Name: 用于 体外 建模的原代猪视网膜色素上皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 了解原代猪视网膜色素上皮细胞的分离与培养方法，用于体外视网膜疾病模型构建。该技术提供高质量细胞来源，无需长时间分化，为研究年龄相关性黄斑变性等视网膜病变提供可靠工具。

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作者感谢 Farhad Farjood 在猪 RPE 细胞培养与分离方面的帮助，以及 Thomas Harris 在扫描电镜（SEM）方面的协助。作者感谢犹他州立大学显微技术核心设施在 SEM 分析方面提供的支持。该设施拥有一台通过美国国家科学基金会重大研究仪器项目资助（CMMI-1337932）购置的扫描电子显微镜。本研究的资金由美国国立卫生研究院资助项目 1R15EY028732（Vargis）和 BrightFocus 基金会资助项目 M2019109（Vargis）提供。额外资金由犹他州立大学研究办公室提供的本科生研究与创造性活动机会资助项目（Weatherston）以及犹他州立大学阿尔茨海默病与痴呆研究中心提供的种子基金（Vargis）提供。

本实验所用眼球来自当地经美国农业部（USDA）检查的屠宰场的动物尸体，实验过程中不涉及活体动物操作。动物被处死后约2小时进行眼球摘除。由于组织可能开始降解，因此在运输过程中需保持眼球低温以防止进一步腐败。在本操作中，眼球摘除后立即放入冰箱冷藏。随后，将装有眼球的袋子置于一个1000 mL聚丙烯烧杯内，并将其放入8 L的保温箱中，周围用冰块包围。注意切勿将眼球直接接触冰块。当眼球运抵实验室后，应在生物安全柜内立即进行视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离。此过程必须在3至5小时内完成。本方案已针对处理10只眼球的情况进行了优化。
1. 准备DNase储存液分装
注意：建议在进行分离之前完成此步骤。
<ol>
	<li>使用无菌去离子水配制 5 mM 氯化钙溶液。 
	注意：氯化钙粉末可能引起严重的眼部刺激或损伤。请佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>将 5 mM 氯化钙溶液加入脱氧核糖核酸酶（DNase）粉末中（参见材料表），使 DNase 的终浓度为 3 mg/mL。确保溶液充分混匀。 
	&#8203;注意：DNase 具有呼吸道致敏性危害。切勿吸入粉末/物质。</li>
	<li>将溶液分装成小体积，例如 1 mL，置于微量离心管中。</li>
	<li>将分装的溶液于 -20 °C 冷冻保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 设置解剖区域
<ol>
	<li>将无菌解剖器械和细胞培养设备转移至生物安全柜中：手术巾、培养皿、细胞滤网、孔板、纱布、镊子、手术刀柄、刀片和虹膜剪（参见材料表）。</li>
	<li>使用镊子铺开手术巾。将一个6孔板置于手术巾上，并取下盖子。</li>
	<li>将一份无菌的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）置于冰上，并放入生物安全柜中。</li>
	<li>在6孔板的一个孔中加入约半满（约6 mL）的10%聚维酮碘溶液。</li>
	<li>用预冷的DPBS填充其余各孔。</li>
	<li>取下一个培养皿的盖子，将其倒置放在手术巾上。将培养皿底部留作废弃物容器。</li>
	<li>将一份细胞培养基（杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素/抗真菌剂）和一份0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液放入37 °C水浴中预热。</li>
	<li>从冰箱中取出DNase储存液（更多细节见后续实验步骤）。</li>
</ol>
3. 外部组织去除
注意：眼组织外部处理可在生物安全柜外进行。切割前应检查眼球，确保巩膜未被刺穿、瞳孔无浑浊且视神经存在。不符合上述标准的眼球应予以弃用。
<ol>
	<li>用一只手握住附着在眼球上的肌肉，另一只手用手术刀轻轻切除巩膜周围组织。注意不要压伤眼球或意外切穿巩膜。若巩膜被切穿并暴露出黑色内部结构，则应弃用该眼球。 
	注意：建议用于握持肌肉的手佩戴防切割手套，以防意外割伤。</li>
	<li>使用弯头虹膜剪将视神经修剪至不超过 3 mm 的长度。若视神经过长，后续眼球杯将无法正确放入细胞筛中。</li>
	<li>将眼球角膜朝下放置于冰上。</li>
	<li>重复步骤 3.1–3.3，直至所有眼球的外部组织均被去除。</li>
</ol>
4. 眼球解剖
<ol>
	<li>使用镊子将眼球转移至生物安全柜中，并放入含有10%聚维酮碘溶液的孔内，旋转眼球以确保其表面完全被碘溶液覆盖。为尽可能保持工具无菌，该镊子仅可用于接触眼球外部。</li>
	<li>当眼球置于碘溶液中时，将一块无菌纱布放置于先前准备好的培养皿的浅层倒置盖上。在另一个培养皿中放置细胞筛网。仅使用细胞筛网支撑眼杯，不可用于细胞分离。</li>
	<li>让眼球在碘溶液中停留约30秒后，将其依次浸入含有DPBS的孔中进行清洗，每个孔约5秒，逐孔转移以逐步稀释残留的碘溶液，最后将眼球转移至无菌纱布上。</li>
	<li>使用手术刀在锯齿缘下方进行小切口，位置大约位于虹膜边缘向下约眼球直径的1/3处。</li>
	<li>完成切口后，使用虹膜剪沿眼球周长方向均匀剪开，剪切方向与角膜平行。操作眼球时，仅使用镊子接触眼球外部或通过纱布操作，以维持无菌状态。</li>
	<li>用镊子夹住视神经，轻轻将眼球从纱布上提起。玻璃体应自行脱离眼球。如有需要，可轻轻晃动眼球以帮助玻璃体脱落。 
	注意：若玻璃体难以取出，可尝试在眼球更低位置进行切口。</li>
	<li>将眼杯轻轻放入已准备好的细胞筛网中，使眼杯内面朝上。若位置不平整，可用镊子调整眼杯，使切口尽可能水平。</li>
	<li>向眼杯中轻轻加入冷却的DPBS，液面高度应略低于切口的最低点。此DPBS将在神经视网膜移除后被弃去。 
	注意：所加DPBS的体积因眼球大小和切口位置而异。</li>
	<li>重复步骤4.1–4.8，直至完成所有眼球的解剖。</li>
</ol>
5. 视网膜神经层的去除与视网膜色素上皮细胞的分离
注意：以下步骤分阶段操作更为简便。在此设置中，每次对一批样品（通常为3个眼杯）进行处理。对于步骤5.1-5.7，应先对整批样品完成每一个步骤，再进入下一步。
<ol>
	<li>在手电筒照射下，寻找神经视网膜（白色/粉红色）开始从视网膜色素上皮层（RPE，黑色）分离的区域。然后使用钝头镊子轻轻夹住已抬起的神经视网膜并将其剥离。 
	注意：若无神经视网膜自然分离的区域，可用镊子在眼球杯顶部附近轻轻夹取神经视网膜。采用此方法时，即使RPE/脉络膜受到损伤，这些细胞也不会在RPE收集过程中被解离。</li>
	<li>在视盘附近轻柔地收集神经视网膜。</li>
	<li>使用连接真空抽吸系统的巴斯德移液管抽吸神经视网膜。建议采用轻柔抽吸方式以促进去除过程。 
	注意：可在巴斯德移液管末端加装移液器吸头以降低吸力。</li>
	<li>小心加入额外的预冷DPBS，以补充被抽吸掉的液体。</li>
	<li>再次抽吸以去除残留的神经视网膜。此次操作应尽可能移除DPBS，同时避免扰动暴露的RPE。</li>
	<li>向眼球杯中轻柔加入胰蛋白酶。加入体积应低于切口线及任何受损RPE区域，以减少污染。 
	警告：胰蛋白酶是一种接触后可引起皮肤和眼睛刺激的酶。请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>向每只眼球加入胰蛋白酶后，确保盖上培养皿盖子。随后将培养皿转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>对每批样品重复步骤5.1–5.7，直至所有眼球杯均处理完毕。</li>
</ol>
6. 视网膜色素上皮细胞的收集
<ol>
	<li>从每批眼球（2-3 只眼）中收集视网膜色素上皮（RPE）细胞，并置于一个 15 mL 离心管中，以便简化接种过程。
	<ol>
		<li>在手电筒照射下，使用 1000 µL 移液器轻轻吹打，以分离 RPE 细胞。如果 RPE 细胞未脱落，可加入新鲜胰蛋白酶，并再孵育 10-15 分钟。注意不要刮伤视网膜。</li>
		<li>将 RPE 细胞收集至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>用细胞培养基洗涤眼杯，以收集残留细胞并中和胰蛋白酶。确保 15 mL 离心管中培养基的体积至少为胰蛋白酶体积的两倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 6.1，直至从所有眼杯中收集完 RPE 细胞。</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以 250 x g 离心 5 分钟。</li>
</ol>
7. 准备DNase工作液
<ol>
	<li>计算需要向细胞培养基中添加的 3 mg/mL DNase 储备液（在步骤 1 中配制）的体积，以达到每管细胞 3 mL 的终体积和 100 µg/mL 的终浓度（例如，对于三管细胞，共需要 9 mL 的 100 µg/mL DNase 溶液）。</li>
	<li>将适量体积的 DNase 储备液与细胞培养基混合。在工作溶液中使用 DNase 有助于防止细胞聚集，并使细胞能够均匀接种。</li>
</ol>
8. RPE 细胞接种
<ol>
	<li>在步骤 6.3 离心后，从每个 15 mL 离心管中移去上清液，注意不要破坏细胞沉淀。</li>
	<li>将每个细胞沉淀重悬于 3 mL DNase 工作液中。</li>
	<li>将含有重悬细胞的 15 mL 离心管放入 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，在室温下以 150 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>移去上清液，注意不要破坏细胞沉淀。</li>
	<li>将每个细胞沉淀重悬于 3 mL 新鲜的细胞培养基中。</li>
	<li>对于含有相当于 2–3 只眼球数量的 RPE 细胞的每个离心管，接种至 6 孔板中的一个孔（第 0 代）。</li>
	<li>小心地将接种后的 6 孔板转移至 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中。</li>
</ol>
9. 原代猪RPE细胞培养
<ol>
	<li>接种后的RPE细胞需静置培养48-72小时，待其充分贴壁后再移动培养板。首次更换培养基时，可用新鲜的细胞培养基进行洗涤，以去除多余的细胞碎片。</li>
	<li>每48小时更换一次细胞培养基。</li>
	<li>当细胞达到汇合状态时，更换为含2%胎牛血清（FBS）的细胞培养基，并维持该培养条件直至开展实验。</li>
</ol>
10. RPE 细胞验证
<ol>
	<li>免疫细胞化学（ICC）染色
	<ol>
		<li>用含4%甲醛的DPBS在室温下固定细胞10分钟。</li>
		<li>用DPBS洗涤两次。</li>
		<li>如需要，用含0.2% Triton-X 100的DPBS在室温下对细胞进行透化处理10分钟。</li>
		<li>用DPBS洗涤两次。</li>
		<li>加入含3%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的DPBS封闭液，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>加入一抗，稀释比例为1:100（或按厂家推荐浓度）（见材料表），在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜孵育。</li>
		<li>用DPBS每次5分钟，洗涤三次。</li>
		<li>如需要，加入二抗，浓度为2 µg/mL（或按厂家推荐浓度）（见材料表），在室温下孵育1小时。</li>
		<li>若使用了二抗，则用DPBS每次5分钟，洗涤三次。</li>
		<li>加入核染色探针，浓度按厂家推荐（见材料表），在室温下孵育25分钟。</li>
		<li>用PBS每次5分钟，洗涤三次。</li>
		<li>若细胞培养于细胞培养插件上，按照Rickabaugh和Weatherston等人的方法20，使用封片剂将插件封固于显微镜载玻片上并加盖盖玻片；否则，直接在DPBS中对细胞进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）
	<ol>
		<li>按照Harris等人的方法21进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>跨上皮电阻（TEER）
	<ol>
		<li>按照厂家说明书进行TEER测量（见材料表），在基底室中加入1 mL培养基15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶联免疫吸附测定（ELISA）
	<ol>
		<li>使用多重人源酶联免疫吸附测定试剂盒，按照厂家说明书进行ELISA15（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Cost-Effective Method for Isolating Primary RPE Cells from Porcine Eyes

<ol><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of Bruch's membrane.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).</li>
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<li>Georgiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+associated+signalling+proteins+ZO-1+and+ZONAB+regulate+retinal+pigment+epithelium+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice.</a> PLOS One. 5 (12), e15730(2010).</li>
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</ol>

本方案描述了如何从猪眼分离视网膜色素上皮（RPE）细胞。分离后7天内可观察到细胞色素沉着及鹅卵石样形态（图1B）。此外，经时跨上皮电阻（TEER）数据表明形成了紧密连接22，并形成了健康的单层细胞（图5）。这些结果表明，采用该方法分离的RPE细胞与人类RPE细胞相似，可用于视网膜细胞培养模型研究。
本研究中使用的眼球取自当地肉铺的动物宰杀后，也可从其他来源获得，例如使用猪源性产品的合作学术机构&#160;。动物死亡后应尽快开始实验操作，并在操作前保持眼球处于低温状态。在分离过程中，关键是要在胰蛋白酶消化后的吹打步骤之前避免破坏视网膜色素上皮（RPE）。在剥离神经视网膜时尤其需要格外小心，若操作不慎，可能用镊子夹住布鲁赫膜1，导致其他细胞类型混入溶液中。
尽管该实验步骤已针对我们的实验条件进行了优化，但方法学上仍可进行一些调整。例如，若需要特定的接种密度，可在DNase孵育后对细胞进行计数。此外，如果真空抽吸效果不佳，可使用小型弯头剪刀小心修剪以去除神经视网膜。在为实验进行细胞接种时，可采用较高的接种密度（如2.5 × 105 个细胞/cm2），以防止细胞过度增殖。另外，不建议反复传代，因为细胞可能开始丧失其原有的表型特征。本研究在实验中使用的是第1代细胞，但如果视网膜色素上皮（RPE）的表型和特性得以维持，后续代次也可能用于实验。最后，如需要，传代培养或实验时可使用1% FBS替代2% FBS。
该方法存在一些局限性。首先，难以复制或获得动物的年龄、性别、品种和死亡时间等信息，这是原代细胞分离中常见的问题。其次，过度胰酶消化会迅速导致细胞异常，Fietz 等人17也已注意到这一现象。然而，总体而言，该方法提供了一种经济且高效的方式以获取原代视网膜色素上皮（RPE）细胞。这些细胞不像诱导多能干细胞（iPSCs）那样需要漫长的分化时间。此外，这些猪源性 RPE 细胞天然具备微绒毛和色素沉着等关键结构15,16，而未分化的细胞则不具备。因此，这些细胞为视网膜研究提供了更具代表性的细胞类型。最后，对于无法获得人供体眼球的农村地区或机构而言，该方法可能极具价值，可用于构建类似于人类的视网膜模型，以研究视觉功能和相关疾病。

视网膜色素上皮（RPE）是位于外层视网膜的一层单层细胞&#160;Bruch膜与光感受器之间1视网膜色素上皮细胞通过紧密连接蛋白（如闭锁小带蛋白-1，ZO-1）相互连接，并具有色素沉着和六边形形态的典型表型特征。2,3这些细胞参与构成血-视网膜屏障，从而支持光感受器的健康并维持视网膜稳态4,5此外，视网膜色素上皮（RPE）细胞通过吸收光线并为光感受器循环利用关键组分，在视觉过程中发挥至关重要的作用6例如，RPE65是一种在RPE细胞中高表达的蛋白质，可将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇7,8鉴于视网膜色素上皮（RPE）细胞具有多种功能，其功能障碍与多种疾病相关，包括年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变9,10为了增进对视网膜病变的理解并开发新的治疗方法， 体外 视网膜模型常被使用。
为了构建健康或病变视网膜的代表性模型，必须使用具有模拟功能的视网膜色素上皮（RPE）细胞类型。 commercially available ARPE-19细胞系缺乏天然表型（如色素沉着），而诱导多能干细胞（iPSCs）的分化可能需要数月时间11,12,13。尽管人源供体眼球可能是理想选择，但大多数研究实验室往往难以获得。
在此，我们设计了一种利用猪眼获取原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，猪眼在许多方面与人眼具有相似性14。这些原代猪RPE细胞已被用于多种视网膜模型研究15,16。这些细胞不仅成本较低，而且相较于诱导多能干细胞（iPSCs）或供体眼睛，获取所需时间更短。此外，它们表现出天然的特征，如色素沉着和微绒毛。尽管已有类似的猪RPE细胞提取方案报道17,18,19，但本方法更为简便且步骤详尽，进一步验证了酶解离技术，并采用了大多数细胞培养实验室常见的实验材料。

<table><tbody><tr><td>6 孔玻璃底培养板，每孔含 14 mm 直径、#1 盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙，干燥，粉末，97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13191.30</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22-363-548</td><td>每眼一个</td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>8升冷藏箱</td><td>冰屋</td><td>32529</td><td></td></tr><tr><td>康宁&amp;nbsp;Transwell 多孔板，带可渗透聚酯膜插件</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>07-200-154</td><td>培养插件</td></tr><tr><td>耐切割手套</td><td>Dowellife</td><td>712971375857</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva&amp;nbsp;HyClone Dulbecco 磷酸盐缓冲液，溶液</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SH3026401</td><td>仅用于免疫细胞化学稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM，1×，含4.5 g/L葡萄糖，L-谷氨酰胺 &amp;amp; 丙酮酸钠</td><td>康宁</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>牛胰腺来源的DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/改良型 - 无钙 - 无镁</td><td>Cytiva</td><td>SH3002B.02</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ELISA试剂盒，Q-Plex 人血管生成（9重）&amp;nbsp;</td><td>美国犹他州洛根市 Quansys Biosciences 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENDOHM 6 TEER 检测仪</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Avantor</td><td>232B20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;牛血清白蛋白（BSA）无DNase和无蛋白酶粉末</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>手电筒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醛，ACS 级，36.5%（w/w）至 38.0%（w/w），LabChem</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>LC146501</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22-415-504</td><td>每眼一个</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 647，Invitrogen</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A32728</td><td>RPE65 二抗</td></tr><tr><td>冰&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>首选压碎</td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&amp;nbsp;NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>虹膜精细尖头剪，标准级，弯型，4.5&quot;</td><td>科尔-帕尔默</td><td>EW-10818-05</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪，11 cm，直型，碳化钨</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-822-379</td><td></td></tr><tr><td>LSM-710 共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100 mm × 20 mm&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>430167</td><td>每2-3只眼一个，另备一个用于解剖台面/废弃物处理&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液，10%</td><td>等同</td><td>49035-050-34</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 单克隆抗体 (401.8B11.3D9), Invitrogen</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA116578</td><td>RPE65 一抗</td></tr><tr><td>10号手术刀片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>3号手术刀柄</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-118-4164</td><td></td></tr><tr><td>手术巾，18 x 26&quot;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-209-1792</td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，95% 湿度</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>一个用于冲洗眼睛，一个用于接种&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三口聚丙烯烧杯，1000 mL</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-955-111F</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA 的 HBSS 溶液；不含 Ca、Mg 和碳酸氢钠</td><td>康宁</td><td>25053Cl</td><td></td></tr><tr><td>镊子式 20A</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>17-467-231</td><td></td></tr><tr><td>镊子式 2A</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-238-47</td><td>用于去除神经视网膜</td></tr><tr><td>镊子式 5-SA-PI</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>17-467-168</td><td></td></tr><tr><td>负压吸引系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃水浴 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 单克隆抗体（ZO1-1A12），FITC，Invitrogen</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>33-911-1</td><td>ZO-1 偶联一抗</td></tr></tbody></table>

分离原代猪视网膜色素上皮细胞用于 体外 建模

Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling

视网膜色素上皮（RPE）是外层视网膜中支持光感受器的关键单层细胞。RPE变性常见于以进行性视力丧失为特征的疾病中，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）。针对AMD的研究通常依赖人源供体眼球或诱导性多能干细胞（iPSCs）来获取RPE细胞。然而，这些RPE来源需要较长的分化周期，并且在培养过程中需要较高的专业技术水平。此外，一些研究机构，尤其是位于农村地区的机构，难以便捷获取供体眼球。尽管目前已有一种商业化的永生化RPE细胞系（ARPE-19）可用，但它缺乏某些关键特性 体内 RPE 特征在许多眼科研究出版物中尚未被广泛接受。迫切需要从更易获得且成本较低的来源获取具有代表性的原代 RPE 细胞。本方案详细阐述了从猪眼死后获取的原代 RPE 细胞的分离与传代培养方法，猪眼可从本地商业或学术供应商处获得。该方案仅需组织培养实验室中常见的材料。所得细胞是一种原代、已分化且成本较低的替代方案，可用于替代 iPSCs、人供体眼球以及 ARPE-19 细胞。

通过该方法，成功地从猪眼球中分离出原代视网膜色素上皮（RPE）细胞。图1A展示了分离后第3天的RPE细胞，具有典型的色素沉着特征。经过1周的培养，细胞完全汇合，形成健康的单层结构（图1B）。随后将细胞转移至细胞培养小室，在其中细胞保持了其色素沉着和形态特征（图1C），进一步证明了该分离方法的有效性。那些未表现出上述特征、反而呈现形态变异和过度色素沉着的培养物（图1D）被认为可能存在细胞污染，未用于后续实验。本研究中分离的RPE细胞表达RPE65蛋白，该蛋白在RPE细胞中高表达（图2）。RPE65表达水平较低的区域可能是由于色素遮蔽了荧光信号所致，因为这些区域对应于色素更密集的细胞（图2A）。分离得到的RPE细胞还表达另一种特征性蛋白——血管内皮生长因子（VEGF）。培养10天后，VEGF在RPE单层的基底侧表达量更高，浓度为2612.5 ± 28.0 pg/mL，而顶端侧的浓度为2141.2 ± 53.5 pg/mL（图3）。原代猪RPE细胞还具有微绒毛结构和鹅卵石样形态（图4）。此外，当细胞在细胞培养小室中生长时，经时跨上皮电阻（TEER）值从第7天的166.1 ± 75.9 Ω∙cm2上升至第14天的363.4 ± 9.0 Ω∙cm2（图5），表明随时间推移形成了稳定且健康的紧密连接22。为进一步探究连接结构的形成情况，对RPE细胞的ZO-1蛋白表达进行了分析，结果显示ZO-1定位于细胞边界，提示形成了健康的细胞连接并维持了单层完整性（图6）。
<img alt="显示细胞培养中纳米颗粒聚集的电子显微镜图像，用于说明聚集研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：原代视网膜色素上皮细胞（RPE）接种于培养板并进行传代培养后的形态。 分离后第3天的健康RPE细胞（A），分离后第7天完全融合的单层细胞（B），成功接种至培养小室的RPE细胞（C），以及RPE培养物中可能存在细胞污染的区域（箭头所示）（D）。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；细胞染色；红色、蓝色荧光；细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：免疫细胞化学图像显示猪RPE细胞中RPE65的表达。 接种后15天的明场（A）、RPE65（B）、细胞核（C）及合并图像（D）。请注意，明场图像中的颗粒状背景为多孔培养插件膜。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="VEGF浓度比较图表；顶端与基底；柱状图；统计学分析；生物学" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：VEGF 在 顶端的 和 基础的 RPE单层的两侧 通过在培养插件上培养细胞10天后进行ELISA测定VEGF浓度。误差线表示n = 2时的标准差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多孔结构的扫描电子显微镜图像；材料科学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：原代猪视网膜色素上皮（RPE）细胞的扫描电子显微镜（SEM）图像。 细胞培养30天后进行成像。比例尺 = 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电阻测量柱状图；7、10、14天的电阻值（Ω*cm²）；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：在细胞培养小室中培养的视网膜色素上皮细胞的TEER检测结果。 细胞培养7、10和14天后的电阻值。误差条表示标准差，n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig05largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养的荧光显微镜图像；A：相差图像，B-D：绿色/蓝色荧光染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：免疫细胞化学图像显示猪RPE细胞中ZO-1的表达。 接种后第6天在玻璃底培养板上的细胞明场（A）、ZO-1（B）、细胞核（C）及合并图像（D）。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案概述了从本地获取的猪眼分离和培养原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的步骤。这些细胞可作为干细胞的高质量替代物，适用于 体外 视网膜研究

视网膜色素上皮（RPE）是外层视网膜中至关重要的单层细胞，负责支持光感受器。RPE变性常...

我们构建疾病模型以模拟视网膜病变的某些特征。利用这些模型，我们可以通过观察视网膜色素上皮（RPE）细胞对物理变化的反应（例如单层细胞受到应变或BREX膜随年龄增厚）来更好地理解其在疾病中的作用。其中最大的挑战之一是获得具有代表性的细胞类型。与常用的永生化细胞系相比，利用该技术分离的原代细胞使我们的疾病模型更接近眼睛内的真实情况。该技术为我们提供了一种获取高质量细胞的方法，且无需经历漫长的分化时间。此外，我们使用的是科研实验室常见的资源，因而更具成本效益。接下来，我们希望研究眼睛在衰老过程中发生的自然变化如何导致年龄相关性黄斑变性（AMD）的早期阶段。我们希望更深入地理解这些变化，以便确定特定的治疗靶点。当来自美国农业部（USDA）检验过的肉店的摘除猪眼运抵实验室后，立即开始进行外部组织的清除。用一只手握住附着在眼球上的肌肉，另一只手用手术刀轻轻切除巩膜周围组织。使用弯头虹膜剪修剪视神经，然后将角膜朝下放置于冰上。解剖时，使用镊子将眼球转移至含有10%聚维酮碘溶液的孔中，并旋转眼球以确保其完全被覆盖。将一块无菌纱布放置在培养皿倒置的浅盖上。将细胞筛置于另一个培养皿中。将眼球从聚维酮碘溶液中转移至含有DPBS的孔中，清洗约五秒钟，然后依次移至后续含有DPBS的孔中，以逐步稀释碘溶液。随后，将眼球放置于无菌纱布上。使用手术刀，在锯齿缘下方或距虹膜边缘约眼球直径1/3处做一小切口。使用虹膜剪沿眼球赤道部与角膜平行方向均匀剪开。用镊子夹住视神经，轻轻将眼球从纱布上提起。将眼杯放入已准备好的细胞筛中，杯口朝上。轻轻将冷却的DPBS加入眼杯中，确保液面略低于切口的最低点。首先，对从经美国农业部（USDA）检查的肉店获取的摘除眼球进行消毒和解剖，以制备眼杯。将眼杯内面朝上轻轻放入含有细胞筛网的培养皿中。向眼杯中加入冷却的 DPBS，确保液面略低于切口的最低点。在手电筒照射下，观察神经视网膜开始从视网膜色素上皮脱离的区域。然后用钝头镊子轻轻夹住已抬起的神经视网膜，并将其剥离。轻轻收集视神经盘附近的神经视网膜。使用连接至真空抽吸系统的巴斯德吸管，将神经视网膜抽吸出来。小心地加入额外的预冷 DPBS 以补充被抽吸的体积。现在，吸除所添加的DPBS以去除残留的神经视网膜。在将所有眼杯中的神经视网膜去除后，轻柔地向每个眼杯中加入胰蛋白酶，并盖上培养皿盖子。将眼球样本在37°C、5%二氧化碳条件下用胰蛋白酶孵育30分钟。在手电筒照射下，使用1,000微升移液器轻轻将每个眼杯中的视网膜色素上皮细胞剥离。将剥离的细胞转移至15毫升离心管中。用细胞培养基洗涤眼杯，以收集残留的细胞，并中和胰蛋白酶。将含有细胞的上述培养基与先前收集的细胞混合。在室温下以 250 ×g 离心细胞悬液 5 分钟，然后在不破坏细胞沉淀的前提下弃去上清液。将每个细胞沉淀重悬于三毫升 DNase 工作液中。将细胞悬液在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 15 分钟，然后在室温下以 150 ×g 离心五分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于三毫升新鲜细胞培养基中。将两个到三个眼球中获得的细胞转移至六孔板的一个孔中，并将其视为第零代。随后，小心地将接种好的六孔板放入37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中。原代视网膜色素上皮细胞从猪眼球中分离得到，分离后三天可见特征性色素沉着。细胞在一周后达到完全汇合，表明形成了健康的单层。出现异常形态和过度色素沉着的培养物被视为污染，不用于实验。

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生物学

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