Name: 用于测量组蛋白乙酰转移酶 1 乙酰化的乙酰基点击化学测定法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学习使用乙酰基点击化学测定法测量组蛋白乙酰转移酶1的乙酰化活性，该方法可用于高通量筛选小分子抑制剂。此技术为药物开发和酶学研究提供了可靠工具。

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我们感谢 George Zheng 提供 H4K12CoA。我们感谢 Gruber 实验室成员提供的有益讨论和反馈。感谢美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI，项目号 1K08CA245024）、得克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT，项目号 RR200090、RP210041）以及 V 基金会（V2022-022）提供的支持。

1. 方法一：重组HAT1/Rbap46复合物的制备与纯化
<ol>
	<li>解冻、复苏与扩增 HEK293f 细胞
	<ol>
		<li>解冻1-1000万HEK293f哺乳动物细胞26 加入30 mL Freestyle 293表达培养基至100 mL摇瓶中。在8% CO₂环境中孵育2 在 37 °C 以60 rpm转速旋转。</li>
		<li>第二天，计数并检测细胞活力，然后将转速调整至120 rpm。将细胞扩增至1 L锥形瓶中的300 mL培养液，保持接种密度为500,000 个细胞/mL，并在细胞密度超过3 × 10⁶ 个细胞/mL前进行传代。6 cells/mL</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HEK293f 转染
	<ol>
		<li>接种 5 × 105 细胞/mL，置于1 L锥形瓶中300 mL培养液中培养24小时。次日计数细胞，确保其浓度在7.5 × 10之间5 至 1.2 x 106 cells/mL</li>
		<li>配制混合液 300 µg pHEK-FLAG-HAT1 的 300 µg 30 mL PBS 中的 pHEK-Rbap46 质粒 DNA。向 DNA/PBS 混合物中加入 1.2 mL 聚乙烯亚胺（PEI），混匀。室温孵育 20 分钟。将 DNA/PBS/PEI 混合物加入 300 mL 培养物中，继续孵育 37 °C 在120 rpm条件下孵育48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获细胞
	<ol>
		<li>计数细胞，确保其数量在 1.7 x 106 至 2.5 x 106 细胞/mL。在此细胞密度下，加入forskolin至终浓度为 12.5 µM 激活 HAT1 并孵育细胞 30 分钟， 37 °C，120 rpm。</li>
		<li>300 x g 离心收集细胞 g 5 分钟后，用 30 mL PBS 洗涤一次，并在液氮中速冻2. 储存于 -80 °C 直至蛋白质纯化，或直接进行纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HAT1/Rbap46 复合物 FLAG 珠纯化
	<ol>
		<li>裂解细胞并制备蛋白提取物。
		<ol>
			<li>通过将一片蛋白酶抑制剂混合物（PIC）加入 50 mL RSB-500（20 mM Tris-HCl pH 7.5，500 mM NaCl，25 mM MgCl）中来配制裂解缓冲液2).</li>
			<li>将300 mL培养物的细胞沉淀置于冰上解冻，加入40 mL含0.1% Triton X-100的预冷裂解缓冲液进行裂解。在冰上超声破碎后，于10,000 x g 10 分钟 4°C将所有上清液收集到一个50 mL离心管中，置于冰上，此即为蛋白质提取物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备FLAG磁珠。
		<ol>
			<li>将 FLAG 磁珠均分为四份，分别加入四个 15 mL 锥形管中 400 µL 将 M2-FLAG 琼脂糖珠悬液加入各管中，每管含 5 mL 0.1 M 甘氨酸（pH 3.5）、0.01% Triton X-100。用手剧烈振荡每管 5 秒。</li>
			<li>脉冲离心 30 秒，1000 x g 在 4 °C，吸去上清液，用5 mL RSB-500 + 0.1% Triton X-100（Tx-100；不含蛋白酶抑制剂）洗涤两次，并在冰上孵育。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行FLAG免疫沉淀。
		<ol>
			<li>向每个含有已洗涤磁珠的15 mL离心管中加入10 mL蛋白提取物。将离心管在 4 °C 以倒置旋转方式孵育至少90分钟或过夜。</li>
			<li>用 10 mL RSB-500 + 0.1% Tx-100 将结合的珠子洗涤 5 次。每次洗涤时，将离心管倒置 2 至 5 次以重悬珠子，然后在 1000 × g 下离心收集珠子。 g 1 分钟，于 4 °C最后，用 RSB-100（20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl₂）洗涤一次。2) + 0.1% Tx-100</li>
		</ol>
		</li>
		<li>FLAG肽洗脱：在含有0.5 mg/mL FLAG肽的1.5 mL洗脱缓冲液（EB）中洗脱HAT1复合物。孵育于 4 °C 至少 1 小时或过夜。将洗脱的珠子以 1000 x g 短暂离心 g 30 秒 4 °C 收集上清液，其中含有纯化的HAT1/Rbap46复合物。</li>
		<li>浓缩蛋白并去除FLAG肽。
		<ol>
			<li>将洗脱液加入一个 20 mL、截留分子量为 10,000 道尔顿的滤管中。用 EB 缓冲液定容至 15 mL。在 2500 x g 15 分钟 4 °C，每次加入15 mL EB，重复两次。</li>
			<li>从滤管中回收最终洗脱液，并通过A260测定蛋白浓度。预期每300 mL起始培养物可获得6 mL EB缓冲液中含有1 mg总蛋白。通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及免疫印迹检测蛋白纯度，并将分装样品保存于-80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 方法2：HAT1乙酰化-点击标准曲线
<ol>
	<li>制备标准曲线
	<ol>
		<li>合成带有以下序列的阳性对照 H4 N 末端肽：SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotin)]，其中 [Pra] 表示丙炔基甘氨酸（Propargylglycine）。</li>
		<li>用 DMSO 将 Pra 肽重悬至浓度为 0.1 mg/mL。将 Pra 肽与生物素标记的组蛋白 H4 肽（1-23-GGK-biotin）混合，以制备标准曲线（图 2；体积见表 1）。标准曲线可在包被平板前新鲜配制，或预先配制后加入 20 µL 的 8 M 尿素，并于 -20 °C 保存，直至步骤 3.3 使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 方法3：HAT1乙酰化-点击反应检测
<ol>
	<li>组装含测试抑制剂的乙酰化反应
	<ol>
		<li>在0.2 mL PCR管或96孔PCR板中，以以下组分重复设置乙酰化反应：将生物素标记的组蛋白H4肽（1-23-GGK-生物素）用DMSO重悬至0.1 mg/mL（34.8 µM），HAT1酶预先用EB缓冲液稀释，20倍缓冲液（1 M Tris pH 8.5，0.1% NP40），2 mM DTT，以及溶于水至1 mg/mL（1 mM）的4-戊炔酰辅酶A。一个20 µL的反应体系包含：10 µL酶液、1 µL H4肽、1 µL 20倍缓冲液、1 µL已预混并分装至96孔PCR板各孔中的DTT，操作时将板置于冰上。</li>
		<li>每孔加入1 µL DMSO（阴性对照）或溶解于1–10 µM浓度的测试化合物，或H4K12CoA25（或合适的阳性对照抑制剂）。通过轻柔移液混匀，冰上孵育10分钟，使酶与抑制剂形成复合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙酰化反应继续进行
	<ol>
		<li>将2 µL 4-戊炔酰辅酶A与4 µL水混合后加入各孔。轻柔移液混匀，室温下以300 × g离心30秒以收集反应液，然后在加盖的PCR管或用可封口铝箔密封的PCR板中，于37 °C孵育1小时。</li>
		<li>反应产物可直接进行后续处理，或加入20 µL 8 M尿素终止反应，并于-20 °C保存至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肽段结合至Neutravidin板
	<ol>
		<li>将含或不含尿素的反应液加入已用牛血清白蛋白（BSA）预封闭的黑色Neutravidin包被96孔板中，每孔含80 µL PBST（PBS + 0.1% Tween-20）。</li>
		<li>将标准曲线用肽段以复孔形式加入各自孔中，每孔含80 µL PBST。室温下轻柔振荡孵育1小时，使肽段充分结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤：结合完成后，吸去孔内液体，使用板式洗板机以200 µL PBST每孔清洗3次，每次15次冲程（每次冲程体积180 µL）。</li>
	<li>点击化学反应
	<ol>
		<li>按如下方式配制点击反应试剂：将Tris(3-羟丙基三唑甲基)胺（THPTA）配制成100 mM水溶液，CuSO4配制成20 mM水溶液。THPTA可防止Cu(II)催化的水解反应，并淬灭由O2/Cu/抗坏血酸体系产生的自由基和过氧化物。</li>
		<li>将THPTA/Cu混合液加入300 mM抗坏血酸水溶液和2.5 mM生物素叠氮化物DMSO溶液中。单个点击反应体系包含：140 µL PBS、10 µL THPTA、10 µL CuSO4、10 µL抗坏血酸钠、20 µL生物素-叠氮。点击试剂需现配现用，混匀后每孔加入190 µL，密封反应板，37°C孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤：吸去孔内液体，用PBST按前述步骤清洗3次（每次冲程体积180 µL，每轮15次冲程）。</li>
	<li>链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合：将链霉亲和素-HRP（0.224 mg/mL）以1:10比例溶于链霉亲和素溶液（0.224 mg/mL）中，再用PBST进一步稀释1:1000。每孔加入100 µL链霉亲和素-HRP与链霉亲和素的混合液，室温下轻柔振荡孵育1小时。</li>
	<li>按前述步骤用PBST洗涤3次。</li>
	<li>Amplex Red氧化反应
	<ol>
		<li>按如下方式配制Amplex Red检测试剂：4.45 mL NaHPO4缓冲液（终浓度为50 mM，1×），50 µL Amplex Red（20 mM，溶于DMSO），500 µL稀释后的H2O2。</li>
		<li>将30%储存液的H2O2用1× NaHPO4缓冲液稀释至3%，然后取22.7 µL 3% H2O2加入977 µL 1× NaHPO4缓冲液中（此即用于Amplex反应的H2O2溶液）。每孔加入100 µL Amplex Red反应混合液，避光室温孵育30分钟，随后使用标准荧光酶标仪检测激发/发射波长为571/585 nm的荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶抑制率计算：根据以下公式计算抑制百分比（图3）：<img alt="色谱效率公式 \( \frac{D-X}{D-BG} \times 100 \)；数据分析方法。" src="/files/ftp_upload/66054/66054eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1">，其中D为仅用DMSO处理的对照反应的荧光值，X为测试化合物处理组的荧光值，BG为背景孔（仅含H4肽段、无酶加入）的荧光值。</li>
	<li>剂量反应曲线：选择在初筛中显示可抑制HAT1酶活性的测试化合物，进行重复实验，并对化合物进行系列稀释。化合物稀释梯度需根据经验确定。例如，起始储备浓度为2 mM，随后以1:3比例进行八次连续稀释，再以1:20比例加入酶反应体系，得到最高浓度为100 µM的剂量。
	<ol>
		<li>绘制曲线：使用最小二乘法回归分析（在数据分析软件如GraphPad Prism中），基于步骤3.10所得的抑制率数据拟合剂量-反应抑制曲线，并计算各化合物的IC50值（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用乙酰辅酶A的乙酰化反应：
	<ol>
		<li>本步骤用于验证HAT1酶在天然辅因子乙酰辅酶A（而非4-戊炔酰辅酶A）存在下的酶活性。按照步骤3.1–3.2所述方法进行HAT1乙酰化检测，仅将4-戊炔酰辅酶A替换为乙酰辅酶A。</li>
		<li>取1–2 µL反应产物点样于硝酸纤维素膜上，待其干燥后，使用抗H4-赖氨酸-12-乙酰化抗体或抗H4-赖氨酸-5-乙酰化抗体进行点印迹检测。通过密度测定法对免疫印迹信号进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Development of a Click-Based Assay for Screening HAT1 Enzyme Activity

<ol><li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li>
<li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast%3A+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li>
<li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li>
<li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1%3A+more+than+just+an+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li>
<li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li>
<li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47(2019).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967(2021).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li>
<li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li>
<li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li>
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<li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A%2FB+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li>
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</ol>

我们已申请描述HAT1乙酰化-点击检测方法的专利（PCT/US20/29395）。J.J.G. 报告与Sharma Therapeutics, LLC 和 Guidepoint 存在咨询协议，并从Hummingbird Biosciences获得研究资助（资助对象为其所在机构）。

在过去十年中，点击化学迅速发展20，实现了对相互作用化学结构的精确设计。在此背景下，多种生物正交共价连接方式21已成为在天然环境中形成复合物的有前景选择。点击化学利用成对的功能基团，这些基团表现出快速且具有选择性的反应，通常被称为&#34;点击反应&#34;。这些反应可在环境友好、温和的水相条件下高效进行。本文介绍了用于识别和表征HAT1乙酰转移酶活性的平台的开发24。该平台基于点击化学技术，采用高通量、多肽依赖的酶学检测方法。
该检测方法的一个关键优势在于，它依赖于从人源细胞纯化获得的人源HAT1/Rbap46酶复合物，而非来源于细菌。此外，该方法可直接测量酶在肽底物上的活性，从而无需使用可能易受非特异性抑制影响的偶联反应。尽管已有基于抗体的方法可用于评估酶活性21，但乙酰化-点击检测法通过避免生物学变异性和抗体相关成本而具有明显优势。此外，我们已成功验证该方法在96孔板中的高通量应用能力，使其适用于大规模化合物筛选。点击化学策略也有望被改造用于其他乙酰转移酶。例如，可将重组乙酰转移酶与模拟其天然底物的其他组蛋白肽段以及4-戊炔酰辅酶A共同孵育，以诱导肽段的酰化反应，随后快速适配肽段结合、功能化及Amplex Red氧化等后续检测步骤。为实现检测的定量分析，应谨慎设计合适的阳性和阴性对照，用于标准曲线的建立。
进行该检测时应注意某些局限性。首先，尽管本方案已针对HAT1进行了优化，但并非所有乙酰转移酶都能接受戊炔酰辅酶A作为乙酰辅酶A的模拟物。因此，可考虑开发其他酰基供体分子26，或对催化口袋进行突变，以使其能够接受可进行点击化学反应的辅因子27,28。其次，由于蛋白对可进行点击化学反应的辅因子的亲和力可能与天然辅因子不同，建议使用二级验证实验来确认结果，例如基于抗体的检测方法（见步骤3.12）。最后，应进行额外的酶学、生物物理和细胞实验以进一步验证结果。小分子与蛋白复合物的结合可通过检测表面等离子共振的仪器进行确认，例如29。
为确保实验顺利进行并获得准确结果，有几个关键步骤需要特别注意。在DNA转染之前和之后，应能明显观察到293f细胞的指数生长，以实现良好的蛋白表达。应使用在瞬时转染系统中能够高效表达蛋白的质粒，例如本实验中使用的pHEK-293质粒。在本方案中，HAT1酶通过forskolin激活，但使用正钒酸盐也可获得类似结果，表明HAT1活性依赖于翻译后修饰。我们观察到，纯化的HAT1/Rbap46酶制剂相对稳定，可耐受多次冻融循环而不丧失酶活性。然而，我们建议将酶分装为小份量后冷冻保存。通常情况下，经过一次以上冻融循环的酶不建议继续使用。
在进行乙酰化-点击反应检测时，必须始终设置三组平行对照反应：DMSO处理的反应作为阴性对照，H4K12CoA处理的反应则作为酶抑制的阳性对照。DMSO处理组的酶反应荧光值应落在25%至50%阳性Pra肽之间的线性标准曲线范围内，以避免信号饱和。为此，在药物测试前，可能需要精确滴定对照反应中HAT1/Rbap46酶的用量。例如，可将HAT1/Rbap46酶用EB缓冲液按1:1、1:5、1:10、1:25、1:50、1:75和1:100的比例进行系列稀释，然后用于乙酰化-点击反应，以确定产生相当于Pra肽25%–50%信号强度所需的酶量。我们发现，通常100 nM的酶浓度已足够，但每批新制备的酶均应通过实验确定最佳浓度。将链霉亲和素-HRP与普通链霉亲和素混合的目的是降低Amplex Red的氧化信号强度。链霉亲和素的稀释度可根据实际输出信号进行调整。如果信号生成过快，可能需要在30分钟前读板，以防止信号饱和。在初始检测优化阶段，建议分别在5分钟、15分钟和30分钟读取数据。连续读板不会影响信号强度。若检测系统校准良好，则在5分钟至30分钟内产生的Amplex Red信号应呈线性增长。

在众多真核生物乙酰转移酶中，HAT1 是首个被分离出来的组蛋白乙酰转移酶1,2,3后续研究已明确证实其在染色质复制中的关键作用，特别是在S期新核小体的合成过程中。4我们的研究发现，在乳腺细胞中，组蛋白乙酰转移酶1（HAT1）的活性可被表皮生长因子（EGF）处理显著激活。5此外，研究发现HAT1对于细胞的快速增殖和肿瘤形成是必需的 体内6,7,8,9数据表明，HAT1 在协调细胞分裂的合成代谢和表观遗传过程、促进肿瘤生长中起关键作用。
HAT1 在与伴侣蛋白 Rbap46 形成的复合物中，对组蛋白 H4 氨基末端尾部的第5位和第12位赖氨酸进行双乙酰化修饰。该复合物通过 Rbap46 结合组蛋白，并将 H4 的氨基末端暴露给 HAT1。随后，组蛋白四聚体或二体10 与 HAT1/Rbap46 及其他组蛋白伴侣蛋白11 一起被转运至细胞核内。组蛋白随后被释放，并在复制叉或其他位点沉积，以支持基因的激活或抑制。目前尚不完全清楚 HAT1 在组蛋白 H4 上产生的双乙酰化修饰的具体功能。该修饰很可能在组蛋白 H4 插入染色质后的 15–30 分钟内，迅速被组蛋白去乙酰化酶的作用所去除12,13,14,15。因此，HAT1 介导的双乙酰化标记不会在染色质中持续传递，可能并不发挥真正的表观遗传作用，尽管已有假说认为其可能参与招募染色质修饰酶至新生染色质12。此外，HAT1 并不直接乙酰化染色质，其活性仅限于可溶性组蛋白。
小分子组蛋白乙酰转移酶抑制剂的开发一直受到非特异性及低通量检测方法的阻碍，常常导致产生具有生物反应活性的化合物16,17。&#160;目前测定乙酰转移酶活性的金标准方法需要使用3H-乙酰辅酶A，这限制了检测通量并涉及放射性操作。尽管如此，近年来已有研究报道并利用3H-乙酰辅酶A验证了靶向CBP/p30018和KAT6A/B19,20的特异性高、效力强的小分子乙酰转移酶抑制剂。未来，研究人员正在设计更优的检测方法，以提高通量并避免实验室安全隐患。
近年来，乙酰化检测技术的进步21已采用点击化学方法来实现对酶促反应的监测。目前已有多种可用于点击化学的前体，可通过简单的合成路线获得或直接购买，并可将其引入酶反应体系中。这些反应通常在重组表达系统中进行，尽管基于细胞的检测方法也是可行的22。使用可进行点击化学的辅因子和底物的优势在于，筛选过程可直接测量酶活性，而无需依赖偶联的信号检测系统——这类系统常受到筛选化合物的干扰，并需要额外的操作步骤。该方法允许仅在酶促反应阶段加入抑制剂，而所有后续的功能化修饰和检测步骤均在充分洗涤去除化合物后进行，从而最大限度地减少检测干扰的可能性。这些优势使得可进行点击化学的检测方法在设计上优于传统的偶联检测法，后者通常依赖于对游离辅酶A的检测。
一个重要的考虑因素是点击化学修饰的辅因子能否被酶的活性位点所接受。现有的点击化学修饰辅因子可能无法完全兼容为天然辅因子优化的活性位点。利用结构信息和分子建模可设计氨基酸替换，以扩大活性位点，从而容纳结构改变的底物23。这种方法可能实现更优的酶动力学筛选，并降低底物和酶的使用量。该策略的缺点是，经过改造的催化口袋可能无法识别与天然酶强烈相互作用的抑制剂。最终，需要结合多种方法来发现并验证潜在的酶抑制剂。
在此，我们介绍一种利用点击辅因子4-戊炔酰辅酶A纯化并检测HAT1酶活性的方法24。该检测方法（图1使用天然酶序列与其必需的伴侣蛋白Rbap46形成的复合物，该复合物已被证明可增强酶活性。从人源细胞中纯化该酶，可实现酶的激活。 在细胞内，这可能保留了对酶完全活性至关重要的刺激性翻译后修饰。重组酶活性检测方法的设计与优化已成功应用于高通量化学筛选，以鉴定和表征HAT1小分子抑制剂。

<table><tbody><tr><td>4P CoA</td><td>Cayman Chemical</td><td>10547</td><td>点击化学辅因子</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Fisher Sci</td><td>A12222</td><td>荧光底物</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Azide</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64996MC</td><td>点击化学</td></tr><tr><td>Copper Sulfate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;7758-98-7</td><td>点击化学</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;67-68-5</td><td>稀释剂</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Acros Organics</td><td>03-12-3483</td><td>还原剂</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>VWR</td><td>102987-310</td><td>蛋白表达</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Expression Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Freestyle 293-F cells</td><td>Thermo Fisher</td><td>R790-07</td><td>蛋白表达</td></tr><tr><td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td><td>Anaspec</td><td>AS65097</td><td>肽段底物</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;7365-45-9</td><td>EB缓冲液</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30% solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;Z00183-99-0</td><td>引发剂</td></tr><tr><td>M2 FLAG antibody slurry</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A2220</td><td>蛋白纯化</td></tr><tr><td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td><td>VWR</td><td>89131-980</td><td>蛋白纯化</td></tr><tr><td>Neutravidin Plate</td><td>Thermo Sci</td><td>15127</td><td>BSA预封闭</td></tr><tr><td>NP40 (IGEPAL)</td><td>MP Biomedical</td><td>198596</td><td>20x缓冲液</td></tr><tr><td>pHEK-293 plasmid</td><td>Takara Bio</td><td>3390</td><td>蛋白表达</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>&amp;nbsp;Z00082-33-6</td><td>洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>Pra peptide</td><td>Genscript</td><td>Custom synthesis</td><td>生物素化</td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;134-03-2</td><td>点击化学</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;7647-14-5</td><td>EB缓冲液</td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>VWR International</td><td>7558-80-7</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>EMD Millipore</td><td>189730</td><td>竞争剂</td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>Cell Signaling</td><td>3999S</td><td>酶</td></tr><tr><td>THPTA ligand</td><td>Fisher Sci</td><td>1010-500</td><td>点击化学</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;77-86-1</td><td>20x缓冲液</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>VWR International</td><td>&amp;nbsp;9002-93-1</td><td>EB缓冲液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;9005-64-5</td><td>洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-13-6</td><td>淬灭剂</td></tr></tbody></table>

一种乙酰化-点击化学检测法用于测量组蛋白乙酰转移酶1的乙酰化水平

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1（也称为组蛋白乙酰转移酶1）在染色质合成中发挥关键作用，可在核小体组装前稳定并乙酰化新生H4。它在多种系统中均是肿瘤生长所必需的，因此成为癌症治疗的潜在靶点。为了促进能够抑制HAT1酶活性的化合物的鉴定，我们设计了一种乙酰-点击（acetyl-click）检测方法用于快速筛选。在此简易检测中，我们采用从活化的人类细胞中纯化的重组HAT1/Rbap46。该方法利用乙酰辅酶A类似物4-戊炔酰辅酶A（4P），结合点击化学策略，通过HAT1依赖的酰化反应将炔基标记转移至生物素化的H4 N端肽段上。捕获的肽段随后被固定在中性亲和素包被的微孔板上，再通过点击化学与叠氮生物素进行功能化连接。随后引入链霉亲和素-过氧化物酶，催化氧化Amplex Red，产生可定量的荧光信号。通过在酰化反应过程中引入化学抑制剂，可根据荧光信号的减弱程度来量化酶活性的抑制效果。重要的是，该反应具有可扩展性，可用于对HAT1酶活性潜在抑制剂的高通量筛选。

每次实验均需在每块板上设置复孔标准曲线（共16个孔），以确保检测的准确性。标准曲线数据应以表格形式建立，根据溶液中含Pra的肽段与天然H4肽段的比例，设定从100%到0%的浓度梯度（表1）。在含100% Pra/0%天然H4肽段的孔中，Amplex Red信号最强；而在0% Pra/100%天然H4肽段的孔中，信号最弱。在检测荧光信号并对各孔取平均值后，所得标准曲线应呈线性关系（图2），尽管在Pra浓度高于50%时可能出现信号饱和。若Pra肽段与H4对照肽段混合不充分，可能导致Amplex Red信号极弱或缺失，或在0–50% Pra范围内信号变化呈非线性。信号正常且曲线符合预期，表明点击化学反应已成功发生，可据此进行数据分析。
必须始终设置三份对照反应：DMSO处理的反应作为阴性对照，H4K12CoA处理的反应作为酶抑制的阳性对照。每块板上均应包含这些对照，以确保检测结果的可靠性，并用于计算抑制百分率。含有1 µM H4K12CoA的阳性对照孔应表现出较低的Amplex Red信号，与0% Pra/100% H4肽孔的信号相似；含有DMSO的阴性对照孔应表现出与50% Pra/50% H4肽孔荧光输出相近的信号。待测化合物孔将表现出不同的Amplex Red信号。对重复两次或三次的孔取平均值，得到具有标准误差的平均信号值。
使用上述公式计算酶抑制率，其中 D 代表 DMSO 的荧光输出值，X 代表实验组的荧光输出值，BG 代表不含酶的 H4 肽段反应组或标准曲线中 0% 组的荧光输出值。若待测化合物抑制酶活性，则其反应的荧光输出值将低于 DMSO 组，从而得到正值的抑制率。若未发生酶抑制，则反应中将观察到相反的效果。在 图3 中展示了待测化合物在两个浓度（1 µM 和 10 µM）下筛选的示例数据。也可通过该检测方法对化合物进行系列稀释，利用非线性曲线拟合数据测定化合物的 IC50 （图4）。
<img alt="组蛋白H4肽酰化、生物素-叠氮化物点击反应、中性亲和素包被板、Amplex Red检测示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：HAT1乙酰化/酰化点击化学反应示意图。 HAT1乙酰化点击反应在含有生物素标记的组蛋白H4肽、4-戊炔酰辅酶A及待测化合物的溶液中，由纯化的HAT1与Rbap46蛋白共同催化进行。反应完成后，将溶液转移至中性亲和素包被的微孔板上，并加入硫酸铜和生物素-叠氮化物完成点击化学反应。最后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）和Amplex Red试剂，产生红色荧光信号。通过比较Amplex Red荧光强度，可测定HAT1的乙酰化活性。本图经Gaddameedi等人许可修改。24 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="标准曲线图；荧光值与多肽滴定；R²=0.95；数据分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2标准曲线示例。 在对每对标准曲线值进行平均后，将均值 ± 标准误（SEM）相对于阳性对照Pra肽的百分比作图。所得曲线应与所示曲线相似，并符合线性关系。该检测方法的检出限（LOD）为1.8% ± 0.89%，定量限（LOQ）为5.4% ± 3.1%24标准曲线在 Pra 百分比过高时可能会达到饱和 &gt;50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化合物抑制分析；图表；化合物A-G；浓度10 μM、1 μM；抑制率%。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：新化合物的三复孔测试。采用乙酰化点击实验评估新合成化合物的抑制活性。化合物稀释至10 µM和1 µM浓度，进行三复孔测试，并标示中位值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="剂量-反应曲线图，抑制率% 对比药物浓度，统计分析，IC50 测定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：HAT1 乙酰化点击实验中测试化合物的系列稀释。 化合物浓度从 100 µM 稀释至 0.01 µM，并进行重复检测。所得剂量-反应曲线显示，化合物 A 和 C 在多个稀释浓度下对 HAT1 活性抑制接近 100%。随后利用这些数据计算各化合物的 IC50 值，用于后续实验。数据为两次重复实验的均值 ± 标准误。化合物 A、B 和 C 的非线性拟合 R2 值分别为 0.84、0.78 和 0.94。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>阳性对照百分比</td>
			<td>阳性对照肽 [2.5 次反应] “pra”，用 DMSO 稀释至 0.1 mg/mL（含炔基）</td>
			<td>H4 肽 [2.5 次反应]，用 DMSO 稀释至 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>2.5 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75</td>
			<td>1.875 µL</td>
			<td>0.625 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>1.25 µL</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>0.625 µL</td>
			<td>1.875 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1.25 µL （1:10 稀释液）</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1 µL （1:10 稀释液）</td>
			<td>9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>8.5 µL</td>
			<td>25.5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Pra对照肽与H4肽的稀释比例。 用于绘制标准曲线的阳性对照“Pra”肽与H4肽的比例。Pra储备液需先用DMSO重悬至4 mg/mL，再用DMSO进行1:40稀释，得到终浓度为0.1 mg/mL的溶液。生物素标记的H4肽也需用DMSO稀释至0.1 mg/mL（34.8 µM）。随后，将两种肽按表中所示比例混合。每个标准品需设两个复孔加入96孔板中。荧光检测结果应取平均值，用于绘制标准曲线。

快速且准确的化学检测方法用于筛选特异性抑制剂，是药物开发工具库中的重要手段。本文介绍一种可放大的乙酰化-点击化学检测方法，用于测定HAT1乙酰化活性的抑制情况。

HAT1，也称为组蛋白乙酰转移酶1，通过在核小体组装前稳定并乙酰化新生H4，在染色质合成中发挥关键作用……

我们开发的乙酰化-点击检测法可用于评估HAT1乙酰转移酶活性，该活性在组蛋白H4掺入核小体之前起关键作用。我们旨在利用此方法对HAT1酶的小分子抑制剂进行高通量筛选。该方法可直接在肽底物上测定酶活性。与其它酶学检测方法相比，该方法避免了生物变异性以及与抗体相关的成本，具有优势。此外，该方法通量高，且可适用于其他乙酰转移酶。我们近期基于此检测方法发表了一种小分子HAT1抑制剂，该抑制剂在细胞和动物中均具有活性。我们继续使用该检测方法筛选更多的化合物文库，并开展构效关系研究。我们正在优化追踪组蛋白生成、折叠、分子伴侣介导的转运以及染色质整合的方法。这凸显了开发更优化学工具的必要性，以深入探究生物学机制并推动药物发现。我们的目标是证明靶向组蛋白生成可能对癌症等疾病具有治疗益处。

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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一种乙酰化-点击化学检测法用于测量组蛋白乙酰转移酶1的乙酰化水平

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