使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系
2025年4月11日
随着 CRISPR 相关方案变得越来越有用和可及，在特定的实验条件下仍然会出现并发症和障碍。该方案概述了使用 CRISPR/Cas9 创建受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 （RIPK1/RIP1） 敲除人细胞系，并强调了在此过程中遇到的潜在挑战。
我们的研究重点是哺乳动物程序细胞死亡，特别是研究高血糖背景下细胞凋亡和坏死性凋亡之间的平衡。最近，细胞死亡蛋白 RIP1 激酶已被证明可以调节坏死性死亡期间的基因表达。我们目前的实验挑战是对悬浮液生长的免疫细胞进行基因纵，特别是使用 CRISPR-Cas9 敲除 RIP1 激酶基因。
我们的协议具有两个明显的优势。它改进了使用慢病毒悬浮生长的免疫细胞的转染方法，并且在使用 CRISPR-Cas9 创建基因敲除过程中消除了单细胞克隆的需要，我们的结果为研究 RIP1 激酶在坏死性凋亡中高血糖转变中的作用铺平了道路。开始象限条纹，携带慢病毒载体的大肠杆菌将RNA引导到补充有每毫升100微克氨苄青霉素的Luria-Bertani或LB琼脂平板上。
将板在37摄氏度下孵育一到两天，直到在板上最稀薄的区域可以看到单个菌落。孵育后，使用无菌环，选择单个菌落并将其添加到 5 毫升 LB 肉汤中，并在 50 毫升锥形管中补充每毫升 100 微克氨苄青霉素。通风并用胶带粘住管盖。
将试管在 37 摄氏度和 225 RPM 的轨道振荡器中孵育 8 小时。同时，将40毫升LB肉汤加入40毫升，每毫升氨苄青霉素补充100微克，放入四个50毫升管中。孵育后，将 40 微升生长的培养物转移到四个管中的每一个中。
在将它们在 37 摄氏度和 225 RPM 的轨道振荡器中孵育 12 至 16 小时之前，将试管的盖子排气并用胶带粘住。第二天，在摆动的桶转子中以3， 220 x g离心培养物20分钟。将上清液倒入废烧杯中，并将所有四个沉淀混合到10毫升LB肉汤中，并辅以氨苄青霉素。
将组合的沉淀在摆动的桶转子中以最大速度离心 20 分钟，以获得单个沉淀，并将尽可能多的上清液丢弃到废烧杯中。将HEK293T细胞以 3 至 5 倍 10 的浓度接种到 6 个细胞的幂中，放入含有 DMEM 的 T25 烧瓶中。将烧瓶与 5% 二氧化碳在 37 摄氏度下孵育过夜。
同时，使用1：1：1：1比例的质粒和3：1比例的转染试剂与还原血清培养基的质粒DNA制备转染混合物。混合 75 微升转染试剂、2， 500 微升还原血清培养基和 25 微克总质粒 DNA。让混合物在室温下孵育 15 至 30 分钟。
接下来，小心地将转染混合物移液到含有培养基的烧瓶中的汇合HEK293T细胞上。轻轻旋转烧瓶以确保混合物充分均质，并在 37 摄氏度下孵育 48 小时。孵育两天后，将培养基从生产者HEK293T细胞烧瓶转移到 15 毫升锥形管中。
将试管以 800 x g 离心五分钟，以沉淀任何剩余的HEK293T细胞。小心地去除所有含有上清液的病毒，不要干扰沉淀，并将其转移到新的 15 毫升锥形管中。计数并计算所需的 U937 细胞悬液体积，以获得 2 x 10 的 6 个细胞的幂。
然后将细胞悬液在15毫升管中以400×g离心10分钟，并倒出上清液，将细胞沉淀留在管中。将细胞沉淀重悬于含有上清液的病毒中，并将试管以 290 x g 离心 60 分钟。离心后，使用移液器将沉淀与管中含有病毒上清液的沉淀重悬。
将管子放在首端旋转器上 60 分钟。然后将试管以 400 x g 离心 10 分钟，并将沉淀重悬于含有上清液的病毒和完全 RPMI 1640 培养基的 1：1 比例中，并补充有 10% 热灭活的 FBS。将细胞混合物转移到新的T25组织培养瓶中，并在37摄氏度下孵育48小时。
孵育后，将U937细胞以400×g 离心10分钟，并除去上清液。用完整的RPMI 1640培养基重悬沉淀，补充10%热灭活FBS和每毫升5微克嘌呤霉素。将细胞培养物转移到 T25 烧瓶中。
将细胞在 37 摄氏度下孵育两到三周，每隔一到两天检查一次细胞是否有生长迹象。Western blot分析证实，RIP1 CRISPR突变细胞中RIP1蛋白表达丢失，与野生型和非靶对照细胞中的强信号相比，没有可检测到的信号。TCZ处理诱导野生型和非靶对照细胞显著坏死性凋亡，坏死抑素-1s处理可逆转。
相比之下，与没有坏死抑素-1 作用的野生型和非靶对照细胞相比，RIP1 CRISPR 敲除细胞显示出显着较低的细胞死亡，表明 RIP1 功能丧失。活细胞荧光显微镜显示，TCZ处理后野生型和非靶对照细胞中线粒体超氧化物的产生显着增加，在坏死抑素-1s处理后减少。RIP1 CRISPR 敲除细胞表现出极少的线粒体超氧化物产生，没有观察到的坏死抑素 1s 处理效果。
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概述
本研究探讨了CRISPR/Cas9技术在创建受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）敲除人类细胞系中的应用。它突出了CRISPR的实用性，同时也关注了在特定实验条件下可能出现的复杂性。
关键研究组成部分
研究领域
- 遗传学
- 细胞生物学
- 信号通路
背景
- CRISPR/Cas9在基因修饰中的重要性
- RIPK1在细胞信号传导中的作用
- CRISPR应用中面临的挑战
使用的方法
- CRISPR/Cas9基因编辑
- 人类细胞系生物发生
- 敲除有效性分析
主要结果
- 成功创建RIPK1敲除细胞系
- 基因编辑过程中识别的挑战
- 对未来研究的影响讨论
结论
- 本研究证明了CRISPR/Cas9在创建特定基因敲除方面的有效性。
- 它有助于理解RIPK1，并强调了在基因研究中需要解决的实验挑战。
常见问题
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated knockout of RIP1 in U937 cells enables precise interrogation of cell death pathways, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This capability strengthens predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions for programs focused on regulated cell death. The approach is adaptable for functional genomics across diverse cell death regulators, enhancing translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional validation of RIP1 as a cell death regulator.
- Supports mechanistic de-risking by isolating RIP1-dependent pathways.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of necroptosis and related mechanisms.
- Provides a platform for evaluating the impact of gene knockout on cellular phenotypes.
Screening & Assay Development
- Generates validated knockout cell lines for downstream viability and ROS assays.
- Improves assay reproducibility by standardizing genetic backgrounds.
- Enables quantitative assessment of cell death and mitochondrial ROS outputs.
- Supports scalable screening of compounds targeting cell death pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cell death mechanisms.
- Provides continuity from genetic perturbation to functional phenotypic readouts.
- Enables risk-adjusted advancement of cell death modulators into preclinical models.
- Supports identification of translational biomarkers linked to RIP1 activity.
Pipeline & Workflow Integration
This knockout workflow integrates at the early discovery and target validation stages, providing a foundation for lead identification and preclinical evaluation of cell death modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of RIP1 function in cell death.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell systems for quantitative viability and ROS assays.
- Analytics: Enables robust measurement of cell death and mitochondrial ROS as functional readouts.
- Translational Research: Bridges genetic perturbation with disease-relevant phenotypes for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable knockout platform adaptable to other cell death regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death research.
- Operational Value: Standardizes knockout generation and functional validation workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell death-targeted programs and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and functional pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design and lentiviral delivery.
- Needs access to fluorescence microscopy and viability assay platforms.
- Demands rigorous validation of knockout efficiency and functional loss.
- May require adaptation for other cell lines or death regulators.
- Potential pitfalls include off-target effects and incomplete knockout, as addressed in the protocol.
