在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

我们的目标是理解机械信号和生化信号如何协调动物形态发生过程，包括细胞和分子对力的感知与响应。越来越多的分子被发现具有力学敏感性，可在不同张力水平下发挥不同的功能。然而，这些力敏感事件的生理背景及其功能在很大程度上仍不清楚。

由于力敏事件具有动态特性，本领域在很大程度上依赖高速荧光成像和延时记录来捕捉分子与细胞行为。许多荧光标记蛋白的亮度不足以进行成像，且成像过程需要具备特殊的时间分辨率，同时避免明显的漂白现象。另一方面，传统的免疫荧光方法仅能在固定后捕捉分子与细胞的自然状态或特征。

该方法可实现对主要信号通路中许多低丰度蛋白受体定位的动态追踪，这些通路包括 Notch、WNT 和 BMP 信号通路。最终，除了传统的线性信号级联外，我们还能够在亚细胞尺度上精确定位信号事件发生的时间与位置。首先，将 110 微升抗体混合液加入含有 Alexa Fluor 594 染料的试管中。

将离心管颠倒数次以充分混匀组分。将离心管置于旋转仪上，在室温下孵育一小时。然后从偶联试剂盒中组装纯化柱，并准备一个1.5毫升的树脂床。

将层析柱在室温下以1100G离心3分钟，以去除树脂中的过量液体。将反应混合物逐滴加入树脂柱顶部。在4°C下以1100G离心5分钟，收集标记抗体。

首先，将200只新孵化的成年黑腹果蝇放入一个圆柱形塑料笼中。用多孔金属网密封笼子的一端以通风，另一端用含酵母糊的果汁琼脂平板密封。在注射当天，将笼子中的琼脂平板更换为含极少量酵母糊的果汁平板。

将培养板置于 25 摄氏度孵育 1 小时以收集胚胎。随后将培养板从果蝇饲养笼中取出以终止产卵，并继续在 25 摄氏度孵育额外 2 小时，以获得 2 至 3 小时龄的胚胎。为去除胚胎的卵壳，向果汁培养板中加入 2 毫升 50% 次氯酸钠溶液。

使用画笔轻轻将胚胎从培养板上剥离，并将培养板孵育两分钟，每隔30秒旋转一次，以提高去除卵壳的效率。然后将胚胎与漂白液的混合物倒入70微米尼龙细胞筛中。用洗瓶中的水彻底冲洗胚胎，以去除残留的漂白液和酵母糊。

使用洁净的剃须刀片切割一块矩形琼脂糖凝胶，并将其放置在载玻片上。用画笔将滤网中的胚胎转移至凝胶块上，并沿凝胶块的中心线轻轻刷动，使胚胎均匀分布。接着，准备一把镊子，将其两个臂用胶带牢固地缠在一起，形成一个单一的尖端。

在解剖显微镜下，使用镊子挑选单个胚胎，并将其沿凝胶块的延伸边缘排列。用移液器吸取10微升正庚烷胶，滴加到24乘以50毫米盖玻片的中点位置。用移液器吸头将胶水涂抹成一个0.5乘以3厘米的矩形区域。

使用平头镊子轻轻提起涂有胶的盖玻片，将其稳定地悬于胚胎上方，确保胶面朝向胚胎并与之呈约45度角。轻柔地将盖玻片压向凝胶块，使胚胎接触胶液。迅速松开压力，并抬起盖玻片。

然后在新的载玻片中央滴加 10 微升水。将带有胚胎的盖玻片放置其上，确保胚胎面朝上。随后，在胚胎条的一端加入 40 微升卤代烃油。

倾斜载玻片，直至卤代烃油覆盖胚胎表面。首先，用五微升 Alexa Fluor 标记的 GFP 纳米抗体溶液填充每根针头。将一块 25 × 25 毫米的盖玻片置于玻璃载玻片表面。

用移液器吸取40微升卤代烃油滴加到载玻片上，并沿盖玻片边缘涂抹均匀。在显微注射镜下，将注射针尖置于浸没于油中的盖玻片边缘处。相应调整PicoPump的注射气压。

将空载玻片替换为已制备的果蝇胚胎玻片。使注射针尖垂直于胚胎的前后轴。使用 XY 载物台操纵器引导胚胎向针尖移动，直至针尖到达卵黄中心，然后泵注两到三次，将抗体注入卵黄中。

使用XY轴载物台操纵器将胚胎从注射针头移开，并移至下一个胚胎。让胚胎在25摄氏度下孵育，直至达到所需的发育阶段。孵育后，先在低倍物镜下用明场照明观察并识别胚胎，然后切换至40倍或63倍物镜进行高分辨率的荧光活体成像。

注射后，Notch受体的信噪比显著提高，可与免疫荧光的信号质量相媲美。此外，抗体注射使得在五分钟成像窗口内，以45秒为间隔对Notch定位进行时间分辨表征成为可能，且未见信号强度明显减弱。胚胎酪氨酸磷酸化的活体成像显示，酪氨酸磷酸化在三细胞连接处高度富集。

此外，还在顶膜中心下方观察到一种新的酪氨酸磷酸化信号群体。双色成像显示，该酪氨酸磷酸化信号群体位于中间区肌球蛋白附近。此外，中间区的酪氨酸磷酸化信号群体表现出与中间区肌球蛋白相似的脉冲式聚集和消散模式。