使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

我们的研究重点是哺乳动物程序细胞死亡，特别是研究高血糖背景下细胞凋亡和坏死性凋亡之间的平衡。最近，细胞死亡蛋白 RIP1 激酶已被证明可以调节坏死性死亡期间的基因表达。我们目前的实验挑战是对悬浮液生长的免疫细胞进行基因纵，特别是使用 CRISPR-Cas9 敲除 RIP1 激酶基因。

我们的协议具有两个明显的优势。它改进了使用慢病毒悬浮生长的免疫细胞的转染方法，并且在使用 CRISPR-Cas9 创建基因敲除过程中消除了单细胞克隆的需要，我们的结果为研究 RIP1 激酶在坏死性凋亡中高血糖转变中的作用铺平了道路。开始象限条纹，携带慢病毒载体的大肠杆菌将RNA引导到补充有每毫升100微克氨苄青霉素的Luria-Bertani或LB琼脂平板上。

将板在37摄氏度下孵育一到两天，直到在板上最稀薄的区域可以看到单个菌落。孵育后，使用无菌环，选择单个菌落并将其添加到 5 毫升 LB 肉汤中，并在 50 毫升锥形管中补充每毫升 100 微克氨苄青霉素。通风并用胶带粘住管盖。

将试管在 37 摄氏度和 225 RPM 的轨道振荡器中孵育 8 小时。同时，将40毫升LB肉汤加入40毫升，每毫升氨苄青霉素补充100微克，放入四个50毫升管中。孵育后，将 40 微升生长的培养物转移到四个管中的每一个中。

在将它们在 37 摄氏度和 225 RPM 的轨道振荡器中孵育 12 至 16 小时之前，将试管的盖子排气并用胶带粘住。第二天，在摆动的桶转子中以3， 220 x g离心培养物20分钟。将上清液倒入废烧杯中，并将所有四个沉淀混合到10毫升LB肉汤中，并辅以氨苄青霉素。

将组合的沉淀在摆动的桶转子中以最大速度离心 20 分钟，以获得单个沉淀，并将尽可能多的上清液丢弃到废烧杯中。将HEK293T细胞以 3 至 5 倍 10 的浓度接种到 6 个细胞的幂中，放入含有 DMEM 的 T25 烧瓶中。将烧瓶与 5% 二氧化碳在 37 摄氏度下孵育过夜。

同时，使用1：1：1：1比例的质粒和3：1比例的转染试剂与还原血清培养基的质粒DNA制备转染混合物。混合 75 微升转染试剂、2， 500 微升还原血清培养基和 25 微克总质粒 DNA。让混合物在室温下孵育 15 至 30 分钟。

接下来，小心地将转染混合物移液到含有培养基的烧瓶中的汇合HEK293T细胞上。轻轻旋转烧瓶以确保混合物充分均质，并在 37 摄氏度下孵育 48 小时。孵育两天后，将培养基从生产者HEK293T细胞烧瓶转移到 15 毫升锥形管中。

将试管以 800 x g 离心五分钟，以沉淀任何剩余的HEK293T细胞。小心地去除所有含有上清液的病毒，不要干扰沉淀，并将其转移到新的 15 毫升锥形管中。计数并计算所需的 U937 细胞悬液体积，以获得 2 x 10 的 6 个细胞的幂。

然后将细胞悬液在15毫升管中以400×g离心10分钟，并倒出上清液，将细胞沉淀留在管中。将细胞沉淀重悬于含有上清液的病毒中，并将试管以 290 x g 离心 60 分钟。离心后，使用移液器将沉淀与管中含有病毒上清液的沉淀重悬。

将管子放在首端旋转器上 60 分钟。然后将试管以 400 x g 离心 10 分钟，并将沉淀重悬于含有上清液的病毒和完全 RPMI 1640 培养基的 1：1 比例中，并补充有 10% 热灭活的 FBS。将细胞混合物转移到新的T25组织培养瓶中，并在37摄氏度下孵育48小时。

孵育后，将U937细胞以400×g 离心10分钟，并除去上清液。用完整的RPMI 1640培养基重悬沉淀，补充10%热灭活FBS和每毫升5微克嘌呤霉素。将细胞培养物转移到 T25 烧瓶中。

将细胞在 37 摄氏度下孵育两到三周，每隔一到两天检查一次细胞是否有生长迹象。Western blot分析证实，RIP1 CRISPR突变细胞中RIP1蛋白表达丢失，与野生型和非靶对照细胞中的强信号相比，没有可检测到的信号。TCZ处理诱导野生型和非靶对照细胞显著坏死性凋亡，坏死抑素-1s处理可逆转。

相比之下，与没有坏死抑素-1 作用的野生型和非靶对照细胞相比，RIP1 CRISPR 敲除细胞显示出显着较低的细胞死亡，表明 RIP1 功能丧失。活细胞荧光显微镜显示，TCZ处理后野生型和非靶对照细胞中线粒体超氧化物的产生显着增加，在坏死抑素-1s处理后减少。RIP1 CRISPR 敲除细胞表现出极少的线粒体超氧化物产生，没有观察到的坏死抑素 1s 处理效果。