Name: 小鼠白内障手术建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 学习小鼠白内障手术建模方法，研究晶状体上皮细胞对手术损伤的反应机制。该技术揭示alpha v beta eight整合素在TGF beta激活和纤维化中的关键作用，为预防后囊膜混浊提供新治疗靶点。

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本工作由国家眼科研究所（EY015279 和 EY028597）和特拉华州 INBRE（P20 GM103446）资助。

本方案已获得特拉华大学机构动物护理和使用委员会（协议号：#1039-2021-1）的批准。根据眼科和视觉研究中动物使用协会研究视觉与眼科学（ARVO）的规定24，所有眼部存活手术只能在单眼进行。有关本方案中所用试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。提取晶状体纤维&#160;和缝合&#160;的替代方法分别如图2&#160;和&#160;图3所示。
1. 动物
<ol>
	<li>使用任何野生型或基因修饰的实验小鼠品系，其眼睛需具有完整晶状体，适用于本实验操作。
	<ol>
		<li>可采用 C57BL/6 小鼠作为起始品系，因其在形态学和分子水平上的反应均具有高度可重复性25,26。 
		注意：可使用 C57BL/6 或其他小鼠品系。在本视频方案中，选用 FVB 小鼠以获得更清晰的视觉演示效果。</li>
		<li>在其他小鼠品系上研究突变体反应时，应设置品系匹配的对照组。 
		注意：经过练习后，即使小鼠晶状体存在白内障，只要晶状体囊完整且晶状体未发生明显液化，也可进行本操作。参见针对转录因子 Sip1 晶状体条件性敲除小鼠的研究27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可在任一性别的小鼠上进行本手术操作，适用年龄范围为8周龄至24月龄25,26。
	<ol>
		<li>经过训练后，也可在更年幼的小鼠（眼睑开启后）上实施该手术，但由于眼球显著更小，操作难度会增加。</li>
		<li>对老年小鼠进行手术时需格外谨慎，因其对麻醉的耐受性较低25,26。 
		&#8203;注意：老年小鼠在手术反应中的性别差异更为明显26。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 溶液与手术器械的准备
<ol>
	<li>准备麻醉剂和镇痛剂、散瞳滴眼液、无菌一次性手术刀、#5 杜蒙特镊子、2-110 缝合镊、针头（26 G 1/2 和 27 G 45° 弯头分液针尖 1&#34;）、注射器以及平衡盐溶液（BSS）。</li>
	<li>在高压灭菌器中对手术器械进行灭菌。</li>
</ol>
麻醉前准备
<ol>
	<li>麻醉前，向接受手术的眼睛滴加一滴1%阿托品和一滴2.5%去氧肾上腺素，以扩大瞳孔（见图1A）。对未手术眼涂抹眼用软膏，防止角膜表面干燥。 
	注：根据ARVO关于动物在眼科研究中使用的声明24，仅允许单眼进行可存活手术，另一只眼保持未处理状态，以确保动物保留视力。因此，可存活手术始终为单侧操作；然而，可在动物处死前对对侧未手术眼进行操作，以建立动物自身匹配的“零时间点”对照。</li>
	<li>确保眼药水不会沿小鼠面部流下并进入鼻腔，以免阻碍其呼吸。</li>
	<li>使用无菌26 G 1/2针头，抽取无菌BSS溶液至注射器中。将注射器连接一个无菌27 G、45°弯曲、钝头、1英寸长的分配尖端（下文简称分配尖端）。</li>
</ol>
4. 麻醉
<ol>
	<li>滴用眼药水后，通过腹腔注射赛拉嗪/氯胺酮/乙酰丙嗪溶液（35 mg/kg、80 mg/kg 和 0.5 mg/kg）对小鼠进行麻醉（图1B）。 
	注意：除非可使用专用的鼻罩以方便接触手术所需的眼部区域，否则吸入麻醉可能无法实施。</li>
</ol>
5. 做切口
<ol>
	<li>当小鼠完全处于麻醉状态（通过脚趾夹捏反射消失来判断）且瞳孔已完全散大（2 mm）时（图4A），小鼠已准备好进行手术。
	<ol>
		<li>将麻醉后的小鼠转移至复合式解剖光学显微镜的载物台上。使用加热垫以确保小鼠具有适当的体温调节，并使用无菌手术巾进行覆盖。</li>
		<li>在解剖显微镜下以10x–20x放大倍数观察眼球（具体设备信息见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌手术刀在角膜中央做1–1.5 mm的切口。确保切口穿透角膜并切开晶状体前囊（图1C和图4B）。</li>
</ol>
6. 将晶状体纤维与囊袋分离
<ol>
	<li>握住带有分配尖端的注射器，其中含有无菌BSS，轻轻挤出一滴BSS至角膜上方，润湿表面以便后续操作。</li>
	<li>将晶状体纤维团块与晶状体囊分离。
	<ol>
		<li>将分配尖端通过中央角膜切口插入晶状体囊切口，然后在缓慢释放BSS的同时，轻柔地以环形运动移动针头，以分离晶状体上皮细胞与纤维细胞之间的顶端-顶端连接（水分离法），最终将晶状体纤维团块排出（图1D）。</li>
		<li>在大多数情况下，纤维团块在此过程中会逐渐黏附于分配尖端（图2A）。若发生此情况，应轻柔地将分配尖端从眼内取出，并用无菌毛巾清洁以去除组织。重复此步骤，直至所有晶状体纤维细胞被清除。</li>
		<li>或者，可使用显微镊子（Dumont 5号）取出晶状体核（图2B）。若采用此方法，需注意原始角膜切口直径应大于晶状体核直径，以确保顺利取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无菌BSS冲洗晶状体囊，以清除任何残留的纤维组织。</li>
	<li>通过显微镜观察晶状体囊透明/玻璃样的外观，确认其仍保留在眼内（图1E 和 图4C）。</li>
</ol>
7. 充盈前房并缝合角膜切口
<ol>
	<li>通过切口向眼前房注入BSS，使前房充盈至正常深度。
	<ol>
		<li>向BSS中添加感兴趣的信号通路抑制剂或激活剂，以检测其在晶状体损伤反应中的作用12,15. 
		注意：也可对动物进行全身性给药使用通路抑制剂，具体是否需要取决于药物代谢动力学，因为在手术后房水循环重新建立的过程中，药物的代谢速率可能影响治疗效果15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用10-0尼龙线以方结缝合角膜切口&#160;使用锥形弯曲的5.3 mm 1/2c针头（图1F 和 图 4D-F).
	<ol>
		<li>在切口的中央部分放置一个方结缝合线，或在原始切口的上半部和下半部各放置一个方结缝合线（参见 图3缝合针数取决于角膜切口的长度。</li>
		<li>不要同时刺穿两个角膜瓣。应使用非优势手的镊子夹住一个角膜瓣，将针/尼龙线穿入。当角膜一侧完成穿刺后，再将针/尼龙线穿过下一个角膜瓣。使用方结缝合关闭角膜瓣。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 术后护理
注意：将局部抗生素软膏涂抹于眼部，并给予镇痛剂。小鼠不&#160;术后通常会出现痛苦迹象。如有需要，可使用缓释型布托啡诺。
<ol>
	<li>手术后立即执行以下子步骤。
	<ol>
		<li>在缝合处上方直接涂抹一滴0.5%红霉素眼膏。确保整个切口均被药膏覆盖。</li>
		<li>给予小鼠腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于放置在加热垫上的笼子中，使其从麻醉中恢复，以提供最佳的体温支持。&#160; 
	注意：需监测动物是否有创伤、痛苦或不适的迹象。一些常见表现包括手术部位感染或抓挠、缝线移位、脱毛等。</li>
</ol>
9. 监测动物恢复
<ol>
	<li>手术后监测动物的恢复情况，直至其从麻醉中苏醒。</li>
	<li>术后前3天每天检查小鼠一次。 
	注意：通常无需拆除缝线，因为小鼠要么在完全愈合前（术后2周）被处死，要么缝线会自行脱落。</li>
	<li>根据需要在术后4–8小时口服布托啡诺进行镇痛，剂量为0.5 mg/kg（混于果冻中），对于不进食的小鼠，剂量为0.1 mg/kg。或者，在手术前立即给予缓释型布托啡诺。 
	注意：在可能的情况下，应使用预先镇痛方案，但这可能需要对镇痛方案进行调整，并需经机构动物护理与使用委员会审查和批准。</li>
</ol>
10. 安乐死
<ol>
	<li>在术后预定时间处死小鼠
	<ol>
		<li>取下手术眼，以未手术眼作为对照组织；或重新麻醉动物，对先前未手术的对侧眼进行晶状体纤维细胞去除手术，然后立即处死动物（不使其从麻醉中苏醒），以提供手术即刻（零时间点）的手术对照。</li>
		<li>确保快速解剖并获取组织。 
		注意：晶状体上皮细胞（LECs）在手术后数分钟内即发生转录组变化，因此在研究LECs对手术的早期反应时，必须迅速获取组织并进行固定或冷冻处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. 对收获的晶状体组织进行进一步分析
<ol>
	<li>将获取的组织用于免疫染色、RNA测序、细胞培养或&#160;Western印迹分析12,15,23,25,26,28。理论上也可进行流式细胞术分析12，但由于小鼠晶状体中晶状体上皮细胞（LEC）数量较少（约40,000个）29，且手术后囊膜附着的细胞碎片较多，因此实际操作具有挑战性。</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>将小鼠置于密闭舱内，通过气瓶以4 L/min流速吸入CO2实施安乐死。当小鼠失去意识后，将气流速率提高至8–10 L/min，并持续暴露直至呼吸完全停止后再维持1分钟。 
		注意：可依据《美国兽医协会动物安乐死指南》或机构动物护理与使用委员会批准的指南或政策，采用适当的方法对小鼠实施安乐死。</li>
		<li>采用辅助安乐死方法（如颈椎脱位）以确保动物被彻底处死。 
		注意：Duncan实验室已研究过从术后数分钟至数月不同时相点的样本12,15,23。</li>
		<li>在小鼠被人道处死后，分离手术眼用于分析。
		<ol>
			<li>用非优势手持显微镊夹住手术眼，同时用优势手持显微剪。</li>
			<li>轻柔剪断视神经及固定眼球的肌肉。 
			注意：操作近期手术的眼球时需格外小心，相较于术后恢复时间较长的眼球，近期手术的眼球结构更为脆弱。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将分离的眼球包埋于OCT包埋剂中，用于后续冷冻切片、免疫染色及半定量共聚焦显微镜分析28,30。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离带有附着细胞的晶状体囊袋，用于RNA测序、细胞培养或Western印迹分析
	<ol>
		<li>将小鼠置于密闭舱内，通过气瓶以4 L/min流速吸入CO2实施安乐死。当小鼠失去意识后，将气流速率提高至8–10 L/min，并持续暴露直至呼吸完全停止后再维持1分钟。</li>
		<li>采用辅助安乐死方法（如颈椎脱位）以确保动物被彻底处死。</li>
		<li>若需采集术后早期时间点（术后1–2天内）的样本，可在组织提取前拆除缝线，或在角膜上另作切口以取出晶状体囊膜。 
		注意：在术后较晚时间点，缝线通常已自行脱落，因此需要重新做切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位透明的晶状体囊膜。
	<ol>
		<li>将显微镊轻柔地经角膜开口插入，夹住囊膜并将其从眼前房中取出。</li>
		<li>将囊膜置于1.5 mL微量离心管或培养皿中，用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Replicating Cataract Surgical Techniques in a Mouse Model Through LEC Extraction

<ol><li>Wormstone, I. M., Wormstone, Y. M., Smith, A. J. O., Eldred, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%3A+What%27s+in+the+bag%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification: What's in the bag.</a> Prog Retin Eye Res. 82, 100905(2021).</li>
<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+glass%3A+structural+determinants+of+eye+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li>
<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).</li>
<li>Liu, Y. C., Wilkins, M., Kim, T., Malyugin, B., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cataracts.</a> Lancet. 390 (10094), 600-612 (2017).</li>
<li>Khairallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+people+blind+or+visually+impaired+by+cataract+worldwide+and+in+world+regions%2C+1990+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (11), 6762-6769 (2015).</li>
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<li>Assil, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dropless+cataract+surgery%3A+modernizing+perioperative+medical+therapy+to+improve+outcomes+and+patient+satisfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Dropless cataract surgery: modernizing perioperative medical therapy to improve outcomes and patient satisfaction.</a> Curr Opin Ophthalmol. 32 (Suppl 1), S1-S12 (2021).</li>
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<li>Wormstone, I. M., Wang, L., Liu, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 257-269 (2009).</li>
<li>Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsular+opacification%3A+a+problem+reduced+but+not+yet+eradicated%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated.</a> Arch Ophthalmol. 127 (4), 555-562 (2009).</li>
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<li>Grabitz, A. L., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus+on+molecules%3A+Smad+Interacting+Protein+1+%28Sip1%2C+ZEB2%2C+ZFHX1B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Focus on molecules: Smad Interacting Protein 1 (Sip1, ZEB2, ZFHX1B).</a> Exp Eye Res. 101, 105-106 (2012).</li>
<li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).</li>
<li>Shi, Y., De Maria, A., Lubura, S., Sikic, H., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+penny+pusher%3A+a+cellular+model+of+lens+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The penny pusher: a cellular model of lens growth.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 799-809 (2014).</li>
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<li>Jiang, J., Shihan, M. H., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cells+initiate+an+inflammatory+response+following+cataract+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cells initiate an inflammatory response following cataract surgery.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 59 (12), 4986-4997 (2018).</li>
<li>Mamuya, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+%CE%B1V+integrins+in+lens+EMT+and+posterior+capsular+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The roles of αV integrins in lens EMT and posterior capsular opacification.</a> J Cell Mol Med. 18 (4), 656-670 (2014).</li>
<li>Manthey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zeb+proteins+%CE%B4EF1+and+Sip1+may+have+distinct+functions+in+lens+cells+following+cataract+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The Zeb proteins δEF1 and Sip1 may have distinct functions in lens cells following cataract surgery.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5445-5455 (2014).</li>
<li>Hupy, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+markers+in+mouse+lens+by+a+Smad7-based+recombinant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Suppression of epithelial to mesenchymal transition markers in mouse lens by a Smad7-based recombinant protein.</a> Chem Biol Interact. 344, 109495(2021).</li>
</ol>

Duncan 实验室已获得 Pliantx 的资金支持，以利用该手术模型测试抗 PCO 疗法。

该手术技术需要高超的小鼠操作和显微外科技能，需经过练习才能掌握。其中最难掌握的是在角膜上放置细小缝线以闭合伤口。假设实验人员从未接触过缝合操作，则建议首先使用绳子和布料进行练习，然后在小型水果上使用粗缝线练习，以掌握打外科方结所需的手部动作。接着，实验人员应在水果上练习使用手术刀做切口，并对切口进行缝合，所用的水果应逐渐变小（例如先用葡萄，再过渡到蓝莓）。此外，实验人员还需使用逐渐变细的材料（如从毛线到细绳再到头发丝）练习打方结缝合，直至能够熟练使用本实验所需的细小10-0尼龙缝线完成方结。
本文介绍了一种模拟白内障手术后晶状体上皮细胞（LECs）所感知损伤的技术，旨在阐明LECs对损伤反应的分子机制。该方法的主要优势包括：（1）LECs的损伤反应发生在活体眼球的生理环境中；（2）该小鼠模型可同时利用遗传学工具和药理学抑制剂，研究晶状体损伤反应的机制以及残留晶状体上皮细胞的表型转变过程；（3）可用于测试潜在的治疗手段，以干预LECs的损伤反应进程，从而预防后发性白内障（PCO）；（4）无需添加外源性因子（如体外激活的TGFβ），即可完整观察LECs对手术损伤的全部反应过程，包括细胞增殖、迁...

晶状体是一种高度有序且透明的组织，能够折射光线，将清晰聚焦的图像投射到视网膜上1,2,3。这一特化的器官被一层连续的基底膜（即晶状体囊）所包裹，使其与眼部其他结构相隔离。晶状体囊的前内表面附着一层晶状体上皮细胞（LECs），这些细胞在晶状体赤道区进一步分化为晶状体纤维细胞，后者构成了晶状体的绝大部分3。当晶状体因衰老、基因突变、紫外线辐射、氧化应激或眼部外伤等因素而失去透明性时，便会发生白内障4。白内障是全球范围内导致失明的主要原因之一，尤其在医疗条件较差的国家更为普遍5。目前，该疾病通常可通过超声乳化术进行有效治疗，即手术切除混浊的晶状体组织：首先去除中央部分的晶状体囊及其附着的晶状体上皮，随后使用振动探头将晶状体的细胞团块粉碎成较小碎片并吸出，最终保留一个带有部分附着赤道区LECs的囊袋结构1。术后最常用的视力恢复方法是植入人工晶状体（IOL）。
尽管白内障手术（CS）是一种高度有效且微创的白内障治疗方法，但术后眼部炎症的发生会显著影响患者的术后恢复5,6,8这种炎症可引起术后疼痛、视网膜水肿进而导致视网膜脱离，以及加重葡萄膜炎和青光眼等其他炎症性和纤维化性疾病。4,7,8,9术后白内障眼内炎症（PCS）通常采用抗炎眼药水治疗，但存在患者依从性差的问题；而无滴眼药水的白内障手术则可能导致飞蚊症发生率增加8,10,11长期来看，后囊膜混浊（PCO）的发生可能影响白内障手术（CS）的治疗效果12. PCO 发生的原因是手术后残留的晶状体上皮细胞（LECs）发生创伤愈合反应，增殖并迁移至晶状体后囊膜上&#160;数月到数年，PCS 导致继发性视觉障碍13,14.
阐明白内障手术（CS）导致这些急性和慢性反应的分子机制是该领域面临的主要挑战，因为目前大多数关于后囊膜混浊（PCO）的研究依赖于在体外通过活性转化生长因子β（TGFβ）诱导晶状体上皮细胞（LEC）转化为肌成纤维细胞12,15。利用尸体角膜在体外培养建立的人类晶状体囊袋模型能够更好地反映晶状体囊膜下空间（PCS）的生物学特性，因为LEC在其天然基底膜上进行培养，但该模型在机制研究中难以操作，无法完全模拟眼内环境，且由于不同晶状体（或供体之间）的差异而具有固有的变异性16,17。兔1,18和非人灵长类动物19,20&#160;体内白内障手术模型在一定程度上克服了上述问题，但仍难以用于深入的机制研究。值得注意的是，先前一项关于哺乳动物晶状体再生的研究发现，在小鼠中去除晶状体纤维细胞而保留晶状体上皮细胞和囊膜后，四周内可观察到显著的晶状体再生；而当整个晶状体被完全移除时，则未发生晶状体再生21,22。随后，我们对该手术方法进行了优化和简化，使其适用于研究LEC在晶状体纤维细胞去除后的急性反应，以及其后续向具有肌成纤维细胞和纤维细胞特性的混合细胞群体转化的过程。
利用这种白内障手术的小鼠模型，我们已证明晶状体上皮细胞在术后6小时（PCS）即显著重塑其转录组，产生大量促炎性细胞因子23，并在术后24小时（PCS）即开始表达纤维化标志物12,23，早于经典的TGFβ信号通路的激活。利用该模型在基因敲除小鼠中进行的机制性实验表明，晶状体上皮细胞（LECs）表达的细胞型纤连蛋白对于术后持续的纤维化反应是必需的，这可能与其在纤维化细胞外基质（ECM）组装及细胞信号传导中的作用均有关12。其他研究显示，由于αVβ8-整合素在TGFβ激活中的功能，其对于晶状体上皮细胞向肌成纤维细胞的转化至关重要；此外，该策略在发现抗后发性白内障（PCO）治疗靶点方面的潜力也得到了验证，因为αVβ8-整合素拮抗剂同样可阻断晶状体上皮细胞的上皮-间质转化（EMT）15。
本文提供了一项详细的操作方案，介绍如何在活体小鼠中去除晶状体纤维细胞（图1和&#160;图4），同时保留晶状体囊膜和晶状体上皮细胞（LEC），以模拟白内障手术后LEC的反应。&#160;

<table><tbody><tr><td>0.5% 红霉素眼膏 USP</td><td>Baush Lomb</td><td>24208-910-55</td><td></td></tr><tr><td>1% 硫酸阿托品眼用溶液</td><td>Amneal</td><td>60219-1748-2</td><td></td></tr><tr><td>1% 托吡卡胺眼用溶液 USP</td><td>Akorn</td><td>17478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>10-0 尼龙缝线</td><td>Ethicon</td><td>7707G</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 盐酸去氧肾上腺素眼用溶液 USP</td><td>Akorn</td><td>17478-200-12</td><td></td></tr><tr><td>26 G 1/2 针头 - 直头</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>5111</td><td></td></tr><tr><td>27 G 45&amp;deg; 弯曲分配尖端 1&quot;</td><td>Harfington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平衡盐溶液</td><td>Phoenix</td><td>57319-555-06</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（0.1 mg/kg）</td><td>APP Pharmaceticals</td><td>401730D</td><td></td></tr><tr><td>氯己定溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>持针器 2-110</td><td>Duckworth &amp;amp; Kent</td><td>2-110-3E</td><td></td></tr><tr><td>Noyes 剪刀，直头</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-02</td><td></td></tr><tr><td>SMZ800 Nikon 型显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性手术刀 No.11</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont 镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪/氯胺酮/乙酰丙嗪（35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg）溶液</td><td>APP Pharmaceticals</td><td>401730D</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠白内障手术建模

Modeling Cataract Surgery in Mice

白内障手术（CS）是治疗白内障的有效方法，而白内障是全球视力障碍的主要原因之一。然而，白内障手术会引起眼部炎症，长期可能导致后囊膜混浊（PCO）和/或晶状体脱位，其原因是术后晶状体上皮细胞（LECs）过度增殖并转化为肌成纤维细胞和/或异常纤维细胞所致。然而，白内障手术引发炎症和PCO的分子机制仍不明确，因为大多数 体外 模型未能重现观察到的 LECs 伤口愈合反应 体内然而，传统的白内障手术动物模型（如兔子）无法进行基因表达的遗传操作以验证相关机制。近期，本实验室及其他研究团队已成功利用转基因小鼠研究驱动炎症信号通路激活以及晶状体上皮细胞（LECs）向间充质细胞转化的分子机制，从而加深了对后发性白内障（PCO）发病机制的理解。本文报道了一种已建立的小鼠白内障手术建模方案，该方案可实现通过RNA测序对LECs在晶状体纤维细胞移除后的转录组反应进行可靠的分析，通过半定量免疫荧光评估蛋白质表达水平，并可结合现代小鼠遗传学工具，验证假设参与急性继发性病变（如炎症）以及后期LECs向肌成纤维细胞和/或异常晶状体纤维细胞转化相关基因的功能。

根据该手术方法的结果，Duncan 实验室利用这种白内障手术小鼠模型构建了术后晶状体上皮细胞的损伤反应时间进程（图5）。术后6小时，5%的晶状体上皮细胞转录组出现差异表达（图6A），其中包括大量即刻早期反应基因和促炎性细胞因子的上调23（图6B）。术后24小时，晶状体上皮细胞（LEC）转录组进一步重塑，与未受干预的LEC相比，其转录组中有16%出现差异表达23。这包括多种参与炎症反应的基因显著上调，如CXCL1、S100a9和CSF3/G-CSF，以及首次检测到纤维化标志物的上调，例如α-平滑肌肌动蛋白、tenascin C和fibronectin31,32。纤维化标志蛋白以及TGFβ活化调节因子αVβ8整合素在术后48小时显著上调，同时转录组进一步...

该方法通过从成年小鼠体内去除晶状体纤维细胞，保留附有晶状体上皮细胞（LECs）的囊袋，从而在活体中模拟白内障手术。in vivo 手术后不同时间点，采用分子和形态学标准评估损伤反应。

白内障手术（CS）是治疗白内障的有效方法，而白内障是全球视力障碍的主要原因。然而，CS 会导致眼部炎症，且……

我们的实验室研究后囊膜混浊的分子机制，这是白内障手术后最常见的不良继发性后果。该方法确实为我们深入了解残留晶状体上皮细胞对白内障手术的反应提供了新的基础性见解。我们首次发现，晶状体上皮细胞在出现任何TGF-β信号以及纤维化基因表达之前一到两天，即产生促炎性细胞因子。我们进一步证实，晶状体上皮细胞表面αvβ8整合素的表达对于TGF-β的活化是必需的，进而导致后期晶状体囊袋纤维化。我们还进一步证明，阻断αvβ8整合素功能的药物可抑制这一通路，从而预防纤维化发生，提示该分子可能是预防纤维化性后发性白内障（PCO）的一个新治疗靶点。目前针对PCO发病机制的研究通常聚焦于外源性活化TGF-β诱导晶状体上皮细胞向肌成纤维细胞转化的过程。然而，这并未阐明手术如何触发纤维化反应。该体内模型可用于追踪晶状体上皮细胞在眼内环境中对损伤的响应过程，揭示细胞自主性与非自主性机制。我们提供了一种独特的体内技术，可在利用先进遗传工具的同时，研究晶状体上皮细胞对手术的响应。从长远来看，这些研究可以阐明炎症管理中潜在的治疗靶点，同时利用我们的发现——即 αvβ8 整合素可能是预防白内障术后肌成纤维细胞形成的分子靶点。首先，准备麻醉和镇痛剂、散瞳滴眼液、无菌一次性手术刀、所需类型的镊子、针头、注射器以及平衡盐溶液（BSS）。对手术器械进行灭菌处理。麻醉前，向接受手术的眼睛各滴入一滴1%阿托品和2.5%去氧肾上腺素，以扩大瞳孔。使用无菌的26号半英寸针头，抽取无菌BSS灌注液至注射器中。然后将无菌的27号一英寸钝头输注尖端（弯曲45度）连接至注射器上。小鼠麻醉后，进行足趾挤压以确认麻醉深度，确保瞳孔扩张达到2毫米。将麻醉后的小鼠转移至带有加热垫的复合解剖光学显微镜载物台上。使用无菌手术刀片，在角膜中央做1至1.5毫米的切口，确保前晶状体囊也被切开。轻轻将一滴BSS滴在角膜上方，以润湿表面，便于后续操作。接着，将分配针头经中央角膜切口插入晶状体囊切口内，同时缓慢释放BSS，轻柔地以环形动作移动针头，以推出晶状体纤维团块。当纤维团块附着于分配针头时，轻柔地将针头从眼内取出。用无菌毛巾擦拭以去除晶状体纤维细胞，并重复操作直至所有晶状体纤维细胞和晶状体核被清除。用无菌BSS冲洗晶状体囊膜，以去除任何残留的纤维。观察其半透明或玻璃样外观，以确认囊膜位于眼内。关闭角膜切口时，首先用非优势手的镊子夹住一个角膜瓣，将带尼龙线的针穿过该瓣。然后将针穿过另一个角膜瓣。在切口的中央部位打一个方结缝合，并剪除多余的线头。将弯曲的针头穿过角膜间隙，置于最近缝合线的上方或下方，轻轻注入平衡盐溶液（BSS）以使眼球重新膨胀。术后护理时，立即在缝合线上方滴加一滴0.5%红霉素眼膏，覆盖整个切口。通过腹腔注射给予布托啡诺。将小鼠置于带有加热垫的笼子中，使其从麻醉中恢复，并给予最佳的温度支持，密切监测直至完全恢复。

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小鼠颅窗植入术：一种用于稳定光学接触小鼠脑区的玻璃盖片植入手术方案

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本视频展示了一种用于检测和量化感染后葡萄膜炎小鼠模型中眼部炎症的体内成像技术。该技术称为光学相干断层扫描（OCT），可生成眼部的高分辨率横断面图像，用于评估疾病进展。...

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在转基因小鼠脑内植入光学窗口以成像神经活动

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小鼠脉络膜黑色素瘤的植入与评估 通过 光学相干断层扫描

学习小鼠白内障手术建模方法，研究晶状体上皮细胞对手术损伤的反应机制。该技术揭示alpha v beta eight整合素在TGF beta激活和纤维化中的关键作用，为预防后囊膜混浊提供新治疗靶点。

小鼠白内障手术建模

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