Name: 拟南芥脱硫早期叶绿素生物合成动力学测定的非侵入性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解拟南芥幼苗脱黄化早期叶绿素生物合成动力学的非侵入性测定方法。该技术利用高时空分辨率的叶绿素荧光成像，实现活体实时监测，为植物生理学和胁迫响应研究提供新途径。

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本工作由欧洲区域发展基金项目“SINGING PLANT”（编号：CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446）资助。本项目还通过MSCA4Ukraine项目（编号：1233580）获得欧洲联盟资助。我们感谢Lenka Sochurkova为图1提供的图形设计。

1. 培养基制备
<ol>
	<li>在玻璃瓶中将0.75 g凝固剂与50 mL无菌去离子水混合，配制培养基，使终浓度为1.5%（w/v），适用于一个培养皿（120 x 120 x 17 mm）。轻轻摇动混合物，然后在微波炉中加热至沸腾，以溶解凝固剂（溶液变为澄清）。</li>
	<li>将培养基冷却至58–60 °C后再进行后续操作。所有后续步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行，以防止污染。</li>
	<li>使用具有避光边缘的培养皿，以避免在测量过程中产生过强的激发光反射和高背景自发荧光。为此，可用黑色胶带（或其他可用材料）覆盖空培养皿的所有侧面（图2）。</li>
	<li>贴好胶带后，用杀菌紫外灯照射20–30分钟，对培养皿进行灭菌。</li>
	<li>若实验涉及化学处理（例如非生物/生物胁迫因子、植物激素和/或生长调节剂等），需将相应化学物质的适量添加至培养基中。注意所选化学物质在加入培养基后的稳定性（例如，若该物质不耐热，则应在培养基冷却至接近倒入培养皿前的温度时加入）。通过振荡充分混匀培养基，确保化学物质均匀分布。</li>
	<li>培养基倒入培养皿后应避免暴露于紫外光下（否则会导致氧自由基产生，可能干扰实验结果）。</li>
	<li>将配制好的培养基倒入方形培养皿中，并在室温下静置使其凝固。</li>
</ol>
2. 种子表面灭菌与植物生长条件
<ol>
	<li>从库存中取出所需量的 Arabidopsis thaliana Col-0 种子（10–20 mg），加入一个 2 mL 微量离心管中。 
	注意：在使用不同的 Arabidopsis 品系（生态型/突变体品系）时，无需进行特定修改。若用于其他植物物种，应根据种子大小、萌发率和幼苗大小的差异，对播种网格和测量步骤进行调整。</li>
	<li>向管中加入 70% 乙醇，对 Arabidopsis 种子进行表面灭菌，持续 2 分钟。灭菌期间轻轻振荡离心管。</li>
	<li>小心用移液器吸除乙醇，注意不要丢失任何种子。向管中加入无菌水清洗 5 分钟，以去除残留的乙醇（清洗期间轻轻振荡离心管）。</li>
	<li>让种子依靠重力沉降至管底，然后吸除剩余的水。</li>
	<li>按照步骤 3 的方法，再次用无菌水冲洗种子 2 次，以确保完全去除乙醇残留。让种子依靠重力沉降至管底，吸除剩余的水。</li>
	<li>向含有种子的管中加入等体积的无菌水，制成种子-水悬浮液。</li>
	<li>使用播种网格将特定基因型的种子-水悬浮液均匀地分配到培养基平板的指定区域（图 2 和 补充图 1）。使用宽口移液器吸头，在每个区域内沿直线均匀分布种子（约 30–40 粒）。</li>
	<li>将平板在超净工作台中敞开放置约 30 分钟，使种子区域的水分自然干燥，以防止污染。用微孔胶带密封平板，并用铝箔包裹。</li>
	<li>将种子在 4 °C 黑暗条件下进行 3 天的层积处理，以解除种子休眠（根据所用生态型而定）并促进萌发的一致性。</li>
	<li>将经过层积处理的平板转移至白光（150 µmol/m2/s）下照射 1 小时，以诱导萌发（仅在光照处理期间打开铝箔）。</li>
	<li>光照处理后，重新用铝箔包裹平板，以避免种子见光，并将平板垂直放置于培养室中，在 21 ˚C 黑暗条件下培养 4 天。</li>
</ol>
3. 叶绿素荧光测量与分析
<ol>
	<li>启动 iReenCAM 系统，并确保系统已准备就绪，且在自动启动的 PS 服务器软件中正确配置（例如，实验数据是否有足够的存储空间，荧光相机是否已连接至计算机等）。</li>
	<li>点击 实验 &#62; 新建实验，启动调度器软件以创建测量实验计划。为实验提供一个描述性名称，并填写详细信息（描述）。</li>
	<li>点击 添加操作，设置实验所需的各项操作，从而生成实验操作的时间表。 
	注意：此处“操作”一词指执行一次完整的实验（即包含进行一次培养板测量所需的所有步骤）。</li>
	<li>设定单次测量循环的条件（即光照/黑暗周期的持续时间）。</li>
	<li>点击 生成列表，定义各测量循环之间的时间间隔。选择每次循环的开始和结束时间（总共 4 小时），以及循环之间的间隔时间（在当前设置中，每 2 分钟进行一次循环）。</li>
	<li>点击 生成，并通过检查屏幕左侧生成的列表，确认光脉冲之间的时间范围和间隔是否正确。</li>
	<li>选择测量方案（补充图 2）。将所有修改保存至数据库，以供将来参考。</li>
	<li>在测量开始前，于暗室中使用低强度绿光（见材料表），调节测量室内部搁板的高度，或在移除培养皿上的铝箔之前完成其他准备工作。随后关闭光源，并在完全黑暗的条件下将培养皿转移至测量室中。</li>
	<li>小心移除覆盖在含有 4 日龄幼苗的培养皿上的铝箔。将培养皿水平放置于仪器测量室内部。在测量室内施加作用光脉冲，并根据步骤 3.1–3.7 中设定的实验计划（操作）进行成像。 
	注意：在将黄化幼苗的培养皿放入测量室之前，必须避免任何光照。对含有黄化幼苗的培养皿的所有操作均必须在暗室/暗箱中进行（可能的实验装置参见补充图 3）。</li>
</ol>
4. 数据提取与分析
<ol>
	<li>测量完成后，在分析软件中打开相应的实验。</li>
	<li>为分析幼苗的荧光，需生成两种掩膜：一种为覆盖幼苗所在区域的粗略（托盘）掩膜，另一种为仅覆盖目标组织（通常为子叶）的精确（植株）掩膜。</li>
	<li>通过点击生成托盘掩膜 创建新托盘类型 选项。将相应的基因型名称分配到平板图像上的对应区域。</li>
	<li>为分配基因型，请选择一个图像编号 圆形 然后点击 加载图像 屏幕上方。培养皿的图像将显示在屏幕上。通过点击代表不同形状的绘图工具按钮组中的任意一个补充图4），输入 新形状模式 可在平板图像上绘制目标区域。选择所需的区域（例如，平板上的不同基因型），并为其提供适当的命名。</li>
	<li>点击 退出 退出形状模式。单击以保存生成的托盘掩膜（需为其提供名称）。 储存托盘类型.</li>
	<li>返回上一步，通过从先前步骤中选择生成的掩膜名称来应用该掩膜 按托盘类型变化 选项</li>
	<li>为了高精度生成植物掩膜，使用测量开始后180分钟（第91轮）获取的图像来设定荧光信号强度的最小阈值，以实现背景噪声的扣除。为此，取消勾选 自动阈值 并设置一个 手动阈值 在 0（补充图4).</li>
	<li>点击 预览 确保托盘掩膜覆盖平板图像上的所有必要区域（基因型）。为此，请选择第91轮并点击 刷新预览.</li>
	<li>点击进入运行菜单 运行仅勾选第91轮，专门针对第91轮运行分析。然后选择输出路径并点击 开始分析.</li>
	<li>分析完成后，完成菜单将自动打开。从实验中选择已执行的轮次（将仅显示一个），然后单击 切换分析器至已分析数据 导出此特定时间点（第91轮）的数据。</li>
	<li>从导出的压缩包中提取 .xsel 文件，该文件包含关键的植物掩膜信息，方法是单击 开放导出部分 图标。</li>
	<li>通过点击重新打开实验 开放局部分析部分 图标。输入 掩膜生成器 再次点击菜单 加载图像，选择第一轮，然后 从文件加载 在屏幕右上角单击并加载先前提取的 .xsel 文件。将显示应用了托盘掩膜的平板图像。</li>
	<li>单击以保存掩膜 储存盘类型 并将其名称选中以应用 按托盘类型变更 选项</li>
	<li>通过调整荧光信号强度阈值生成植物掩膜。增加该值的数值 手动阈值 直到生成的掩膜在 预览 菜单与每种基因型的 ROI（例如子叶）完美匹配补充图4）。通过滚动查看所有轮次，检查掩膜是否适用于全部测量轮次（检查第1、61和121轮的掩膜位置是否正确即可）。 预览 菜单</li>
	<li>对所有测量轮次进行分析并导出数据。 
	注意：输出文件包含给定基因型在每个时间点的叶绿素荧光值，可用于绘制所需图表，并便于进一步的统计分析。</li>
</ol>

High-Resolution Imaging of Chlorophyll Biosynthesis in Arabidopsis Seedling

<ol><li>Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photomorphogenesis.</a> Arabidopsis Book. 10, e0147(2012).</li>
<li>Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+chlorophyll+biosynthesis--the+challenge+to+survive+photooxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation.</a> Cell. 86 (5), 703-705 (1996).</li>
<li>Heyes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocatalysis+as+the+%27master+switch%27+of+photomorphogenesis+in+early+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development.</a> Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).</li>
<li>Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+extraction+methods+that+prevent+the+artifactual+conversion+of+chlorophyll+to+chlorophyllide+during+pigment+isolation+from+leaf+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples.</a> Plant Methods. 9 (1), 19(2013).</li>
<li>Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+estimation+of+chlorophyll+a%2C+b+and+carotenoid+content+by+deconvolution+of+the+absorption+spectrum+and+new+simultaneous+equations+for+chl+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination.</a> Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).</li>
<li>Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+chlorophyll-a+and+chlorophyll-b+by+simultaneous+multicomponent+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Fresenius+J+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry.</a> Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).</li>
<li>Balakhonova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ireencam%3A+Automated+imaging+system+for+kinetic+analysis+of+photosynthetic+pigment+biosynthesis+at+high+spatiotemporal+resolution+during+early+deetiolation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation.</a> Front Plant Sci. 14, 1093292(2023).</li>
<li>Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+chlorophyll+formation+in+relation+to+structural+changes+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts.</a> Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).</li>
<li>Reinbothe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+biosynthesis%3A+Spotlight+on+protochlorophyllide+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction.</a> Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).</li>
<li>Kobayashi, K., Masuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+tetrapyrrole+biosynthesis+in+arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana.</a> Front Plant Sci. 7, 1811(2016).</li>
<li>Wang, Y., Folta, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+green+light+to+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Contributions of green light to plant growth and development.</a> Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).</li>
<li>Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+tetrapyrrole+biosynthesis+in+plants+and+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae.</a> Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).</li>
<li>Pipitone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+analysis+reveals+two+distinct+phases+of+chloroplast+biogenesis+during+de-etiolation+in+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis.</a> eLife. 10, e62709(2021).</li>
<li>Stirbet, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relation+between+the+kautsky+effect+%28chlorophyll+a+fluorescence+induction%29+and+photosystem+ii%3A+Basics+and+applications+of+the+ojip+fluorescence+transient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B-Biol%22%5BJournal%5D)">On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient.</a> J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).</li>
<li>Kupper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ojip+chlorophyll+fluorescence+kinetics+and+q%28a%29+reoxidation+kinetics+by+direct+fast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging.</a> Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).</li>
<li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li>
<li>Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+deficiency+hinders+etioplast+development+in+stems+of+dark-grown+pea+%28pisum+sativum%29+shoot+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures.</a> Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).</li>
<li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nondestructive+method+to+estimate+the+chlorophyll+content+of+arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Met%22%5BJournal%5D)">A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings.</a> Plant Met. 13 (1), 26(2017).</li>
<li>Pérez-Patricio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+method+for+estimating+the+chlorophyll+contents+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves.</a> Sensors. 18 (2), 650(2018).</li>
<li>Spyroglou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+models+as+a+tool+for+comparing+groups+of+time+series+in+plant+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Plants+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences.</a> Plants (Basel). 10 (2), (2021).</li>
<li>Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrapyrrole+metabolism+in+arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+book+%2F+Am+Soc+Plant+Biol.+9%22%5BJournal%5D)">Tetrapyrrole metabolism in arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis book / Am Soc Plant Biol. 9. 9, e0145(2011).</li>
<li>De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+hormonal+regulation+of+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development.</a> Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).</li>
<li>Liu, X., Li, Y., Zhong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+light+and+plant+hormones+in+the+control+of+arabidopsis+seedling+chlorophyll+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis.</a> Front Plant Sci. 8, 1433(2017).</li>
</ol>

Z.B. 和 K.P. 是 PSI 的员工，Martin Trtilek 是生产 iReenCAM 的 PSI 公司的首席执行官和所有者。如前所述，这些作者均参与了该仪器的开发7。

实验方案的关键步骤与故障排除——避免光照并妥善保护遮光板 
如上文实验方案描述中所强调的，在黄化幼苗培养期间或实验开始前，即使极微量的光照也必须严格避免，这一点至关重要11。在我们的实验设置中，使用一个专用的暗室，该暗室位于步入式植物生长室（phytotron）内，并通过密闭旋转门与生长室其他区域完全隔光（补充图3）。该暗室配备有植物培养空间和工作台，可同时容纳实验装置、控制用计算机以及通风橱。这一设置使我们能够在完全黑暗条件下培养植物，并在无需转移培养板的情况下直接开始测量。
植物培养方式及掩膜生成方法对于后续通过本实验方案进行叶绿素荧光信号的定量至关重要。应避免培养基中出现凝胶剂团块或微小的可见杂质/灰尘，因为这些物质可能导致光线反射。由于软件对叶绿素荧光的识别受限于掩膜范围，未被掩膜覆盖的植物区域将不会被软件分析。在4小时的测量过程中，幼苗会略有生长或移动，因此预设的掩膜可能需要调整，否则无法在整个测量过程中保持贴合，从而影响信号强度定量的准确性。根据我们的经验，掩膜定义不完善似乎是造成数据变异性的主要来源。在优化实验中，我们监测了分析所用的叶绿素荧光值的变异性变化，比较了以下情况：i）单株幼苗，以及播种密度 ii）较高（30–40粒种子）和 iii）较低（10–15粒种子）的一组幼苗（补充图5）。我们采用了较高的播种密度，因其表现出最低的变异性。单株幼苗或低密度播种情况下较高的变异性，主要源于位于信号与背景交界处的像素比例更高，以及幼苗在4小时测量期间发生的轻微移动。
为确保所有测量结果准确，需检查植物掩膜是否与第一轮拟合，然后至第15轮th, 30th, 45th, 60th 75th 以此类推，直至最后一轮（选择轮次编号并点击） 刷新预览）。这仅需几分钟，但可确保整个子叶区域被完全覆盖并得到评估。如果在任何一轮中植物掩膜未能贴合（所需区域未被完全覆盖），则将实验分为多个部分，然后从第4步（4.1–4.13）开始分别对实验的每一部分执行方案，以单独创建相应的掩膜。例如，若发现第60–61轮（或稍早）植物掩膜发生位移，可将实验分为两部分——1st 第1至60轮部分和2nd 第（61-121轮）。对于第1部分st 部分使用第41轮的图像生成植物掩膜并用于第2轮nd 部分使用第91轮。在步骤4.13分析数据时，点击之前务必根据实验的相应部分选择正确的轮次（例如，第一部分为第1–60轮，第二部分为第61–121轮，如前述示例所示） 分析. 当操作时 拟南芥植物的运动可以忽略不计，因为它们生长相对缓慢；但如果将该方案应用于不同物种（见下文），则应考虑其生长速度。
修改与局限性 
可调整的参数数量包括作用光的强度和波长，以及在作用光照射间隔期间施加的光照条件。测量装置配备有集成的全电动化、软件控制的滤光轮。因此，若添加适当的滤光片，该方案中也可纳入适用于定量其他色素（通常也为四吡咯生物合成途径产物10,12）的测量算法。
此外，如前所述，该方案不仅可用于拟南芥（Arabidopsis）植物。然而，在处理其他植物物种时，应根据物种特异性特征（包括萌发速率、生长速度和/或植株大小）对方案的每一步进行相应调整（补充&#160;图6）。
该实验方案的一个重要限制在于叶绿素定量分析可进行的时间范围。当叶绿素整合到光系统复合物后，由于光合作用对能量的消耗，荧光信号会受到干扰（即出现可变叶绿素荧光），这一点已在去黄化后期阶段被观察到13。通过OJIP瞬态分析法14,15检测发现，在去黄化的最初4小时内，本实验体系中未检测到任何光合作用活性的迹象7。然而，如果需要对光形态建成的更长时间阶段进行检测，则应验证光系统组装的程度以及光合作用对整体荧光水平可能产生的影响。
最后需要说明的是，我们的方案基于荧光测量，仅能实现叶绿素的相对定量，而非绝对定量。若需进行绝对定量，则必须使用其他方法（如高效液相色谱法）进行相应的校准。
相较于现有方法的意义——一种简单、快速且统计学上稳健的叶绿素定量方法，具有高时间分辨率和高空间分辨率 
此处所述方法可实现对活体中叶绿素的实时检测与定量 拟南芥 去黄化早期阶段的幼苗。与其他主要依赖从离体植物材料中提取叶绿素的方法相比16,17 或近期发展的光学方法18,19 该方法完全无创，可通过叶绿素定量分析 体内 荧光强度的测量。此外，与现有的其他替代方法（包括前述基于高效液相色谱法或分光光度法的方法）不同，该方法无需额外的样品制备试剂。新引入的方案简单、快速且准确，此前已通过高效液相色谱法验证。5使用标准实验方案设置，单次生物学重复的最终曲线由4小时内采集的120个测量点（荧光强度均值）组成，每个测量点最多包含15个测量位点。通常，最终曲线包含三次生物学重复（例如，三个独立制备的培养板）的数据，以及每个生物学重复中三个测量位点（三次技术重复），每个位点包含30至40株幼苗。因此，在每个时间间隔内约有300株幼苗被检测，从而获得具有统计学可靠性的数据集，能够可靠地检测出即使是在叶绿素生物合成不同步骤中受影响的突变体所表现出的微小差异。7本文建议使用者采用近期开发的统计方法，即将广义线性混合模型与经典时间序列模型相结合的方法，作为叶绿素动力学数据分析的合适工具。20.
该技术的未来应用——快速且低成本的筛选 
上述特点使该方法成为一种适用于快速且低成本筛选的有效工具，可用于与叶绿素生物合成相关（直接或间接）性状的高精度定量分析。这可能包括利用正向遗传筛选研究，以更深入地阐明叶绿素生物合成复杂且多层次的调控机制10,12,21。考虑到可进行多种化合物处理，该方案在研究光介导的激素调控作用22,23，或筛选可能影响叶绿素积累动力学的小分子化合物方面也具有重要价值。

去黄化是植物生命周期中最显著的阶段，其特征是发生一系列形态学变化以及植物代谢的彻底重组（从异养转变为自养）1。叶绿素的生物合成是植物光诱导去黄化的标志性过程，也是一个高度动态的过程。由黑暗条件下积累的前体原叶绿素酯转化为叶绿素必须受到严密协调，以避免因活性副产物造成损伤2。原叶绿素酯还原为叶绿素酯的过程由光依赖型原叶绿素氧化还原酶（PORs）催化，这类酶是可直接被光激活的独特酶类。该反应速度极快，可在毫秒至秒级完成3，在黄化幼苗接受光照后数分钟内即可观察到明显的叶绿素积累4,5,6。而叶绿体的生物发生则需要更长时间（从数小时到数天），才能建立起功能完整的光合作用系统3。
目前存在多种分析叶绿素含量的方法，包括高效液相色谱法（HPLC）或分光光度法。通常，这些技术需要破坏植物组织4,5,6，从而限制了对叶绿素水平随时间变化的连续测定。能够实现非侵入性叶绿素动力学检测的方法，可能为植物研究开辟全新的视角，涵盖从基础科学问题（例如，时空维度下叶绿素合成过程的分析）到更实际的应用（例如，评估植物胁迫耐受性或生物刺激剂对叶绿素动力学的影响）等多个方面。基于此，我们开发了一套用于监测叶绿素形成的系统——iReenCAM7。该系统包含一个CCD相机、发射滤光片、光源以及自动化荧光分析流程（图1）。该设备的主要特点是具备高空间和时间分辨率，在当前常用方法所采用的参数方面表现更优，并且与标准分析方法相比，具有足够的灵敏度和特异性7。
此处描述的非侵入性操作步骤简单，所需试剂极少，可在活体植物中获取叶绿素动力学曲线 拟南芥 幼苗在去黄化过程的极早期阶段。该方案可用于研究受多种内外因素影响的、高度动态的叶绿素合成过程，其中外源因素包括盐胁迫、干旱、生物刺激素、重金属等，内源因素通常与基因活性变化相关，且无需分离任何植物组织，从而避免了额外的胁迫。

<table><tbody><tr><td>6-苄氨基嘌呤</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>B0904.0001</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Merck</td><td>Z691577</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Arabidopsis thaliana Col-0 种子&lt;/em&gt;</td><td>NASC 菌种库</td><td>N1092</td><td></td></tr><tr><td>培养室</td><td>PSI</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>042780.AK</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 单通道可调移液器（100–1000 &amp;mu;L）</td><td>Merck</td><td>EP3123000063</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（Gelrite）</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>iReenCAM 装置</td><td>PSI</td><td></td><td>定制/原型</td></tr><tr><td>实验室瓶（Duran），带盖，100 mL</td><td>Merck</td><td>Z305170-10EA</td><td></td></tr><tr><td>层流洁净工作台</td><td>UniGreenScheme</td><td>ITEM-31156</td><td></td></tr><tr><td>无衬橡胶接头胶带，19 mm 宽，黑色，Scotch</td><td>3M Science. Applied to Life</td><td>7000006085</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，2 mL 带盖，PPT 材质，BRAND</td><td>Merck</td><td>BR780546-500EA</td><td></td></tr><tr><td>微孔胶带</td><td>3M Science. Applied to Life</td><td>7100225115</td><td></td></tr><tr><td>Osram lumilux green l18w/66</td><td>Ovalamp</td><td>200008833</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 — Greiner 方形培养皿，120 × 120 × 17 mm，带通风孔</td><td>Merck</td><td>Z617679-240EA</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1000 &amp;mu;L，Axygen</td><td>Merck</td><td>AXYT1000B</td><td></td></tr><tr><td>Plant Screen 数据分析软件</td><td>PSI</td><td></td><td>作为 iReenCAM 的一部分提供</td></tr></tbody></table>

早期阶段叶绿素生物合成动力学的无创检测方法 拟南芥 去黄化

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

叶绿素生物合成是植物去黄化过程的标志性事件，而去黄化是植物生命周期中最显著的阶段之一。在开花植物从黑暗转入光照条件时，会触发叶绿素生物合成这一严格调控且高度动态的过程。当黄化的幼苗首次接触到阳光的瞬间，原叶绿素酸酯会在独特的光受体蛋白复合物介导下，在数秒内迅速转化为叶绿素酸酯，并通过后续一系列代谢步骤，最终生成具有完整功能的叶绿素。传统的叶绿素含量分析技术通常依赖于从离体植物组织中提取色素，这种方法不适用于研究如此快速的生理过程。为了在光照诱导去黄化后的最初几小时内，以高精度和高时空分辨率在活体（in vivo）条件下研究叶绿素的动态变化，研究人员开发了一种专用仪器和相应实验方案。本文介绍了一种针对拟南芥（Arabidopsis）去黄化早期阶段叶绿素进行统计学上可靠定量的详细实验流程。

使用新开发的程序在4天龄去黄化幼苗中获得的典型结果 拟南芥 野生型（WT）、生态型Columbia-0（Col-0）的幼苗如图所示 图3在对照条件（添加DMSO的MS培养基）下，叶绿素生物合成曲线表现为叶绿素合成的初始爆发阶段，这是因为在暗形态建成生长阶段合成的原叶绿素酯池在光照诱导的PORs作用下迅速转化为叶绿素7,8,9快速叶绿素积累的初始阶段大约持续10分钟，随后进入一个滞后期，此时暗合成的原叶绿素酸酯达到最低值（约在光照后30分钟；原叶绿素酸酯的HPLC测定曲线见7。在滞后期，叶绿素生物合成基因被上调10，导致原叶绿素酸酯的光诱导生成。新合成的原叶绿素酸酯迅速转化为叶绿素，表现为指数相（在野生型Col-0中，约在光照后120分钟开始），随后在去黄化幼苗光照约4小时后进入另一个滞后期。图3）。在含有6-苄氨基嘌呤（BAP）的条件下，首个显著差异在指数生长期即可被检测到7，表明BAP在叶绿素生物合成的后期阶段（约在开始给予作用光后2小时）对叶绿素动力学具有抑制作用； 图3).
为了比较不同条件和/或基因型，必须对原始数据进行归一化处理。由于在去黄化幼苗中，通过HPLC在各种条件和/或不同基因型下均未检测到叶绿素，因此我们将数据归一化（F/F0）至相应处理和/或基因型在T0时刻测得的初始荧光水平（F0）7。为了说明归一化的重要性，我们同时展示了原始数据以及归一化至T0时刻对照组平均叶绿素荧光值（F0）后的数据（分别为图3A和图3B）。
<img alt="使用iReenCAM分析的种子萌发示意图；植物培养，荧光测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66087/66087fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：测量设备协议概览。 iReenCAM测量与分析流程示意图。(A) 通过网格定义的种子播种、层积处理、光诱导萌发以及垂直放置的培养皿在黑暗条件下进行植物培养的样品制备过程。(B) 基于PlantScreen表型分析软件工具箱的控制模块，可实现自动且可编程的图像采集和数据管理，通过控制并同步硬件操作与用户自定义的测量及分析协议，协调整个系统的运行。(C) 测量协议设计为对荧光样品图像进行动态测量，每2分钟一次，持续4小时，共120轮测量。以获取于180分钟时的代表性伪彩色图像时间可视化帧用于生成感兴趣区域（ROI）掩膜。(D) 将定义感兴趣组织区域（如子叶、下胚轴或根区）的掩膜应用于时间可视化帧，执行背景扣除，并逐像素提取所有测量轮次中各感兴趣区域（由植物掩膜定义）的荧光值。最后，原始数据（荧光强度F）被归一化至T0时刻的平均荧光值（F0）。比例尺 = 1 cm（A）和0.25 cm（C）。该图改编自7。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/66087fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静力学平衡分析、表格中的方程、实验结果、实验室环境。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66087/66087fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：种子放置。 该图显示使用锯齿状网格将拟南芥（Arabidopsis）种子放置在具有避光边缘的培养皿上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/66087fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="叶绿素荧光图，野生型DMSO与BAP处理，时间序列数据分析，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66087/66087fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：拟南芥去黄化早期阶段叶绿素积累动力学。 黄化后的野生型Col-0幼苗在添加BAP或DMSO（对照）的培养基上生长。(A) 原始数据的平均值±标准差（阴影区域），n=9；(B) 数据经T0时刻（F0）平均荧光值归一化处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/66087fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：播种网格 左：播种网格，带有标出的矩形框，用于将每种基因型的种子放置在检测区域中光照均匀的位置（光强 ≥ 最大光强的 0.7）。右：4 日龄黄化幼苗的示意图 拟南芥 用于分析的幼苗培养。播种网格提供了一种可行的方案 拟南芥 种子定位以确保光照均匀性和适当的种子密度（每个槽位均可用于放置种子，因为槽位尺寸、槽位间距以及网格区域内的光照均匀性均经过统一设计）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/Balakhonova_Pushkarova_Figure_S1_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图2：荧光测量方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/Balakhonova_Pushkarova_Figure_S2_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：可避免非预期光照的实验配置。（A） 测量装置被放置于步入式植物生长室中， （B） 通过避光门进入腔室。 (C) 的 体外 用于在特定条件（温度和相对湿度）下培养黄化幼苗的培养箱（红色箭头）放置在设备正下方（黄色箭头），以最大程度降低光照暴露风险。微弱绿光光源（蓝色箭头）安装在控制电脑（橙色箭头）旁边的墙壁上。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/Balakhonova_Pushkarova_Figure_S3_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图4：使用PS数据分析软件在工作流程中生成掩膜的步骤。 打印生成托盘掩膜（步骤4.3-4.6）和植株掩膜（步骤4.12）以及进行数据分析（步骤4.7和4.13）时所需执行的各个步骤的截图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/Balakhonova_Pushkarova_Figure_S4_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图5：播种密度对测量变异性的影响 4天大黄化幼苗中叶绿素积累动力学 拟南芥 野生型Col-0幼苗培养 （A） 单独（作为单个幼苗，此处 n=5）或成组 （B） 高（HD，n=30-40）或 (C) 低密度（LD，n=10-15）. n 表示播种网格每个槽中的幼苗数量，数据代表均值 ± 标准差（阴影区域）。高密度或低密度对应于上述播种网格每个槽中的幼苗数量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/Balakhonova_Pushkarova_Figure_S5_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图6：培养间隔与空间需根据物种进行特异性优化。 利用多种植物物种的生长 拟南芥-优化方案 （A） 播种网格上的种子放置。 （B） 4天大的黄化幼苗（从左到右） 拟南芥, 芸薹属油菜（Brassica napus）， 和 Crambe abyssinica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66087/Balakhonova_Pushkarova_Figure_S6_RE.jpg" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

本文介绍了一种先进的工具，用于监测拟南芥（Arabidopsis）幼苗去黄化早期阶段的叶绿素生物合成过程。该新方法可实现高空间和时间分辨率的非侵入式实时叶绿素荧光成像。

叶绿素生物合成是去黄化过程的标志性特征，而去黄化是植物生命周期中最显著的阶段之一。该过程受到严密调控且高度...

叶绿素合成是一个高度动态的过程，因此有必要具备高时间和空间分辨率的测量能力。我们提出了一种高精度的方法，可在去黄化过程的最初几小时内，在活体中追踪叶绿素的合成过程。通常，叶绿素的测定采用高效液相色谱法或分光光度法。此外，一些新的光学方法也正在被提出用于叶绿素的测定。叶绿素的合成是一个非常快速的过程，可在数秒内由微量的光触发。近期的方法大多具有侵入性，需要破坏组织，因此难以以足够的时间分辨率准确量化叶绿素生物合成这一高度动态的过程。我们能够在活体黄化幼苗接受首次光照脉冲后，以及随后的四小时内，以高时间分辨率和空间分辨率测定叶绿素的动态变化。本方法具有高精确度和统计稳健性，使我们能够研究各种因素在去黄化各个阶段中的影响。该方法为非侵入性，具备高准确性和空间分辨率，为后续研究开辟了新的可能性，包括探讨胁迫或生物刺激剂可能产生的影响。由于其通量相对较高，也可用于正向遗传学研究，以阐明植物去黄化这一高度复杂的过程。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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