Name: 评估植物中典型三唑类农药代谢物的细胞毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解利用植物愈伤组织培养结合人源细胞系评估三唑类农药代谢物细胞毒性的新方法。该方案通过整合植物载体与人类细胞模型，为农药代谢物毒性研究提供了更全面的评估策略。

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本研究受到国家自然科学基金（21976160）和浙江省公益技术应用研究项目（LGF21B070006）的资助。
&#160; &#160; &#160;

1. 胡萝卜愈伤组织的分化
注意：胡萝卜愈伤组织分化的详细实验方案已在先前的研究中描述过12。以下是简要说明。
<ol>
	<li>将春化处理的种子用75%乙醇表面灭菌20分钟，随后用20% H2O2处理20分钟，再用蒸馏水至少洗涤3次。</li>
	<li>将种子播种于不含激素的琼脂固化（1% w/v）Murashige和Skoog（MS）培养基（pH = 5.8，121 °C高压灭菌）上，在26 °C、16小时光照周期（光强350 µmol/m2s）条件下培养15天，以获得幼苗。</li>
	<li>将幼苗的下胚轴和子叶切割成约0.5 cm的小段作为外植体，置于含有1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（生长素类似物）和0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（细胞分裂素）的MS培养基中，在26 °C避光条件下培养3至4周，以诱导愈伤组织形成。</li>
	<li>用解剖刀和镊子收集直径约1 cm、质地致密的愈伤组织。</li>
</ol>
2. 农药处理胡萝卜愈伤组织
<ol>
	<li>在无菌MS培养基中分别溶解10 mg的氟硅唑、啶菌恶唑、戊唑醇和丙环唑，定容至100 mL，终浓度为100 mg/L（pH值为5.6–7.0）。 
	注：所测试农药的处理浓度选择为对Caco-2细胞半数抑制浓度（IC50）最大值的50%。</li>
	<li>在无菌条件下，将3 g胡萝卜愈伤组织（来自步骤1.4）与10 mL已配制的农药溶液（来自步骤2.1）混合于玻璃烧瓶中。</li>
	<li>在无菌条件下，将3 g胡萝卜愈伤组织（来自步骤1.4）与10 mL无菌MS培养基混合于玻璃烧瓶中。 
	注：所有玻璃烧瓶均经过高压灭菌处理。</li>
	<li>将胡萝卜愈伤组织（来自步骤2.2和2.3）在130 rpm、26 °C条件下避光振荡培养72 h。 
	所有处理均设三个重复。</li>
	<li>培养72 h后，使用玻璃纤维滤膜（0.45 µm）过滤收集愈伤组织，并用超纯水洗涤3次。</li>
	<li>将愈伤组织在-55 °C条件下冷冻干燥，然后使用高通量组织研磨仪在70 Hz频率下均质化3 min。</li>
</ol>
3. 胡萝卜愈伤组织的化学提取
<ol>
	<li>在离心管（10 mL）中，将0.2 g冷冻干燥愈伤组织的研磨粉末与3 mL乙腈混合。</li>
	<li>涡旋振荡离心管8分钟，然后在150 W、40 kHz条件下超声处理5分钟。</li>
	<li>在4 °C、8,000 × g 条件下离心10分钟后，用移液器收集上清液。</li>
	<li>重复提取步骤3次，并将提取液合并至一支洁净的离心管（10 mL）中。</li>
	<li>使用氮吹浓缩仪在40 °C下将合并的提取液浓缩至完全干燥。</li>
	<li>用1 mL含0.3%二甲基亚砜（DMSO）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）重新溶解步骤3.5所得提取物残渣。 
	注意：步骤3.6中的残渣来源于农药处理的愈伤组织提取物（来自步骤2.2）。</li>
	<li>用1 mL含0.3% DMSO的DMEM重新溶解步骤3.5所得提取物残渣，并分别在4支不同的试管中溶解1 mg的氟硅唑、啶菌恶唑、戊唑醇和丙环唑。 
	注意：步骤3.7中的残渣来源于空白愈伤组织的提取物（来自步骤2.3）。 
	注意：DMEM中添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（青霉素和链霉素）。</li>
</ol>
4. Caco-2 细胞的复苏
注意：Caco-2 细胞实验中涉及的所有试剂和材料均经高压灭菌 20 分钟，并在紫外线下灭菌 2 小时。
<ol>
	<li>从液氮罐中取出冻存管（储存冷冻细胞），迅速放入37 °C水浴中，持续振荡以融化冻存液。 
	注意：振荡时避免水浸没冻存管盖。</li>
	<li>冻存液完全融化后，用75%酒精对冻存管表面进行消毒。用移液器迅速将细胞悬液转移至无菌离心管中。</li>
	<li>在4 °C、1,000 × g 条件下离心3 min后，弃去冻存管中的上清液。加入1 mL DMEM，轻轻敲击并振荡以重悬细胞。</li>
	<li>用移液器将细胞悬液（来自步骤4.3）转移至玻璃培养瓶中。向玻璃培养瓶中加入5 mL DMEM，并轻轻振荡培养瓶使细胞均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。 
	注意：步骤4.2–4.4在超净工作台内进行。</li>
</ol>
5. Caco-2 细胞传代
<ol>
	<li>当细胞密度超过80%时，从培养箱中取出玻璃培养瓶，弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并均匀铺布，确保与细胞充分接触。</li>
	<li>在显微镜（100倍放大）下观察，当细胞由贴壁形态收缩为微小圆形但尚未悬浮时，移除消化液，轻轻敲击培养瓶壁以促进细胞脱落。</li>
	<li>加入2 mL DMEM，重复冲洗培养瓶壁10次，轻轻敲击瓶壁，将1 mL细胞悬液转移至另一玻璃培养瓶中。</li>
	<li>向玻璃培养瓶中加入5 mL DMEM，轻轻敲击瓶壁，使细胞均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，每24小时更换一次新鲜DMEM，直至细胞密度超过80%。</li>
	<li>重复细胞传代操作，直至收获足够数量的细胞（约2 × 106）用于后续暴露实验。 
	注意：步骤5.1–5.5在超净工作台中进行，细胞数量通过血细胞计数板测定19。</li>
</ol>
6. Caco-2 细胞的暴露处理
<ol>
	<li>从培养箱中取出玻璃培养瓶（来自步骤 5.7），并重复步骤 5.1–5.4 以收集细胞。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶壁，使细胞均匀分散，然后将细胞悬液转移至离心管（15 mL）中。</li>
	<li>用 DMEM 培养基结合流式细胞术将细胞悬液（来自步骤 6.2）稀释，使细胞密度约为 1 × 105 个细胞/mL。轻轻敲击培养瓶壁，使细胞均匀分布。</li>
	<li>在 96 孔板的外周孔中加入 100 µL PBS，以防止因边缘效应导致培养基蒸发。 
	注意：持续轻敲离心管管壁，以保持细胞悬液均匀。</li>
	<li>在 96 孔板的左侧孔中加入 100 µL 细胞悬液（来自步骤 6.3），静置 10 分钟。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 48 小时。</li>
	<li>培养 48 小时后，从培养箱中取出 96 孔板，并弃去培养基。</li>
	<li>通过在每个孔中加入 100 µL 溶液（来自步骤 3.6）设置农药代谢物组。 
	注意：在步骤 6.8 的每个孔中，含有由 0.1 mg 母体化合物生成的农药代谢物。</li>
	<li>通过在每个孔中加入 100 µL 溶液（来自步骤 3.7）设置农药母体化合物组作为对照。 
	注意：在步骤 6.9 的每个孔中，含有 0.1 mg 农药母体化合物。</li>
	<li>通过在每个孔中加入 100 µL 含 0.3% DMSO 的 DMEM 培养基设置空白对照组。每组使用六个孔（步骤 6.8–6.9）。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时。 
	注意：步骤 6.1–6.5 和 6.7–6.10 均在超净工作台中进行。</li>
</ol>
7. 细胞活力的评估
<ol>
	<li>从培养箱中取出96孔板（来自6.11步骤），在暴露24小时后弃去培养基，用PBS洗涤细胞2次。</li>
	<li>每孔加入100 µL DMEM，然后加入10 µL CCK-8试剂。轻轻振荡培养板，使试剂均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育4小时。</li>
	<li>孵育4小时后，从培养箱中取出96孔板，使用荧光分光光度计在450 nm处测定光吸收值（OD）。</li>
	<li>按以下公式计算细胞活力： 
	细胞活力（%）= (ODexperimental&#160;group&#160; - ODDMEM) / (ODcontrol - ODDMEM) × 100%。 
	注意：步骤7.1–7.2在超净工作台中进行。</li>
</ol>

Estimating the Integral Metabolite Cytotoxicity of Triazole Pesticides in Plants

<ol><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+halogenated+organic+compounds+%28HOCs%29+into+peanut+and+corn+during+the+whole+life+cycle+grown+in+an+agricultural+field%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field.</a> Environ Pollut. 263, 114400(2020).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+metals+in+e-waste+lead+to+serious+health+risk+through+consumption+of+rice+growing+near+an+abandoned+e-waste+recycling+site%3A+Comparisons+with+PBDEs+and+AHFRs%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs.</a> Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).</li>
<li>Liu, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrabromobisphenol-A%2FS+and+nine+novel+analogs+in+biological+samples+from+the+Chinese+Bohai+Sea%3A+Implications+for+trophic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer.</a> Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).</li>
<li>Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+pollution+of+electronic+waste+recycling+in+India%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review.</a> Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+accumulation+and+transformation+of+brominated+and+organophosphate+flame+retardants%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review.</a> Environ Pollut. 288, 117742(2021).</li>
<li>Sandermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+plant+metabolism+of+xenobiotics%3A+the+%27green+liver%27+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenetics%22%5BJournal%5D)">Higher plant metabolism of xenobiotics: the 'green liver' concept.</a> Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).</li>
<li>Zhang, J. J., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+detoxification+of+pesticides+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Metabolism and detoxification of pesticides in plants.</a> Sci Total Environ. 790, 148034(2021).</li>
<li>Debenest, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+of+a+brominated+flame+retardant+%28tetrabromobisphenol+A%29+and+its+derivatives+to+aquatic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+C%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms.</a> Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).</li>
<li>McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbially+mediated+O-methylation+of+bisphenol+A+results+in+metabolites+with+increased+toxicity+to+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo.</a> Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+metabolism+of+2%2C4-Dibromophenol+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants.</a> J Vis Exp. (192), e65089(2023).</li>
<li>Zucco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inter-laboratory+study+to+evaluate+the+effects+of+medium+composition+on+the+differentiation+and+barrier+function+of+Caco-2+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Atla-Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines.</a> Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).</li>
<li>Eisenbrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+in+vitro+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Methods of in vitro toxicology.</a> Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).</li>
<li>Sambuy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier%3A+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+translocation%2C+and+subcellular+distribution+of+three+triazole+pesticides+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res%22%5BJournal%5D)">Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice.</a> Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).</li>
<li>Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+triazole+pesticides+on+tillage+soil+microbial+populations+and+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes.</a> Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+but+unrecognized+risk+of+acceptable+daily+intake+dose+triazole+pesticides+exposure-bile+acid+disturbance+induced+pharmacokinetic+changes+of+oral+medication%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication.</a> Chemosphere. 322, 138209(2023).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+analysis+using+trypan+blue%3A+manual+and+automated+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案旨在通过结合植物愈伤组织和人类细胞模型，评估三唑类农药代谢物对植物的整体细胞毒性。该方案的关键步骤是植物愈伤组织和Caco-2细胞的培养。关于植物愈伤组织培养中最困难的部分及相关建议，我们已在先前的研究中提供12。此处需特别指出，Caco-2细胞培养中最困难的部分是细胞维持，因为细胞容易受到污染。因此，必须确保细胞实验中使用的所有试剂和材料均经过高压灭菌和紫外照射灭菌，且所有操作均应在超净工作台内进行。
在植物中评估污染物的风险时若忽略其相应的代谢产物，可能导致风险被低估。然而，植物中污染物的代谢产物极为复杂，因此难以全面获取其毒理学信息。鉴于这些代谢产物在植物中共同存在，并且在食物链传递过程中会共同暴露于动物或人类，本研究将所有代谢产物视为一个整体。通过结合植物愈伤组织与人类细胞模型，实现了对植物中污染物代谢产物整体细胞毒性的评估，避免了鉴定和分离植物代谢产物的复杂步骤。然而，该方法仍存在一些局限性。目前仅开展了细胞活力检测，未来还需进一步探索氧化应激、炎症效应和内分泌干扰效应等其他毒理学测试。此外，本方法仅测试了胡萝卜愈伤组...

农田中生长的农作物可能暴露于源自人类活动的各种有机污染物中1,2。这些污染物可被植物吸收，并通过食物链进一步对生态系统和人类健康造成威胁3,4。植物体内的外源性物质可能经历一系列生物转化过程，例如I相和II相代谢5，从而生成多种代谢产物。根据植物中的“绿色肝脏”概念，植物代谢能够降低外源性物质的毒性6,7。然而，已有研究表明，某些代谢产物的毒性可能高于其母体化合物。例如，四溴双酚A（TBBPA）的脱溴产物和双酚A（BPA）的O-甲基化产物已被证实比其母体化合物更具毒性8,9，而脱溴和O-甲基化正是植物中主要的I相代谢途径。因此，仅基于植物中外源污染物母体的毒性评估并不准确，还应考虑其相应的代谢产物。
植物中外源性物质的代谢产物极为复杂10,11，难以对其进行全面的鉴定与分离。此外，已鉴定代谢产物的标准品仅有少数可获得。因此，所有代谢产物的毒理学数据尚不完善，阻碍了对植物中污染物进行综合毒性评估。本研究提出一种策略，在毒理学测试中将污染物代谢产物视为一个整体，以评估其在植物中的综合毒性，从而为污染物在植物中精确的毒性评价提供新数据。我们之前的研究已表明，植物愈伤组织培养为获取植物中外源性物质的代谢产物提供了一条简便有效的途径12。因此，本研究采用植物愈伤组织培养方法生成植物中污染物的代谢产物，随后进行化学提取，并利用人源细胞系开展毒理学测试。肠道是外源性物质暴露于动物和人类后的直接靶器官之一。Caco-2细胞系已被证实是体外研究外源性物质肠道行为与毒性的最佳模型in vitro13,14,15。因此，本研究选用Caco-2细胞模型。
三唑类农药是一类广谱杀菌剂，已广泛应用于农业生产16。其在农田中的残留污染问题日益受到关注17,18。本研究选取了四种常用的三唑类农药——氟硅唑、烯唑醇、戊唑醇和丙环唑，作为典型的污染物。胡萝卜被选为本研究中即食新鲜蔬菜的代表植物。将胡萝卜愈伤组织初始暴露于浓度为 100 mg/L 的待测农药中。暴露 72 小时后，提取其代谢产物，并利用 Caco-2 细胞系评估其细胞毒性。该方法可便捷地推广应用于评估植物中其他类型污染物代谢产物的整体细胞毒性。

<table><tbody><tr><td>2,4-二氯苯氧乙酸</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>6-苄氨基嘌呤</td><td>WAKO</td><td>0.5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>1269101-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工气候培养箱</td><td>宁波东南实验室设备有限公司</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 细胞</td><td>诺阳生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCK8 试剂</td><td>南京建成生物工程研究所，中国</td><td>G021-1-3</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Labtrip</td><td>HWJ-3-160</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Solarbio 生命科学</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>烯唑醇，98.7%</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>83657-24-3</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Solarbio 生命科学</td><td>11965-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海精密仪器有限公司</td><td>FA1004B</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Cellmax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>氟硅唑，98.5%</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>85509-19-9&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高通量组织研磨仪</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>MS 培养基（Murashige &amp; Skoog 培养基）</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>氮吹浓缩仪</td><td>奥盛</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio 生命科学</td><td>P1022-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Solarbio 生命科学</td><td>P1400-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>丙环唑，100%</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>60207-90-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Research plus 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>10-1000 &amp;mu;L</td><td></td></tr><tr><td>小手指胡萝卜种子（Daucus carota var. sativus）</td><td>寿光种业有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>上海博迅医疗设备有限公司</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>戊唑醇，100%</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>107534-96-3</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Solarbio 生命科学</td><td>T1300-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>紫外灭菌超净工作台</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>无锡莱普仪器设备有限公司</td><td>BV-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

评估典型三唑类农药代谢物对植物的细胞毒性

Assessing Cytotoxicity of Metabolites of Typical Triazole Pesticides in Plants

由于人类活动，多种有机污染物被释放到环境中。这些污染物可被农作物吸收，通过食物链对生态系统和人类健康造成潜在威胁。污染物在植物体内的生物转化会产生一系列代谢产物，其毒性可能高于母体化合物，这意味着在进行毒性评估时应考虑这些代谢产物。然而，植物中污染物的代谢产物极为复杂，难以全面获取所有代谢产物的毒理学信息。本研究提出一种策略，在毒理学测试中将污染物代谢产物作为一个整体进行处理，以评估其综合细胞毒性。三唑类农药是一类广谱杀菌剂，已广泛应用于农业生产中，其在农田中的残留污染问题日益受到关注。因此，本研究选取氟硅唑、烯唑醇、戊唑醇和丙环唑四种三唑类农药作为受试污染物。通过用上述三唑类农药处理胡萝卜愈伤组织，生成相应的代谢产物。处理72小时后，提取胡萝卜愈伤组织中的农药代谢产物，并利用Caco-2细胞系进行毒理学测试。结果显示，受试农药在胡萝卜愈伤组织中的代谢产物对Caco-2细胞活力无显著抑制作用（P>0.05），表明这些农药代谢产物无明显细胞毒性。该方法为评估植物中污染物代谢产物的细胞毒性提供了新途径，有望为精准毒性评估提供有价值的科学数据。

图1 表示在胡萝卜愈伤组织中生成、提取及评估农药代谢物的示意图。在 图2 中，展示了受试农药的吸收与代谢动力学曲线，从中可以看出，培养基中农药浓度呈指数下降，而胡萝卜愈伤组织中的浓度则开始上升，在4或8小时达到峰值，随后逐渐下降。这些结果表明，农药可被胡萝卜愈伤组织快速吸收并转化。愈伤组织培养体系中农药的时间回收率如 图3 所示。经过72小时的培养后，仅剩余8.3%-11.0%的农药，表明大部分农药已被转化为代谢物。
根据受试农药的吸收与代谢动力学（图2），在72 h孵育后，提取液中残留的农药母体浓度低于10 mg/L。图4显示了Caco-2细胞在暴露于受试农药后的剂量-反应曲线。因此，提取液中的农药母体不会影响细胞活力。
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该方案描述了一种评估三唑类农药代谢物在植物中整体细胞毒性的新方法。

由于人类活动，多种有机污染物被释放到环境中。这些污染物可被农作物吸收，……

本方案描述了一种评估三唑类农药代谢物在植物中整体细胞毒性的新方法。利用植物愈伤组织培养产生植物体内的代谢物，随后使用人源细胞系进行毒理学检测，以评估这些代谢物的整体细胞毒性。植物中外源化合物的代谢物极为复杂，仅有少数代谢产物可被分离获得。因此，代谢产物的毒理学负债有限，这不利于全面的毒性评估。本方案提出了一种策略，用于评估三唑类农药在植物中代谢产物的整体细胞毒性。在本方案中，结合植物载体和人类细胞模型，实现对三唑类农药在植物中代谢产物的整体细胞毒性评估。这避免了代谢物复杂的提取与分离步骤，从而为精确、可靠的评估提供了新方法。首先，在无菌条件下，用不同的三唑类农药处理收集到的胡萝卜愈伤组织。具体操作为：在不同的玻璃烧瓶中，分别将三克胡萝卜愈伤组织与10毫升用MS培养基配制的每种农药溶液混合。另取3克胡萝卜愈伤组织，与10毫升无菌MS培养基混合于另一玻璃烧瓶中。将制备好的胡萝卜愈伤组织样品置于130 RPM、26°C条件下避光培养72小时。所有处理均设三个重复。孵育结束后，使用0.5微米玻璃纤维滤膜，通过过滤法从培养基中收集胡萝卜愈伤组织。用超纯水洗涤愈伤组织三次。最后，在-55摄氏度下使用冷冻干燥机对愈伤组织进行冷冻干燥，然后在70赫兹条件下使用高通量组织研磨仪均质化处理三分钟。所有农药在培养基中的浓度均呈指数级下降。而在胡萝卜愈伤组织中，农药浓度则开始上升，在4或8小时达到峰值，随后逐渐降低。这些结果表明，农药被胡萝卜愈伤组织迅速吸收并发生转化。愈伤组织培养系统中农药的时序回收结果显示，经过72小时孵育后，仅剩8.3%至11%的农药残留，表明大部分农药已被转化为代谢产物。首先，取0.2克经冷冻干燥并用农药处理的胡萝卜愈伤组织样品，将其研磨成粉后，与3毫升乙腈混合于10毫升离心管中。将离心管涡旋振荡8分钟，随后在150瓦、40千赫条件下超声处理5分钟。接下来，将离心管在8,000 G、4摄氏度条件下离心10分钟，然后用移液器收集上清液。使用氮吹浓缩仪在40摄氏度下将合并的提取物浓缩至干燥。将提取物残渣重新溶解于1毫升含有0.3% DMSO的DMEM中，得到农药代谢物暴露溶液。以类似方式，将空白愈伤组织样品提取物的残渣重新溶解于1 mL含有0.3%DMSO的DMEM中。然后，在含有空白样品残渣溶液的不同试管中，分别溶解1毫克所用的每种农药，以制备母体农药暴露溶液。在细胞培养至密度超过80%后，进行细胞传代。弃去培养基后，用PBS洗涤细胞三次。然后向培养瓶中加入1毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，并轻轻晃动使其均匀分布，确保与细胞充分接触。在100倍显微镜下观察，当细胞由贴壁形态变为细小的圆形时，移除消化液。轻柔敲击培养瓶壁，使细胞脱落。加入 2 mL DMEM，重复冲洗培养瓶壁 10 次。轻轻敲击培养瓶壁，将 1 mL 细胞悬液转移至另一玻璃培养瓶中。向每个玻璃培养瓶中加入 5 mL DMEM。轻轻敲击培养瓶壁，使细胞均匀分散。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞密度超过80%。待收获足够数量的细胞后，进行暴露试验。再次轻轻敲击含细胞的培养瓶壁，使细胞分布均匀，随后将细胞悬液转移至15毫升离心管中。用DMEM培养基结合细胞计数，将细胞悬液稀释至所需细胞密度。轻轻敲击培养瓶壁，以确保细胞均匀分布。接着，向96孔板的外周孔中加入100微升PBS，以防止因边缘效应导致培养基蒸发。向培养板左侧的孔中加入100微升细胞悬液，静置10分钟。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育48小时。从孵箱中取出96孔板后，弃去培养基。为建立农药代谢物组，向每个指定的孔中加入100微升不同配制的农药残留暴露溶液；为建立农药原药组，作为对照，向每个指定的孔中加入100微升不同配制的母体农药暴露溶液。设置空白对照组时，向每个指定的孔中加入100微升含有0.3% DMSO的DMEM培养基。将细胞置于37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。首先，将细胞在代谢物提取液中孵育24小时后，从培养箱中取出96孔板。弃去培养基，用PBS对细胞洗涤两次。每孔加入100微升DMEM，随后每孔加入10微升CCK8试剂。通过轻轻摇动培养板确保细胞均匀分布。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。最后，使用荧光分光光度计在450纳米处进行光密度测定。农药代谢物组与对照组细胞活力之间无显著差异，表明农药代谢物无细胞毒性。农药母体组的细胞活力显著低于对照组，表明具有明显的细胞毒性。

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