利用人皮肤成纤维细胞展示自组装细胞片培养及手动构建类肌腱/韧带三维类器官 关键词：自组装细胞片，三维类器官，人皮肤成纤维细胞，肌腱样组织，韧带样组织
2024年6月21日
本文展示了一种三步法类器官模型（二维[2D]扩增、二维[2D]刺激、三维[3D]成熟），该模型为肌腱基础研究提供了一种有前景的工具，也为肌腱组织工程提供了一种潜在的无支架方法。
我们采用商品化的正常人真皮成纤维细胞作为细胞来源，演示了先前已发表并实施的三步类器官培养方案。该三维类器官模型在组织工程和再生医学应用中具有多项优势，能够高度模拟肌腱组织的细胞组成与结构排列，以及细胞间和细胞与基质间的相互作用。
已建立的三维肌腱/韧带类器官方法可作为肌腱基础与应用研究的模型，适用于以下领域：体外成腱分化、疾病机制、药物测试以及无支架肌腱组织工程。首先，离心经胰蛋白酶消化的正常人皮肤成纤维细胞，然后从离心管中移除上清液。
向沉淀中加入预热的含补充剂的DMEM低糖培养基，充分混匀以重悬细胞。将正常人皮肤成纤维细胞接种至10厘米的贴壁细胞培养皿中。轻轻交叉摇动培养皿。
经过14天的二维刺激后，当细胞达到融合状态时，吸除培养基，并使用细胞刮棒轻轻且快速地将形成的细胞片从培养皿上分离。同时，将细胞片卷成类三维棒状类器官。将正常人真皮成纤维细胞类器官转移至直径10厘米的非黏附性培养皿中。
使用直尺测量类器官的伸长程度，然后用镊子夹住类器官的一侧，轻轻拉伸类器官，使其轴向伸长约10%。用镊子手动将金属针从类器官两侧边缘压入塑料培养皿中，以固定类器官。最后，为进行三维成熟培养，在孵育前加入10毫升预热的含补充剂的DMEM高糖培养基。三维类器官在三维成熟阶段第0天和第14天的大体形态均呈闪亮的白色外观。
随着时间推移，类器官发生收缩并显得更为致密。使用H对类器官的形态进行评估&E 染色。在第一天，类器官显示出不连续的层状结构，主要由细胞构成，周围包裹着少量基质。
各层内的细胞表现出呈圆形且大小不一的细胞核。在第14天，嗜酸性信号明显增强，表明基质沉积及层次融合。此外，类器官显示出存在细胞排列有序的区域。
大多数细胞核具有相似的大小，偶尔呈拉长状。
概述
本研究提出了一种用于肌腱研究的三步类器官模型，利用正常人真皮成纤维细胞。该模型为肌腱组织工程提供了一种无支架的方法，并能高度模拟肌腱组织的特性。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 再生医学
- 类器官模型
背景
- 类器官模型为研究复杂组织提供了平台。
- 正常人皮肤成纤维细胞可作为可行的细胞来源。
- 三维类器官模型有助于深入理解组织间的相互作用。
- 无支架方法在组织工程中具有优势。
研究目的
- 建立用于肌腱研究的三步类器官模型。
- 探索其在药物测试和疾病机制研究中的应用。
- 提供一种无支架的肌腱组织工程方法。
使用的方法
- 使用正常人皮肤成纤维细胞。
- 实施三步法类器官培养方案。
- 对胰蛋白酶消化后的成纤维细胞进行离心。
- 评估细胞组成与组织结构。
主要结果
- 三维类器官模型高度模拟肌腱组织。
- 在再生医学应用中展现出显著优势。
- 促进了对成腱机制的体外研究。
- 为无支架肌腱组织工程提供了平台。
结论
- 已建立的类器官模型是肌腱研究的一种有前景的工具。
- 该模型在组织工程应用中具有重要意义。
- 这一方法可增进对肌腱生物学与病理学的理解。
常见问题
行业重要性概述
标准化的三维肌腱/韧带类器官模型通过构建具有生理相关性的无支架系统，解决了肌肉骨骼系统药物研发中早期靶点验证和机制性风险评估的关键空白。该方法可提高疾病建模和化合物评价的预测可靠性，直接影响转化医学研究和组织工程领域的研发布局。该模型具有良好的可重复性和可调节性，可作为肌腱生物学领域基础与应用研发的可重复使用平台。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 可在受控的三维环境中研究腱系分化及肌腱特异性通路机制。
- 通过重建天然的细胞间及细胞与基质间的相互作用，支持生物学层面的风险评估。
- 有助于肌腱与韧带修复策略中的功能靶点验证。
筛选与检测方法开发
- 提供了一种稳健的、富含细胞外基质的类器官系统，用于对药物在类腱组织上的作用进行定量评估。
- 通过明确的三步操作流程，提高检测方法的可重复性与标准化水平。
- 支持制备经过验证的生物学模型，用于后续筛选及机制研究。
转化与临床前研究
- 提供一种与疾病相关的体外建模系统，用于研究肌腱损伤与修复过程。
- 支持转化性生物标志物的发现及再生治疗策略的临床前评估。
- 通过维持与人体肌腱生物学相关的组织结构和力学特性，在发现研究与临床前验证之间建立桥梁。
流程与工作流整合
该3D类器官方案可融入从发现到临床前的研究连续体，支持肌腱生物学中的早期假设验证、先导物识别及转化研究。
- 发现生物学：推动肌腱细胞分化和细胞外基质组织的假设驱动型研究。
- 筛选：提供可重复、定量的结果，用于化合物和生物材料的评估。
- 分析：可在特定条件下检测形态学、细胞及基质的变化。
- 转化研究：契合无支架、生理相关性肌腱模型在临床前研究中的需求。
- 企业级复用：建立标准化且可灵活调整的平台，支持持续的研发及跨项目应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肌腱研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：促进研发团队之间的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为决策提供依据，优化组织工程研发管线中的资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的肌腱修复与再生项目的优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养和组织工程实验方案的专业知识。
- 需要具备标准细胞培养仪器和组织学分析工具的使用权限。
- 要求跨团队标准化操作，以确保类器官生成与评估的可重复性。
- 可适应于其他细胞来源，以拓展模型的适用范围。
- 可能需要进一步优化，以实现动态机械刺激或特定转化研究终点的需求。
