-gamma+by+SARS-CoV+also+in+the+absence+of+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication.</a> Virology. 341 (1), 163-169 (2005).</li>
<li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines+in+an+evolving+oncology+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape.</a> Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).</li>
<li>Jo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+generation+of+cell-derived+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Large-scale generation of cell-derived nanovesicles.</a> Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nanovesicles+with+sliced+cellular+membrane+fragments+for+exogenous+material+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery.</a> Biomaterials. 59, 12-20 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+ablate+neuroblastoma+tumor+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo.</a> Biomater Adv. 142, 213161(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+deliver+doxorubicin+to+osteosarcoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo.</a> Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+exosome+mimetic+vesicles+and+exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312(2022).</li>
<li>Li, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+exosomes+for+translational+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial exosomes for translational nanomedicine.</a> J Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+characteristics+of+310+SARS-CoV-2+Omicron+variant+patients+and+comparison+with+Delta+and+Beta+variant+patients+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+Sin%22%5BJournal%5D)">Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China.</a> Virol Sin. 37 (5), 12(2022).</li>
<li>Shapira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+platform+for+attenuating+immune+hyperactivity+using+EXO-CD24+in+COVID-19+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond.</a> EMBO Mol Med. 14 (9), 15997(2022).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+exosome-mimetic+nanovesicles+for+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+to+malignant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors.</a> ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).</li>
<li>Le, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+mild+isolation+of+intact+lysosomes+using+magnetic-plasmonic+hybrid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles.</a> ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).</li>
<li>Jeong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovesicles+engineered+from+ES+cells+for+enhanced+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation.</a> Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).</li>
<li>Kooijmans, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+GPI-anchored+anti-EGFR+nanobodies+on+extracellular+vesicles+promotes+tumour+cell+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting.</a> J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).</li>
</ol>

D.W. 和 P.G. 是由中国科学院基础医学与癌症研究所（IBMC）提交的一项专利申请的共同发明人。其他作者声明不存在利益冲突。

作为无细胞治疗的替代方案和纳米级药物递送系统，细胞外囊泡（EVs）尚未达到其临床预期，主要障碍之一是缺乏可规模化且可重复的生产与纯化方法6。因此，已开发出多种类型的细胞膜囊泡（EMs）作为具有类似生物学复杂性的EV类似物14。迄今为止，最常用的EM实例是来源于细胞质膜的纳米囊泡。此类纳米囊泡可通过直接挤出完整亲代细胞而相对简便地制备17。然而，由于存在两个缺陷，来源于细胞质膜的纳米囊泡无法真实再现天然EVs：第一，这些纳米囊泡的生物学来源为细胞质膜，其脂质和蛋白质组成与天然EVs存在差异；第二，存在来自非EV细胞器及细胞碎片的蛋白质、核酸和脂质等污染物，导致EM不可避免地具有异质性。在本方法中，我们先将细胞与氧化铁纳米颗粒（IONPs）共孵育，通过磁性分离收集载有IONPs的内体，再通过高速均质化生成单分散的纳米囊泡，最后通过第二轮磁性分离获得不含IONP的EMs。此外，我们通过探究不同参数（如均质化速度和时间）对EM大小和产率的影响，优化了EM的制备条件。该方案利用了一个有趣的生物学现象：磁性纳米颗粒（MNPs，例如10 nm的IONPs）可通过内吞作用被几乎所有细胞高效摄取，并特异性地富集于内体中，而不会积累在其他细胞器内。这一独特的生物学过程使得通过磁性分离即可获得载有MNPs的内体，且无非EV污染物。反过来，利用这些纯化的细胞内体制备的纳米囊泡能够更忠实地再现天然EVs的生物学复杂性。
此外，细胞外囊泡（EV）分离方法的金标准是超速离心法，该方法需要大量细胞培养基，处理时间长达5小时以上，且每1×106个细胞仅能获得1×107–1×108个颗粒6。传统的全亲代细胞挤出法包括多次超高压膜挤出和超速离心步骤，虽然产率相对较高，但需要昂贵的设备17。然而，采用本方案可显著提高微囊泡（EM）的产量、效率、成本效益和人力利用率。本方案中使用的高速匀浆器是一种常见且低成本的设备，处理时间仅需5分钟，与天然EV相比，该方法可从1×106个细胞中获得多达100倍的EM。然而，该方法也存在一些局限性，例如在高速匀浆过程中会丢失内体蛋白；已有研究表明，细胞内吞的磁性纳米颗粒（MNPs）可被转运至溶酶体，可能造成潜在污染18。
从现有角度来看，工程化膜囊泡（EMs）可被设计以发挥与其天然对应物相似的重要生物学功能，因而可能成为一种新型且极具前景的生物治疗手段。通过选择特定的亲代细胞（例如干细胞19）或进行基因改造（例如融合蛋白20），可将生物活性物质（如蛋白质和核酸）整合到EMs中。例如，通过挤出活体胚胎干细胞获得的细胞来源纳米囊泡对组织修复或伤口愈合过程具有积极促进作用19。基因改造是赋予&#160;EMs特定生物学功能的另一种可行策略。例如，当细胞被转染表达抗表皮生长因子受体（EGFR）纳米抗体与糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽的融合载体时，EGFR纳米抗体可锚定于细胞外囊泡（EVs）表面，从而靶向EGFR表达的肿瘤细胞20。在多项临床前研究中，EMs作为无细胞治疗的替代方案以及纳米级药物递送系统表现出良好性能14；然而，目前对于EM或基于EV的治疗机制仍缺乏系统深入的理解，且在临床研究中仍存在关于EVs和EMs异质性及可重复性的担忧。综上所述，EMs的生物学功能及其临床应用价值仍需进一步深入研究。

细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞分泌的微小囊泡，大小范围为30-150 nm，含有丰富的生物活性物质。根据来源细胞的不同，EVs表现出高度异质性，具有多种源自亲代细胞的特异性成分1。EVs被释放到体液中，并可转运至远端部位，被靶细胞摄取后发挥功能2，这一特性可用于递送多种生物活性分子和药物，应用于组织修复、肿瘤诊断与治疗以及免疫调节3,4。然而，体液中其他具有相似生物物理特性的生物纳米颗粒（如脂蛋白）和纳米囊泡（如非内体来源的EVs）不可避免地会影响EVs的分离与纯化。迄今为止，超速离心法仍是EVs分离的金标准，此外还发展了蔗糖密度梯度离心、超滤、聚乙二醇沉淀、层析以及免疫磁珠分离等多种分离方法5。目前限制EVs治疗产品临床转化和商业化的主要瓶颈在于缺乏能够实现高通量、可重复分离EVs的技术6,7,8。传统的EVs分离技术（如超速离心和尺寸排阻层析）存在产率低（1 × 107–1 × 108/1 × 106 个细胞）、生产周期长（24–48 h）、产品质量重复性差等问题，且需要昂贵且耗能高的生产设备，无法满足当前临床对EVs的需求6。
外泌体模拟物（EMs）是天然细胞外囊泡（EVs）的合成替代物，因其结构和功能与天然EVs高度相似，且生产具有可扩展性，已受到广泛关注9,10。目前EMs的主要来源是通过对完整亲代细胞进行连续挤压直接制备，这类EMs表现出与天然EVs相当的生物学功能11,12。例如，来源于人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的EMs具有与天然EVs相似的促伤口愈合作用，且蛋白质组成更为丰富13。尽管来源于完整细胞的EMs具备EVs的生物学复杂性，但其主要缺点是产物存在异质性，不可避免地混杂了多种细胞器和细胞碎片。蛋白质定位分析进一步表明，通过全细胞挤压法制备的EMs含有大量来自线粒体和内质网的非EV特异性蛋白13。此外，大多数EMs的制备方法仍依赖超速离心，这一过程耗时且耗能14。鉴于外泌体 exclusively 来源于细胞内体，我们推测，与目前通过全细胞挤压法获得的细胞膜来源EMs相比，经生物工程改造获得的内体来源纳米囊泡可能更真实地再现外泌体与EMs之间的生物学同源性14。然而，由于缺乏可行的技术手段，内体来源纳米囊泡的制备仍面临巨大挑战。
临床研究已将细胞外囊泡（EVs）作为无细胞治疗的替代手段以及用于治疗多种疾病的纳米级药物递送系统。例如，来源于骨髓间充质干细胞的EVs已被用于治疗由COVID-19引起的重症肺炎，并取得了令人鼓舞的效果。最近，携带CD24蛋白的基因工程EVs在治疗COVID-19患者中也显示出显著的治疗优势15,16。然而，由于传统分离方法产量低且成本高，目前仍无法满足EV治疗的临床需求。本研究报道了一种通过磁分离辅助的高速均质化方法大规模制备内体来源纳米囊泡的技术。该方法利用磁性纳米颗粒（MNPs）的内吞途径，通过磁分离富集载有MNPs的内体，随后经高速均质化将内体转化为单分散的纳米囊泡。由于本方案所收集的内体类型具有多样性，未来仍需进一步深入研究，以在工业界建立良好的生产规范（GMP）。这种新型的EM制备方法在时间效率上更具优势（仅需5分钟高速均质化），即可获得与天然EVs相似的纳米囊泡。与超速离心法相比，该方法能从相同数量的细胞中产生指数级更多的囊泡，且可广泛适用于多种细胞类型。

<table><tbody><tr><td>Annexin 抗体</td><td>ABclonal</td><td>A11235</td><td>Western 印迹</td></tr><tr><td>BCA 检测试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>蛋白浓度测定</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>GeneTex</td><td>HL1598</td><td>Western 印迹</td></tr><tr><td>CD63 抗体</td><td>ABclonal</td><td>A19023</td><td>Western 印迹</td></tr><tr><td>用于 Western 印迹和免疫沉淀的细胞裂解液</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western 印迹</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td>细胞离心</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描荧光显微镜</td><td>NIKON</td><td>A1 HD25</td><td>荧光图像拍摄</td></tr><tr><td>DMEM 基础培养基 (1x)</td><td>GIBCO</td><td>C11995500BT</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>动态光散射 (DLS)</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN3600</td><td>粒径分析</td></tr><tr><td>电动玻璃匀浆器</td><td>SCIENTZ(中国宁波)</td><td>DY89-II</td><td>低速匀浆</td></tr><tr><td>外泌体去除型 FBS</td><td>System Bioscience</td><td>EXO-FBS-50A-1</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>高速匀浆器</td><td>SCIENTZ(中国宁波)</td><td>XHF-DY</td><td>高速匀浆</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>拓恒机电科技(中国上海)</td><td>NA</td><td>磁性分离</td></tr><tr><td>通用细胞膜标记用 PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>试剂盒包含溶于乙醇的 PKH26 细胞连接剂和稀释液 C</td></tr><tr><td>聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒 (IONPs)</td><td>中科创明技术(中国北京)</td><td>Mag1100-10</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>阿拉丁</td><td>7447-40-7</td><td>细胞低渗处理</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Beyotime</td><td>P1030</td><td>蛋白酶抑制</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>阿拉丁</td><td>7447-40-7</td><td>细胞低渗处理</td></tr><tr><td>透射电子显微镜 (TEM)</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>形态学成像</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>外泌体离心</td></tr><tr><td>ZetaView 纳米颗粒&amp;nbsp; 追踪分析仪</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX120</td><td>纳米颗粒追踪分析</td></tr></tbody></table>

一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

A Magnetic Separation-Assisted High-Speed Homogenization Method for Large-Scale Production of Endosome-Derived Vesicles

细胞外囊泡（EVs）在生理与病理研究、疾病诊断和治疗中已受到广泛关注；然而，由于缺乏可放大的生产工艺，其临床转化受到限制。因此，本方案提供了一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一类新型的内体来源外泌体模拟物（EMs），其产量约为传统超速离心方法的100倍。在该方法中，磁性纳米颗粒（MNPs）通过内吞作用被亲代细胞摄取，并随后在其内体中富集。然后，通过低渗处理和磁分离收集并纯化载有MNPs的内体。利用高速均质器将载有MNPs的内体破碎为单分散的纳米囊泡。所获得的内体来源囊泡具有相同的生物学来源和结构，可通过纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜和蛋白质印迹法进行表征。其形态和蛋白质组成与天然EVs相似，表明EMs有望成为用于临床转化的低成本、高产量的天然EVs替代物。

通过磁分离辅助高速均质化制备胞外囊泡模拟物（EM）的工作流程如图1所示。细胞通过内吞作用将10 nm的聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs）摄入，并特异性地富集于内体中（图3A）。经低渗缓冲液处理并进行匀浆后，负载IONPs的内体从细胞中释放，并通过磁分离进行收集。分离得到的内体进一步通过高速均质化重新构建为单分散的纳米囊泡，即EMs。我们探索了多个关键参数（如均质化速度和时间），以确定最优的EM制备条件（图2）。最终，综合考虑所制备EMs的粒径和产率，选择140 × g 的均质速度处理5分钟作为优化条件。游离的IONPs以及负载IONPs的EMs通过第二轮磁分离从终产物溶液中去除，从而获得不含IONPs的EMs。该方法可从亲代细胞的内体高效制备出高度均一且单分散的纳米囊泡，其生物学来源与天然细胞外囊泡（EVs）相同。
为了将超速离心法获得的细胞外囊泡（EVs）与本方法生成的细胞膜囊泡（EMs）进行比较，分别制备了骨髓间充质干细胞（BMSC）和293T细胞来源的EVs与EMs。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）对EMs的直径和形态进行了分析。BMSC-EMs的形态具有典型的碗状囊泡样结构特征，并由脂质双层膜包被（图3A）。NTA分析结果显示，BMSC-EMs和293T-EMs的流体动力学直径与天然EVs（BMSC-EVs和293T-EVs）相似（图3B）。高速均质化制备BMSC-EMs的产量为8.16 × 108–1.42 × 109/1 × 106个细胞，而通过超速离心法制备的天然EVs产量仅为7.2 × 107–1.12 × 108/1 × 106个细胞。类似地，293T-EMs经高速均质化制备的产量为3.71 × 108–7.58 × 108/1 × 106个细胞，比采用传统超速离心法制备的天然293T-EVs（约5.5 × 106/1 × 106个细胞）高出约100倍（图4A）。
此外，蛋白质印迹结果表明，BMSC-EMs 含有与 EVs 相同的蛋白质生物标志物（CD63 和 Annexin）。EMs 和 EVs 均不表达 Calnexin，提示本方法制备的 EMs 几乎不含质膜污染（图 3C）。EM 与 EV 之间的蛋白质浓度无显著差异，通过 BCA 蛋白质定量试剂盒检测，BMSC-EMs 和 BMSC-EVs 的总蛋白浓度相似，分别为 11.15 µg/1 × 109 粒子和 14.71 µg/1 × 109 粒子。此外，293T-EMs 和 293T-EVs 的总蛋白浓度分别约为 31.8 µg/1 × 109 粒子和 9.95 µg/1 × 109 粒子（图 4B）。这些结果表明，EMs 具有与天然 EVs 相似的蛋白质组成。为检测 EMs 是否可被细胞内吞，将 PKH26 标记的 EMs 和 EVs 以 1 × 109 粒子/mL 的浓度与 BMSC 和 ID8 细胞共孵育 8 小时，通过共聚焦荧光显微镜观察，证实 EMs 与 EVs 一样可被细胞有效摄取并发挥作用（图 5）。
<img alt="细胞组分提取示意图；离心步骤；细胞器分离方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：磁力辅助高速均质化方法的示意图。 步骤1：细胞通过内吞作用将IONPs内化至内体中。步骤2：在低渗处理和均质化后收集细胞器，包括负载IONPs的内体。步骤3：通过磁性分离纯化负载IONPs的内体。步骤4：将内体均质化并重构为单分散纳米囊泡。步骤5：通过磁性分离去除游离的IONPs和负载IONPs的EMs，以收集不含IONPs的EMs。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="粒径及分布分析；直径、PDI随时间变化；柱状图与折线图；尺寸稳定性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：EM制备条件的优化。（A）固定均质时间为5 min，通过DLS分析不同均质速度下BMSC-EM的直径和PDI。（B）固定均质速度为140 × g，通过DLS分析不同均质时间下BMSC-EM的直径和PDI。（C）通过DLS分析BMSC-EM在不同储存时间点的直径和PDI。（D）固定均质时间为5 min，通过NTA分析不同均质速度下BMSC-EM的直径和浓度。（E）固定均质速度为140 × g，通过NTA分析不同均质时间下BMSC-EM的直径和浓度。（F）通过NTA分析不同浓度IONPs与BMSC细胞共孵育后BMSC-EM的直径和得率。****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子显微镜和纳米颗粒尺寸分析图；通过蛋白质印迹检测蛋白质表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：EMs 的表征。（A）亲代细胞内吞 IONPs 后的形态、内体及 EMs 的透射电子显微镜（TEM）表征。比例尺为 500 nm。（B）通过 NTA 检测 BMSC-EM、BMSC-EV、293T-EM 和 293T-EV 的流体动力学直径。（C）BMSC-EMs、BMSC-EVs 和 BMSC 细胞裂解液的蛋白质印迹分析结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较BMSC和293T细胞来源的EM与EV的颗粒产量和蛋白浓度的柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：EM的产量高于EV。（A）通过NTA分析从BMSC和293T细胞制备的EM和EV的产量。（B）从BMSC和293T细胞制备的EM和EV的蛋白产量。**p &lt; 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像，DAPI 和 PKH26 染色，细胞摄取研究，ID8 和 BMSC 细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：BMSC 和 ID8 细胞摄取 PKH26 标记的 EVs 和 EMs 的代表性荧光显微镜图像。 比例尺为 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。

细胞外囊泡（EVs）在生理与病理研究、疾病诊断及治疗中已受到广泛关注；然而，……

本研究旨在解决外泌体研究中的一个关键且尚未满足的需求，即开发一种可大规模、可重复生产的外泌体模拟物制备方法。由于天然细胞外囊泡（EVs）产量较低，研究人员已采用尺寸排阻和基于离心的过滤等方法制备外泌体模拟物（EMs）作为替代。目前，大多数外泌体模拟物是通过全细胞直接挤出获得，虽具有类似的生物学功能，但不可避免地受到细胞碎片和细胞器的污染。细胞外囊泡在生物医学研究中备受关注，尤其在疾病治疗领域。然而，传统的细胞外囊泡分离技术（如超速离心法、排阻色谱法和亲和层析法）存在产量低、重复性差、质量不稳定等问题，且需要昂贵且依赖专业人员操作的生产设备，难以满足临床对细胞外囊泡的需求。本研究提供了一种简单且低成本的方法，用于放大生产外泌体模拟物。我们利用了一项独特的生物学发现，即磁性纳米颗粒只能被细胞内的内体所吸收，而不会进入其他细胞器。因此，我们可以将内体转化为均一的纳米囊泡。该方法可有效提高外泌体的产量并降低成本。首先，在六孔板中使用含有10%胎牛血清（FBS）和5%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基培养细胞。将培养物置于37°C、5%二氧化碳环境中过夜孵育。次日，用10纳米浓度的聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs）与细胞共培养。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育12小时。孵育结束后，每孔加入0.5毫升胰蛋白酶，消化3分钟。然后，每孔加入1毫升完全培养基以终止消化。将细胞悬液在1,000 G离心五分钟，弃去上清液，然后用PBS重悬沉淀。随后，将沉淀重悬于8毫升新鲜配制的低渗溶液中，孵育15分钟。将细胞悬液转移至玻璃试管中，使用玻璃匀浆器以1,000 RPM进行20次破碎，以释放细胞器。匀浆后，取一毫升细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。将试管置于磁分离器中一小时，以完全分离载有IONP的内体与其他细胞器及细胞碎片。收集内体时，弃去管中液体，并加入三毫升PBS重悬内体。然后，使用移液枪吹打，重悬位于磁力架旁离心管接触面上的棕色沉淀。进行高速匀浆时，将内体溶液转移至15毫升离心管中。将冰盒置于管子下方，然后将管子放在高速匀浆器上。将10毫升探头放入试管中，注意不要触碰到管底。在匀浆机屏幕上，将速度调节至140 G，时间设置为五分钟。按下确认按钮，然后按下启动按钮。高速匀浆后，将纳米囊泡悬液转移至1.5毫升离心管中，并将离心管置于磁性分离器中静置1小时。最后，在不扰动磁架附近表面的情况下，收集含有目标外泌体模拟物（EMs）的液体。通过NTA和TEM分析BMSC-EMs的形态，结果显示其具有典型的碗状、囊泡样结构，由脂质双分子层包被。BMSC-EMs 和 293T-EMs 的流体动力学直径与天然 EVs 相似。Western 印迹结果表明，BMSC-EMs 含有与 EVs 相同的蛋白生物标志物，且几乎无质膜污染。EMs 的得率显著高于通过超速离心法制备的天然 EVs。EMs 的蛋白质组成与天然 EVs 相似。

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