Name: 单层石墨烯在冷冻电子显微镜网格中的应用，用于高分辨率结构测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 了解单层石墨烯包覆冷冻电镜网格的制备方法，用于提高颗粒密度并改善取向分布。该方案支持实验室低成本制备，助力高分辨率结构测定。

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样品在MIT.nano的冷冻电镜设施中制备并成像，所用显微镜由Arnold和Mabel Beckman基金会资助购置。接触角成像设备在MIT Metropolis创客空间打印完成。我们感谢颜宁（Nieng Yan）实验室和韩一模（Yimo Han）实验室以及MIT.nano工作人员在本方法应用过程中提供的支持。特别感谢高冠慧（Guanhui Gao）博士和Sarah Sterling博士富有洞见的讨论与反馈。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金R01-GM144542、5T32-GM007287以及美国国家科学基金会（NSF）CAREER基金2046778的支持。Davis实验室的研究还获得了阿尔弗雷德·P·斯隆基金会、James H. Ferry基金、MIT J-Clinic以及Whitehead家族的支持。

1.&#160;化学气相沉积石墨烯的制备
<ol>
	<li>按以下步骤制备石墨烯刻蚀溶液。
	<ol>
		<li>在50 mL烧杯中，将4.6 g过硫酸铵（APS）溶于20 mL分子级水中，配制成1 M溶液，并用铝箔覆盖。在进行步骤1.2的同时，确保APS完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备一段化学气相沉积（CVD）石墨烯用于甲基丙烯酸甲酯（MMA）涂覆。小心地裁剪出一块方形CVD石墨烯。将该方形样品转移至洁净培养皿中的盖玻片（50 mm × 24 mm）上，并在运送至旋涂仪过程中加以覆盖。 
	&#8203;注意：一个18 mm × 18 mm的方形样品可制备出25–36个石墨烯包被的载网。</li>
</ol>
2. 用MMA涂覆CVD石墨烯
<ol>
	<li>将旋涂仪的参数设置为高速旋转60秒，转速为2,500 rpm。小心地将CVD石墨烯放置在尺寸合适的卡盘上。 
	&#8203;注意：理想情况下，CVD石墨烯应超出所选卡盘边缘1–2 mm，以防止甲基丙烯酸甲酯（MMA）被吸入真空系统。</li>
	<li>按下取用/吸附按钮以启动真空泵，将CVD石墨烯固定在卡盘上。将MMA滴加至CVD石墨烯方片的中心，盖上盖子，并立即按下开始/停止按钮。对于18 mm × 18 mm的CVD石墨烯方片，40 µL的MMA已足够。</li>
	<li>旋转停止后，关闭真空泵，并用镊子小心取下涂有MMA的CVD石墨烯。将CVD石墨烯翻转，使涂有MMA的一面朝下，重新放置在玻璃盖玻片上。</li>
</ol>
3. 石墨烯背面的等离子体刻蚀
<ol>
	<li>使用平头镊子将覆盖有CVD石墨烯的盖玻片转移至电晕放电器中，在25 mA条件下电晕放电30秒。</li>
	<li>将带有CVD石墨烯的盖玻片放回培养皿中，并在转移至铜刻蚀区域过程中保持覆盖。MMA涂层可保护石墨烯上层免受等离子体刻蚀。</li>
</ol>
4. 切割成网格尺寸的MMA包覆CVD石墨烯方片
<ol>
	<li>使用两对镊子支撑CVD石墨烯方片。注意CVD石墨烯方片的方向，在用镊子夹持时保持MMA面朝上（关键步骤）。</li>
	<li>将CVD石墨烯切割成约3 mm × 3 mm的正方形。使用&#160;此步骤需使用两把反向作用的镊子&#160;用于保持CVD石墨烯方片正面朝上并固定其位置，同时在将其余部分切割分离后，夹住一个3 mm × 3 mm方片的边缘。</li>
</ol>
5. 从涂覆MMA的CVD石墨烯上溶解铜基底
<ol>
	<li>将每个 3 mm × 3 mm 的方块小心地漂浮在 APS 溶液中。在释放每个方块之前，先使其接触 APS 溶液的表面。倾斜烧杯，使每个方块能够以较小的角度放入溶液中；这样可确保方块不会下沉。</li>
	<li>用铝箔覆盖烧杯，并在 25 °C 下孵育过夜。</li>
</ol>
6. 从 APS 上移除 MMA/石墨烯薄膜
<ol>
	<li>使用尺寸为 12 mm × 50 mm 的玻璃盖玻片，通过将盖玻片垂直轻轻浸入 APS 中，然后横向移动盖玻片使其与漂浮的 MMA/石墨烯方片接触，从而从 APS 中提取 MMA/石墨烯方片。</li>
	<li>小心取出盖玻片，并确保方片在取出时完全粘附在盖玻片的侧面上。</li>
	<li>将 MMA/石墨烯方片转移至盛有分子级水的洁净 50 mL 烧杯中，浸泡 20 分钟。将附有 MMA/石墨烯方片的盖玻片垂直轻轻浸入水中，并确保方片在接触水面时从盖玻片上脱落。对所有 MMA/石墨烯方片重复此操作。</li>
</ol>
7. 将石墨烯粘附到载网上
<ol>
	<li>使用负向操作镊子，将载网垂直轻轻浸入水中，碳膜面朝向漂浮的MMA/石墨烯方片。一旦与方片接触，小心取出载网，并确保方片完全粘附在载网的碳膜面上。载网浸入水中时，尽量减少横向移动，以防损坏网格方格（关键步骤）。</li>
	<li>将载网放置于洁净的盖玻片上，MMA/石墨烯面朝上，室温晾干1至2分钟。使用平头镊子将涂有石墨烯/MMA的载网转移至预热至130 °C的加热板上。</li>
	<li>用玻璃培养皿盖覆盖，孵育20分钟。从加热板上取下后，冷却至室温1至2分钟。 
	&#8203;注意：操作时需谨慎，因培养皿盖将非常烫手。</li>
</ol>
8. 使用丙酮溶解MMA
<ol>
	<li>将整个盖玻片转移至一个含有15 mL丙酮的培养皿中，孵育30分钟。</li>
	<li>使用一支洁净的玻璃刻度移液管，将孵育过载网的丙酮转移至废液容器中。再用一支洁净的玻璃刻度移液管，向培养皿中小心加入15 mL新鲜丙酮，孵育30分钟。</li>
	<li>重复上述洗涤步骤，共进行3次丙酮洗涤。</li>
</ol>
9. 使用异丙醇去除残留丙酮
<ol>
	<li>经过3次丙酮洗涤后，用干净的玻璃刻度移液管去除丙酮，并加入15 mL异丙醇。孵育20分钟。</li>
	<li>重复此步骤3次，共进行4次异丙醇洗涤。用镊子小心地将载网从异丙醇中取出，并在干净的盖玻片上空气中干燥。 
	注意：残留的异丙醇可能导致载网难以从镊子上释放。在松开镊子前，先使载网与干净的盖玻片接触，可缓解此问题。</li>
	<li>将带有石墨烯涂层载网的盖玻片置于设定为100 °C的加热板上，加热10分钟，以蒸发残留的有机溶剂。冷却至室温后，在真空条件下保存直至使用。</li>
</ol>
10. 石墨烯涂层载网的紫外/臭氧处理
<ol>
	<li>使用反向镊子将载网轻轻放入紫外/臭氧清洗仪的洁净照射区域，确保石墨烯涂层面朝上。</li>
	<li>推入关闭照射区域，打开仪器电源，将时间旋钮调至指定处理时间，开始对载网进行紫外/臭氧处理。 
	注意：处理时间是一个可调节参数，过长的处理可能损伤载网。Han 等人30建议采用 10 分钟的紫外/臭氧处理，我们也发现 10 分钟的处理已足够。有关该处理时间的优化建议，请参见步骤 12。</li>
	<li>按照 Koh 等人37所述的冷冻电镜样品 plunge 冷冻步骤，立即在处理后的载网上进行样品制备。 
	注意：紫外/臭氧处理后，大气中的碳氢化合物可能在载网表面聚集，增加石墨烯表面的疏水性38,39。为避免此问题，应在紫外/臭氧处理后立即进行 plunge 冷冻。建议分批处理载网，例如，先对六个载网进行紫外/臭氧处理并立即完成这六个载网的 plunge 冷冻，随后处理第二批载网并立即进行 plunge 冷冻。</li>
</ol>
11. 采集衍射图像
<ol>
	<li>确保显微镜已正确调校，建立了平行照明，并将最终离焦量设为 -0.2 µm。</li>
	<li>完全插入荧光屏和束阻，进入衍射模式以清晰观察衍射斑点。</li>
	<li>使用CCD相机采集图像，并利用图像分析软件进行评估。 
	注意：单层石墨烯产生的最易观察和识别的衍射斑点为6个，对应于2.13 Å的空间频率。使用测量工具估算衍射束中心到其中一个衍射斑点的距离（以倒数单位表示）。值得注意的是，2.13 Å <img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/66023/66023eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 0.47 Å-1。</li>
</ol>
12. 评估载网的亲水性
<ol>
	<li>准备成像装置。准备一个手机支架、台面成像平台、带摄像头的手机、玻璃盖玻片和石蜡膜。此处所示图像使用了根据提供的 .stl 文件3D打印的手机支架和台面成像平台，从而获得更易于重复和定量的接触角测量结果（补充图1A）。</li>
	<li>将玻璃盖玻片平放在平坦表面上，然后剪下一小块1 cm × 1 cm的石蜡膜并放置在玻璃盖玻片上。将手机放置在手机支架上，调整手机方向，使摄像头与玻璃盖玻片处于同一平面。使用橡皮筋将手机固定在此位置（补充图1B）。拍摄一张示例照片，以确认摄像头已与成像表面对齐。</li>
	<li>在对石墨烯涂层载网进行紫外/臭氧处理后，立即将单个载网放置在玻璃盖玻片上的石蜡膜方块上，确保石墨烯面朝上。用移液器在载网表面中心加入2 µL水滴，并立即拍照。 
	注意：可在以下情况重复此步骤：i）经过不同时长的紫外/臭氧处理后，以确定合适的处理时间；或 ii）在紫外/臭氧处理后的不同时间点，以测量载网表面保持亲水性的持续时间。</li>
	<li>将照片导入ImageJ43，并使用接触角插件计算接触角。</li>
</ol>
13. dCas9 复合物数据集的单颗粒分析
注意：本方案中描述的所有图像处理均使用 cryoSPARC 4.2.1 版本完成。
<ol>
	<li>使用“Patch运动校正”和“Patch CTF估计”任务对电影文件进行预处理。使用“Blob挑选器”任务进行颗粒挑选，挑选直径范围为115 Å至135 Å的球形Blob。</li>
	<li>使用“从显微照片中提取颗粒”任务提取颗粒，采用归一化互相关系数（NCC）和功率阈值，使每张显微照片中提取约200–300个颗粒。请注意，合适的阈值及所得颗粒数量可能因数据而异，用户应检查多张显微照片上的挑选质量，以确定适宜的条件。</li>
	<li>使用“从头重构”任务进行多类别初始重构，设定三个类别。其中三个类别中的两个可能包含非Cas9颗粒，包括表面污染物。选择与dCas9相似的类别进行后续处理。 
	注意：可进一步应用多轮多类别从头重构或非均一精修，以进一步优化颗粒堆栈。</li>
	<li>使用“非均匀精修”任务并选择默认参数进行3D精修。利用最终3D精修所得的密度图和掩膜，通过“验证（FSC）”和“ThreeDFSC”任务评估重构的分辨率。</li>
</ol>

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

<ol><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cheaper%3A+Recent+advances+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).</li>
<li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li>
<li>Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+structural+ensembles+from+single+particle+cryo-EM+data+using+cryoDRGN%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN.</a> Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).</li>
<li>Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoDRGN%3A+reconstruction+of+heterogeneous+cryo-EM+structures+using+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks.</a> Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).</li>
<li>Chen, M., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+mixed-dimensional+Gaussian+mixture+model+for+characterizing+variability+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM.</a> Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).</li>
<li>Punjani, A., Fleet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+variability+analysis%3A+Resolving+continuous+flexibility+and+discrete+heterogeneity+from+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM.</a> J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).</li>
<li>Dashti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieving+functional+pathways+of+biomolecules+from+single-particle+snapshots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots.</a> Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).</li>
<li>Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KsgA+facilitates+ribosomal+small+subunit+maturation+by+proofreading+a+key+structural+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion.</a> Nat Struct Mol Biol. , (2023).</li>
<li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+aqueous+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM--the+first+thirty+years%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM--the first thirty years.</a> J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).</li>
<li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+the+formation+and+stability+of+thin%2C+cryo-EM+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens.</a> Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-Em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-Em grids.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747(2019).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+effects+of+particle+adsorption+to+the+air%2Fwater+interface+in+single-particle+cryo-electron+microscopy%3A+Bacterial+RNA+polymerase+and+CHAPSO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO.</a> J Struct Biol X. 1, 100005(2019).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
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<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

冷冻电镜（CryoEM）样品制备涉及诸多技术挑战，大多数实验流程要求研究人员极其小心地手动操作脆弱的载网，以避免造成损伤。此外，任何样品是否适合玻璃化冷冻都难以预测；颗粒常常与气液界面或覆盖在载网表面的固体支撑膜发生相互作用，这可能导致颗粒出现优势取向，或无法进入成像孔洞，除非使用非常高的蛋白浓度24。在有孔的CryoEM载网上覆盖一层连续的单层石墨烯，已被证明在改善显微照片中颗粒分布、提高低浓度下的颗粒数量，以及减少因气液界面相互作用导致的优势取向方面具有巨大潜力30。
现有用于冷冻电镜载网的石墨烯包被方案存在一个局限性，即包被过程需要大量手动操作，这可能影响包被质量并增加载网之间的变异性。在本研究中，我们对已有方案进行了轻微改进，用于在冷冻电镜载网上包被单层石墨烯30。
本方案中的关键步骤包括：在CVD石墨烯上涂覆MMA，使用APS溶解CVD石墨烯的铜基底，以及将石墨烯转移至冷冻电...

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）已发展成为一种广泛用于可视化生物大分子的方法1。在直接电子探测技术2,3,4、数据采集5以及图像处理算法6,7,8,9,10不断进步的推动下，cryoEM 目前已能够对数量迅速增长的大分子复合物解析出接近原子分辨率的三维结构11。此外，利用该方法所具有的单分子特性，研究者可以从同一样品中解析出多种结构12,13,14,15，凸显了利用所获得数据解析结构异质性集合的潜力16,17。尽管取得了上述进展，冷冻样品载网制备环节仍存在瓶颈。

通过冷冻电镜（cryoEM）进行结构表征时，生物样品应均匀分散于水溶液中，随后需通过一种称为玻璃化（vitrification）的过程进行快速冷冻18,19。其目标是将颗粒捕获在一层均匀的玻璃态冰中，该冰层悬覆于通常刻在无定形碳层上的规则排列的孔洞之上。这种带有图案的无定形碳膜由透射电镜（TEM）载网支撑，载网上设有铜或金制的支撑栅条。在标准操作流程中，载网在加样前需通过辉光放电等离子体处理使其表面亲水。随后用滤纸吸除多余液体，使蛋白溶液在孔洞上形成一层薄液膜，以便在快速浸入冷冻剂时实现有效玻璃化。常见的挑战包括颗粒在气液界面（AWI）处富集并随之发生变性20,21,22，或呈现优势取向23,24,25，颗粒附着于碳膜表面而未能进入孔洞，以及颗粒在孔洞内发生聚集或成簇26。冰层厚度不均是另一个问题；过厚的冰会因电子散射增加而导致显微图像背景噪声升高，而过薄的冰则可能排除较大的颗粒27。
为应对这些挑战，已采用多种薄型支撑膜来包被载网表面，使颗粒能够附着于这些支撑膜上，并理想地避免与气液界面发生相互作用。石墨烯支撑膜已展现出巨大潜力，部分原因在于其具有高机械强度以及极小的散射截面，从而降低了支撑层引入的背景信号28。除了对背景噪声的贡献极小外，石墨烯还表现出优异的电导率和热导率29。已有研究表明，包被石墨烯或氧化石墨烯的载网可实现更高的颗粒密度、更均匀的颗粒分布30，并减少颗粒在气液界面（AWI）的富集22。此外，石墨烯提供了一种可进一步修饰的支撑表面，可用于：1）通过功能化修饰调控载网表面的理化性质31,32,33；或 2）偶联连接剂，以促进目标蛋白的亲和纯化34,35,36。
本文中，我们对现有的一种在冷冻电镜载网上制备单层均匀石墨烯的方案进行了改进30。这些改进旨在尽量减少整个实验流程中对载网的操作，以提高产率和可重复性。此外，我们还介绍了评估不同紫外/臭氧处理方法在样品冷冻前使载网亲水化效果的策略。在使用石墨烯涂层载网进行冷冻电镜样品制备的过程中，该步骤至关重要；我们发现，采用一种简单的方法来量化所得载网的相对亲水性非常有效。通过本方案，我们以催化失活的S. pyogenes Cas9与向导RNA及靶标DNA形成的复合物为例，获得了高分辨率的三维结构重建结果，展示了石墨烯涂层载网在结构解析中的应用价值。

<table><tbody><tr><td>250 mL 烧杯（3个）</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 烧杯（2个）</td><td>Corning</td><td>1000-50</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher</td><td>15-078-292</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher</td><td>(I17874</td><td></td></tr><tr><td>50 mm × 24 mm 盖玻片</td><td>Mattek</td><td>PCS-1.5-5024</td><td></td></tr><tr><td>化学气相沉积石墨烯（CVD graphene）</td><td>Graphene Supermarket</td><td>CVD-Cu-2x2</td><td></td></tr><tr><td>easiGlow 放电仪</td><td>Ted-Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.11727</td><td></td></tr><tr><td>平头镊子&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>50-239-60</td><td></td></tr><tr><td>玻璃切割刀</td><td>Grainger</td><td>21UE26</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿及盖子&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>75845-544</td><td></td></tr><tr><td>玻璃血清移液管</td><td>Fisher</td><td>13-676-34D</td><td></td></tr><tr><td>载网储存盒</td><td>EMS</td><td>71146-02</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Fisher</td><td>07-770-108</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipe）</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>实验室剪刀&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸甲酯 EL-6&amp;nbsp;</td><td>Kayaku</td><td>MMA M310006 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>负向操作镊子（2个）</td><td>Fisher</td><td>50-242-78</td><td></td></tr><tr><td>P20 移液器</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Rainin</td><td>17008652&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389291</td><td></td></tr><tr><td>带多孔碳膜的 Quantifoil 载网&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td>Q2100CR1</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪&amp;nbsp;</td><td>SetCas</td><td>KW-4A</td><td>配卡盘 SCA-19-23</td></tr><tr><td>直尺</td><td>ULINE</td><td>H-6560</td><td></td></tr><tr><td>温度计&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>3LRD1</td><td></td></tr><tr><td>紫外/臭氧清洗仪&amp;nbsp;</td><td>BioForce</td><td>SKU: PC440</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X11</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼滤纸（Whatman paper）</td><td>VWR</td><td>28297-216</td><td></td></tr></tbody></table>

单层石墨烯在冷冻电子显微镜载网中的应用以实现高分辨率结构解析

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

在冷冻电子显微镜（cryoEM）技术中，纯化的生物大分子被施加到带有穿孔碳膜的载网上；随后通过吸除多余液体，并迅速冷冻形成厚度约为20–100 nm的玻璃态冰层，使分子悬浮于宽度约为1 µm的碳膜孔洞中。将制备好的样品置于低温透射电子显微镜下成像，再通过合适的软件进行图像处理，即可获得接近原子分辨率的结构信息。尽管cryoEM已被广泛采用，样品制备仍是当前cryoEM工作流程中的主要瓶颈，用户常遇到样品在悬浮的玻璃态冰层中行为不佳的问题。近年来，已发展出在cryoEM载网上修饰单层连续石墨烯的方法，该石墨烯层可作为支撑表面，通常能提高成像区域的颗粒密度，并减少颗粒与气液界面之间的相互作用。本文提供了将石墨烯应用于cryoEM载网的详细实验方案，以及快速评估所得载网相对亲水性的方法。此外，我们还描述了一种基于电镜的方法，通过观察石墨烯特有的衍射图样来确认其存在。最后，我们通过使用浓度相对较低的纯样品，快速重构出Cas9复合物在2.7 Å分辨率下的密度图，展示了此类石墨烯支撑载网的实际应用价值。

采用本文所述设备（图1）和方案（图2）成功制备石墨烯包覆的冷冻电镜载网后，可在金属箔孔洞上形成单层石墨烯，其特征衍射图样可用于确认。为促进蛋白质在石墨烯表面的吸附，可采用紫外/臭氧处理，在石墨烯表面引入含氧官能团，使其具有亲水性。然而，空气中的碳氢污染物可在紫外/臭氧处理后5分钟内即吸附至石墨烯表面，从而抵消该效果38,39。值得注意的是，紫外/臭氧处理的持续时间以及处理后至 plunge 冷冻前的时间间隔均会影响样品质量。我们通过一种基于表面接触角评估包覆载网亲水性的简便方法展示了这些影响（图3；见步骤12）。
为了展示石墨烯载网在单颗粒冷冻电镜（cryoEM）中的应用，我们将一种无催化活性的RNA引导型DNA内切酶S. pyogenes Cas9（H10A；C80S；...

在冷冻电子显微镜（cryoEM）载网上应用支撑层可提高颗粒密度，限制颗粒与气液界面的相互作用，减少电子束诱导的运动，并改善颗粒取向的分布。本文介绍了一种在cryoEM载网上涂覆单层石墨烯以改进冷冻样品制备的可靠方案。

在冷冻电子显微镜（cryoEM）中，将纯化的生物大分子加样至载有带孔碳膜的载网上，随后通过滤纸吸除多余液体……

冷冻电镜样品制备中的一个常见挑战是颗粒在气-水界面处聚集，导致颗粒产生优势取向并发生变性。相比之下，更理想的情况是使颗粒吸附在载网表面，而石墨烯等具有鳍状薄膜支撑结构的材料有助于实现这一状态。另一个挑战是需要相对较高的样品浓度，而石墨烯也有望解决这一问题。石墨烯包被载网在冷冻电镜结构解析中具有诸多优势，但长期以来，其在实验室内的可重复制备存在困难，且商业购买成本高昂。本方案实现了单层石墨烯的稳定沉积，从而降低了研究人员在研究中使用此类载网的门槛。石墨烯因其独特的材料特性而与众不同。它是一种碳单层结构，因此背景噪声极低。其他冷冻电镜载网支撑材料，例如薄层无定形碳或氧化石墨烯碎片，无法以单层形式应用，会产生更强的背景信号。现在我们已经建立了将石墨烯应用于冷冻电镜载网的可靠方案，接下来希望进一步对石墨烯包被的载网进行功能化修饰，引入亲和探针，以实现直接从细胞裂解液中在载网上捕获目标分子。这可能会缓解冷冻电镜样品制备中的另一个瓶颈。首先，在一个50毫升烧杯中配制石墨烯刻蚀溶液。具体操作为：将4.6克过硫酸铵（APS）加入20毫升分子级水中，用铝箔覆盖烧杯，并使APS完全溶解。为对CVD石墨烯区域进行MMA包覆，需小心切割出一块方形石墨烯，将其转移至洁净培养皿中的盖玻片上，并盖上培养皿，随后运送至旋涂仪。接下来，将旋涂仪设置为高速旋转60秒，转速为每分钟2,500转。然后，小心地将CVD石墨烯样品转移至尺寸匹配的卡盘上。按下吸取或吸附按钮，启动真空泵，将石墨烯固定在卡盘上。然后将MMA滴加到CVD石墨烯方片的中心。盖上盖子，抽真空，并立即按下启动或停止按钮。停止旋转并关闭真空泵后，使用镊子小心取出涂有甲基丙烯酸甲酯（MMA）的化学气相沉积（CVD）石墨烯。将石墨烯翻转，使涂层面向下，重新放回玻璃盖玻片上。接着，使用平头镊子将盖玻片上的CVD石墨烯转移至辉光放电器中，在25毫安电流下辉光放电30秒。将载有石墨烯的盖玻片放回培养皿中，最后盖上盖子，以便运送至铜刻蚀区域。首先，将涂有甲基丙烯酸甲酯（MMA）的石墨烯方片切割成网格大小的片状。为此，使用两把反向作用镊子支撑CVD石墨烯方片，同时确保在将其固定到镊子上时MMA面朝上。要将石墨烯切割成小方块，需用两把反向作用镊子夹住石墨烯正面朝上的部分，将其固定在原位，同时在从小方块切割下来后，用镊子夹住其边缘。倾斜盛有过硫酸铵（APS）的烧杯，以较小的角度将石墨烯方块放入溶液中，避免其沉入液体深处。然后选取一个方片，在释放之前使其接触APS溶液的表面。用铝箔覆盖烧杯后，在25摄氏度下孵育过夜。接下来，要将MMA石墨烯薄膜从APS溶液中取出，首先将一块玻璃盖玻片垂直浸入溶液中，然后横向移动，使其接触一个漂浮的方片。然后小心地取下盖玻片，确保薄膜在取下时完全附着在盖玻片的一侧。将盖玻片垂直浸入盛有分子生物学级水的50 mL烧杯中，使附着的薄膜脱离并进入水中。以类似方式，将所有薄膜转移至该烧杯中。将薄膜置于烧杯中静置20分钟，然后即可用于粘附到冷冻电镜载网上。要将甲基丙烯酸甲酯（MMA）涂层的化学气相沉积（CVD）石墨烯附着到载网上，使用先前制备并保存在盛有分子级水的烧杯中的、与载网尺寸匹配的涂层石墨烯方片。使用反向操作镊子，将载网垂直轻轻浸入水中，使碳面朝向漂浮在水面上的MMA石墨烯方片。当方片与网格接触后，小心地将网格从水中取出，确保方片完全粘附在网格的碳膜一侧。将网格放置在干净的盖玻片上，使MMA石墨烯面朝上，静置空气干燥一到两分钟。使用平头镊子将带有网格的盖玻片转移至预热至130摄氏度的加热板上。将载网置于玻璃培养皿的皿盖内覆盖，孵育20分钟。随后，为用丙酮洗涤甲基丙烯酸甲酯（MMA），将整个盖玻片转移至含有15毫升丙酮的培养皿中，孵育30分钟。然后使用洁净的玻璃刻度移液管，将丙酮转移至废液容器中。使用另一支洁净的玻璃刻度吸管，向培养皿中加入 15 毫升新鲜丙酮，孵育 30 分钟。经过三次丙酮洗涤后，移除丙酮，并使用一支洁净的玻璃刻度吸管，将其替换为 15 毫升异丙醇。然后使用镊子将载网从异丙醇中小心取出，置于洁净的盖玻片上晾干。接着，将带有石墨烯涂层载网的盖玻片放置于设定为100摄氏度的加热板上，加热10分钟，以蒸发残留的有机物。使用反向镊子，轻轻将载网转移至紫外臭氧清洗仪的洁净照射区域，确保石墨烯涂层面向上。滑动关闭照明区域并打开仪器。将时间旋钮设定为指定的处理时间，以开始对载网进行紫外臭氧处理。最后，在处理后的载网上进行冷冻电子显微镜样品的 plunge 冷冻。

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