利用靶向切割和标签化（CUT&Tag）技术在小鼠成肌细胞研究中的应用

本课题组的研究重点是成年骨骼肌干细胞中基因组结构和转录的调控与维持机制，特别是在干细胞命运决定、分化和衰老等细胞相变过程中的动态变化。成年骨骼肌干细胞仅占肌肉组织中单核细胞的1%，由于从肌肉消化获得的单细胞悬液中此类细胞数量稀少，利用Hi-C、ChIP和ATAC-seq等技术研究其染色质特征面临巨大挑战。染色质免疫沉淀（ChIP）一直是分析基因组特征的关键工具。

由 Steven Henikoff 博士开发的一种更简单、更高效的接触技术通常优于染色质免疫沉淀（ChIP），尤其是在研究稀有细胞群体的表观遗传学时。该技术操作简便，使包括非表观遗传学专家在内的研究人员都能更广泛地使用。首先，将 30 µL 的刀豆蛋白 A 磁珠加入一个 1.5 mL 的离心管中。

向珠子中加入300微升结合缓冲液。反复倒置离心管以充分混匀。然后将离心管置于磁力架上。

溶液澄清后，用移液器吸出上清液。从支架上取下离心管后，向其中加入300微升结合缓冲液。再次倒置离心管以混匀管内物质。

将离心管中的内容物均匀分配至8联PCR管条中的三个管内。然后将PCR管条置于磁力架上，直至溶液澄清。吸除上清液后，用移液器向各管中加入10 µL结合缓冲液，并充分混匀。

将制备好的珠子置于冰上，待后续实验使用。接着，用胰蛋白酶消化培养的小鼠成肌细胞，使其从培养板上脱落。细胞离心后，使用真空泵吸除上清液。

然后用 PBS 重悬沉淀。对细胞悬液进行细胞计数后，离心细胞。接着，用适量洗涤缓冲液重悬沉淀，使细胞密度达到每毫升 700,000 个细胞。

将100微升该细胞悬液移液至PCR八联管的每个管中，并充分混匀。然后将八联管置于摇床（往复运动）上，室温孵育10分钟，使刀豆球蛋白A（concanavalin A）磁珠捕获细胞。再次将管子置于磁力架上澄清，然后吸走上清液。

最后，在显微镜下观察上清液，以评估刀豆蛋白A磁珠与细胞结合的效率。首先，用移液器将3微升H3K4me1抗体加入含有150微升抗体缓冲液的离心管中。然后将稀释后的抗体分别加入八联PCR管条中的每管，每管含有被捕获在刀豆蛋白A磁珠上的小鼠成肌细胞。

轻轻颠倒混匀管内物质数次，充分混匀后，将各管置于4 °C摇床中过夜震荡。次日，将样本置于磁力架上澄清后，用移液器小心吸走上清液。吸除上清液后，向每根样本管中加入50 µL稀释后的二抗。

将样品管倒置混匀，并在室温下于摇摆振荡器上孵育一小时。弃去澄清样品的上清液，然后每管加入200 µL Dig洗涤缓冲液。将试管重新置于磁力架上，用移液器吸走上清液。

接下来，向每个管中加入 100 µL 含有 pA/G-Tn5a 的 300-Dig 缓冲液。孵育完成后，将各管重新置于磁力架上。然后用移液器吸出澄清的上清液。

现在向每支试管中加入 200 µL 的 300-Dig 缓冲液。将样本管置于摇床中，在室温下振荡 3 分钟。最后一次洗涤后，用移液器彻底吸出每支磁力澄清管中的上清液。

然后加入50微升片段化缓冲液。最后，将离心管放入PCR仪中，在37摄氏度下孵育1小时，期间不使用仪器的加热盖功能。首先，向含有已片段化的鼠成肌细胞样品的样品管中加入150微升片段化缓冲液。

将EDTA、SDS和蛋白酶K用移液器加入每个试管中。涡旋振荡试管内容物以充分混匀，然后在PCR仪中55摄氏度孵育两小时。接着，将每个样品用移液器转移至含有200微升酚-氯仿混合液的1.5毫升离心管中。

涡旋振荡试管中的内容物以充分混匀。离心完成后，将上层液体转移至新的1.5毫升离心管中。随后向新管中加入200 µL氯仿，再次涡旋振荡并进行离心。

将上层液体吸出至新离心管中。然后向每个离心管中加入550 µL的100%乙醇，并通过倒置充分混匀。随后将离心管置于-80 °C条件下1小时，以诱导DNA沉淀。

将溶液在最大转速下离心15分钟，以获得DNA沉淀。倒出上清液后，用75%乙醇洗涤沉淀，然后再次离心5分钟。随后将沉淀重悬于21 µL双蒸水中。

设置用于文库构建的 PCR 反应。每个样本使用不同的 N7 XX Illumina 引物和通用的 N5 XX 引物。将 PCR 循环数输入仪器以运行 PCR。

扩增后，在琼脂糖凝胶上电泳检测三微升文库。切割与标签文库主要包含约300个碱基对的带标签单核小体。定量PCR显示，H3K4me1修饰在Myod1基因的增强子区域显著富集。