分离原代猪视网膜色素上皮细胞用于 体外 建模

我们构建疾病模型以模拟视网膜病变的某些特征。利用这些模型，我们可以通过观察视网膜色素上皮（RPE）细胞对物理变化的反应（例如单层细胞受到应变或BREX膜随年龄增厚）来更好地理解其在疾病中的作用。其中最大的挑战之一是获得具有代表性的细胞类型。

与常用的永生化细胞系相比，利用该技术分离的原代细胞使我们的疾病模型更接近眼睛内的真实情况。该技术为我们提供了一种获取高质量细胞的方法，且无需经历漫长的分化时间。此外，我们使用的是科研实验室常见的资源，因而更具成本效益。

接下来，我们希望研究眼睛在衰老过程中发生的自然变化如何导致年龄相关性黄斑变性（AMD）的早期阶段。我们希望更深入地理解这些变化，以便确定特定的治疗靶点。当来自美国农业部（USDA）检验过的肉店的摘除猪眼运抵实验室后，立即开始进行外部组织的清除。

用一只手握住附着在眼球上的肌肉，另一只手用手术刀轻轻切除巩膜周围组织。使用弯头虹膜剪修剪视神经，然后将角膜朝下放置于冰上。

解剖时，使用镊子将眼球转移至含有10%聚维酮碘溶液的孔中，并旋转眼球以确保其完全被覆盖。将一块无菌纱布放置在培养皿倒置的浅盖上。将细胞筛置于另一个培养皿中。

将眼球从聚维酮碘溶液中转移至含有DPBS的孔中，清洗约五秒钟，然后依次移至后续含有DPBS的孔中，以逐步稀释碘溶液。随后，将眼球放置于无菌纱布上。使用手术刀，在锯齿缘下方或距虹膜边缘约眼球直径1/3处做一小切口。

使用虹膜剪沿眼球赤道部与角膜平行方向均匀剪开。用镊子夹住视神经，轻轻将眼球从纱布上提起。将眼杯放入已准备好的细胞筛中，杯口朝上。

轻轻将冷却的DPBS加入眼杯中，确保液面略低于切口的最低点。首先，对从经美国农业部（USDA）检查的肉店获取的摘除眼球进行消毒和解剖，以制备眼杯。将眼杯内面朝上轻轻放入含有细胞筛网的培养皿中。

向眼杯中加入冷却的 DPBS，确保液面略低于切口的最低点。在手电筒照射下，观察神经视网膜开始从视网膜色素上皮脱离的区域。然后用钝头镊子轻轻夹住已抬起的神经视网膜，并将其剥离。

轻轻收集视神经盘附近的神经视网膜。使用连接至真空抽吸系统的巴斯德吸管，将神经视网膜抽吸出来。小心地加入额外的预冷 DPBS 以补充被抽吸的体积。

现在，吸除所添加的DPBS以去除残留的神经视网膜。在将所有眼杯中的神经视网膜去除后，轻柔地向每个眼杯中加入胰蛋白酶，并盖上培养皿盖子。将眼球样本在37°C、5%二氧化碳条件下用胰蛋白酶孵育30分钟。

在手电筒照射下，使用1,000微升移液器轻轻将每个眼杯中的视网膜色素上皮细胞剥离。将剥离的细胞转移至15毫升离心管中。用细胞培养基洗涤眼杯，以收集残留的细胞，并中和胰蛋白酶。

将含有细胞的上述培养基与先前收集的细胞混合。在室温下以 250 ×g 离心细胞悬液 5 分钟，然后在不破坏细胞沉淀的前提下弃去上清液。

将每个细胞沉淀重悬于三毫升 DNase 工作液中。将细胞悬液在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 15 分钟，然后在室温下以 150 ×g 离心五分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于三毫升新鲜细胞培养基中。

将两个到三个眼球中获得的细胞转移至六孔板的一个孔中，并将其视为第零代。随后，小心地将接种好的六孔板放入37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中。原代视网膜色素上皮细胞从猪眼球中分离得到，分离后三天可见特征性色素沉着。

细胞在一周后达到完全汇合，表明形成了健康的单层。出现异常形态和过度色素沉着的培养物被视为污染，不用于实验。