Name: 微创小鼠喉镜检查用于呼吸和吞咽时喉部运动的特写成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解微创小鼠喉镜检查技术，用于在呼吸和吞咽过程中对喉部运动进行纵向高清成像。该方法结合优化麻醉方案与精细内窥镜操作，为研究神经疾病中的喉功能障碍提供客观评估工具。

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本工作部分由两项美国国立卫生研究院（NIH）资助项目支持：1）来自国家心肺血液研究所（NHLBI）的多项目负责人（TL 和 NN）R01 资助项目（HL153612）；2）来自国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）的 R03 资助项目（TL，DC0110895）。我们自主开发的喉部运动追踪软件部分由库尔特基金会（Coulter Foundation）资助项目（TL &amp;#38; Filiz Bunyak）支持。感谢 Kate Osman、Chloe Baker、Kennedy Hoelscher 和 Zola Stephenson 为实验室啮齿类动物提供的优质护理。我们同时感谢密苏里大学物理仪器车间的 Roderic Schlotzhauer 和 Cheston Callais，他们在定制内窥镜平台的设计与制造，以及对商用内窥镜和显微操作器进行满足本研究需求的战略性改造方面提供了重要支持。我们自主开发的喉部运动追踪软件是与 Filiz Bunyak 博士和 Ali Hamad 博士（密苏里大学电气工程与计算机科学系）合作开发的。我们还感谢卡尔·史托斯内窥镜公司（Karl Storz Endoscopy）的 Jim Marnatti 在耳镜选型方面提供的指导。最后，我们谨向 Lever 实验室以往众多学生和受训人员致以谢意，他们的贡献为当前小鼠喉镜检查方案的建立奠定了基础：Marlena Szewczyk、Cameron Hinkel、Abigail Rovnak、Bridget Hopewell、Leslie Shock、Ian Deninger、Chandler Haxton、Murphy Mastin 和 Daniel Shu。

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

我们已成功开发出一种可重复的小鼠特异性喉镜检查方案，能够近距离观察呼吸和吞咽过程中的喉部运动。重要的是，该方案可在同一动物身上进行多次操作，以研究各种病理状态对喉功能的特定影响。该方案在过去十年中逐步建立，并经历了大量改进和问题排查。其中最大的挑战是麻醉方案的优化，以避免麻醉过量导致吞咽动作消失和/或引发呼吸困难相关死亡的风险。我们最初使用异氟烷（ISO），但发现其会导致吞咽动作完全消失、唾液过度分泌（阻碍内窥镜观察）以及对操作人员暴露的风险，这些因素均被视为在本操作中使用ISO的严重禁忌证。因此，我们转而采用氯胺酮-赛拉嗪（KX）组合，因其是啮齿类动物常用的麻醉方案33,34,35。
我们最初在小鼠中开展实验方案的开发14,22,<sup class="xr...

喉是一个位于咽喉部呼吸道与消化道交叉处的软骨性器官，其功能类似于阀门，可精确调控空气（如呼吸和发声时）与食物、液体（如吞咽时）的流向和流量。多种疾病均可影响喉部功能，包括先天性疾病（如喉软化症、声门下狭窄）、肿瘤性疾病（如喉部乳头状瘤病、鳞状细胞癌）、神经系统疾病（如特发性喉麻痹、脑卒中、帕金森病、肌萎缩侧索硬化）以及医源性损伤（如头颈部手术中意外造成的损伤）。无论病因如何，喉功能障碍通常表现为呼吸困难、声音障碍和吞咽困难这三大症状，对患者的经济状况和社交生活产生负面影响1,2,3,4。
此外，吞咽困难（尤其是对身体状况脆弱的患者）可能导致吸入性肺炎（食物或液体通过未完全闭合的喉部进入肺部），并引发相关发病率、反复住院以及早亡5,6。尽管后果严重，目前针对喉功能障碍的治疗方法仍主要集中于外科和行为干预，通常无法恢复正常的喉部功能1,2,7,8,9,10，因此迫切需要创新性解决方案。为实现这一目标，我们正在开发一种实验性内镜方法，用于在啮齿类动物（即小鼠和大鼠）模型中研究喉功能障碍。
在人类医学中，评估喉部功能障碍的金标准是内窥镜可视化检查，即喉镜检查11,12。通常将一根柔性内窥镜经鼻腔插入以检查喉部，特别是声带以及邻近的声门上区和声门下区喉部结构。也可使用硬质内窥镜经口腔观察喉部。这两种方法均可对喉部解剖结构进行宏观检查，并可用于评估呼吸、发声以及咳嗽和喉内收反射等多种气道保护反射过程中的喉部活动性与功能13,14,15,16。然而，在吞咽过程中，会厌向后翻转覆盖喉入口，完全遮挡了喉部，从而防止食团或液团进入气道。因此，在人类中无法直接观察吞咽过程中的喉部运动，必须通过其他诊断方法间接推断（例如透视检查、肌电图、电子喉镜图）。
本文介绍了一种创新的小鼠和大鼠喉镜检查方案，可在轻度麻醉条件下实现对呼吸及吞咽过程中气道保护机制的近距离、无遮挡成像。该方案可与多种市售内窥镜系统联用，并结合定制平台，在整个操作过程中固定麻醉后的啮齿类动物。重要的是，内窥镜平台的具体设计和配置可根据各实验室的可用资源和研究目标灵活调整。本文旨在为研究人员在其特定研究背景下提供参考指导。此外，我们还希望展示该喉镜检查方案如何产生大量客观数据，从而激发对喉部功能障碍与再生机制理解的新见解。
本小鼠喉镜检查方案中所述所有步骤的综合作用，可实现对成年小鼠喉部进行微创检查，且可在同一只动物上重复进行，以检测和表征随着时间推移，因医源性损伤、疾病进展和/或治疗干预所引起的喉功能障碍，尤其针对气道保护功能的变化。需要注意的是，本方案不评估与发声相关的喉部功能。

<table><tbody><tr><td>阿替美唑</td><td>Zoetis</td><td>Antisedan；5 mg/mL</td><td>新泽西州帕西帕尼-特洛伊希尔斯</td></tr><tr><td>生物信号放大器</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>DP-304</td><td>康涅狄格州哈姆登</td></tr><tr><td>同心圆针式肌电图电极</td><td>Chalgren Enterprises, Inc.</td><td>231-025-24TP；25 mm × 0.3 mm/30 G</td><td>加利福尼亚州吉尔罗伊</td></tr><tr><td>棉签（锥形头）</td><td>Puritan Medical Products</td><td>货号 25-826 5W</td><td>缅因州吉尔福德</td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>ADInstruments</td><td>PowerLab 8/30</td><td>科罗拉多州科罗拉多斯普林斯</td></tr><tr><td>内窥镜平台用直流温控系统</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-90-8D</td><td>缅因州鲍登</td></tr><tr><td>电生理记录软件</td><td>ADInstruments</td><td>LabChart 8（含视频采集模块）</td><td>科罗拉多州科罗拉多斯普林斯</td></tr><tr><td>内窥镜监视器</td><td>Karl Storz Endoscopy-America</td><td>Storz Tele Pack X 监视器</td><td>加利福尼亚州埃尔塞贡多</td></tr><tr><td>格隆溴铵</td><td>Piramal Critical Care</td><td>药品编号 NDC 66794-204-02；0.2 mg/mL</td><td>宾夕法尼亚州伯利恒</td></tr><tr><td>接地电极&amp;nbsp;</td><td>Consolidated Neuro Supply, Inc.</td><td>27 号不锈钢，货号 S43-438</td><td>俄亥俄州洛夫兰</td></tr><tr><td>异氟烷诱导室&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>气体麻醉箱 - 红色</td><td>马萨诸塞州布雷茵特里</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Covetrus North America</td><td>药品编号 NDC 11695-0703-1，100 mg/mL</td><td>俄亥俄州都柏林</td></tr><tr><td>用于分离会厌与软腭的金属刮匙</td><td>Fine Science Tools</td><td>货号 10091-12；&amp;nbsp;</td><td>加利福尼亚州福斯特城</td></tr><tr><td>用于清除口腔内食物或分泌物的微型刷</td><td>Safeco Dental Supply</td><td>货号 285-0023，1.5 mm</td><td>伊利诺伊州巴达哥尼亚格罗夫</td></tr><tr><td>适用于小鼠的内窥镜平台加热垫</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-90-2-07 &amp;ndash; 5 × 12.5 cm 加热垫</td><td>缅因州鲍登</td></tr><tr><td>眼科软膏（无菌）</td><td>Allergan, Inc.</td><td>Refresh Lacri-lube</td><td>加利福尼亚州尔湾</td></tr><tr><td>耳镜</td><td>Karl Storz</td><td>货号 1232AA</td><td>加利福尼亚州埃尔塞贡多</td></tr><tr><td>呼吸图传感器</td><td>BIOPAC Systems, Inc.</td><td>RX110</td><td>加利福尼亚州戈莱塔</td></tr><tr><td>脉搏血氧仪 - Vetcorder Pro 兽用监护仪</td><td>Sentier HC, LLC</td><td>部件号 710-1750</td><td>威斯康星州沃基夏</td></tr><tr><td>适用于大鼠的内窥镜平台加热垫</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-90-2 &amp;ndash; 12.5×25 cm 加热垫</td><td>缅因州鲍登</td></tr><tr><td>用于药物注射的无菌针头</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>货号 305110，26 G × 3/8 英寸，PrecisionGlide</td><td>新泽西州富兰克林湖</td></tr><tr><td>用于药物注射的无菌注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>货号 309628；1 mL，鲁尔锁扣式接头</td><td>新泽西州富兰克林湖</td></tr><tr><td>用于覆盖诱导笼以创造暗环境的手术单</td><td>Covidien LP</td><td>Argyle 手术单材料，单层</td><td>明尼苏达州明尼阿波利斯</td></tr><tr><td>用于固定呼吸图传感器至腹部的手术胶带</td><td>3M Health Care</td><td>货号 #1527-0，1/2 英寸</td><td>明尼苏达州圣保罗</td></tr><tr><td>用于体温调节的透明保温膜</td><td>The Glad Products Company&amp;nbsp;</td><td>Press&amp;rsquo;n Seal 保鲜膜</td><td>加利福尼亚州奥克兰</td></tr><tr><td>视频编辑软件</td><td>Pinnacle Systems, Inc.</td><td>Pinnacle Studio，v24</td><td>加利福尼亚州山景城</td></tr><tr><td>循环水加热垫 - 用于麻醉诱导/恢复工作站</td><td>Adroit Medical Systems</td><td>HTP-1500 热疗泵</td><td>田纳西州劳登</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Vet One</td><td>药品编号 NDC 13985-701-10；Anased，100 mg/mL</td><td>爱达荷州博伊西</td></tr></tbody></table>

用于呼吸和吞咽过程中喉部运动近距离成像的小鼠微创喉镜检查

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

喉是哺乳动物体内一个至关重要的器官，具有三大主要功能——呼吸、吞咽和发声。已知多种疾病可损害喉部功能，导致相关活动困难&#160;呼吸困难（dyspnea）、吞咽障碍（dysphagia）和/或发声障碍（dysphonia）。其中，吞咽障碍可导致吸入性肺炎及相关发病率、反复住院和早期死亡。尽管存在这些严重后果，目前针对喉部功能障碍的治疗主要依赖外科和行为干预手段，而这些方法通常难以恢复正常的喉部功能，因此迫切需要创新性解决方案。
为了弥补这一空白，我们一直在开发一种实验性内窥镜方法，用于研究小鼠（即小鼠和大鼠）模型中的喉功能障碍。然而，由于啮齿类动物体型较小，相对于现有内窥镜技术而言存在局限，上呼吸道解剖结构存在差异，且需要麻醉以充分暴露喉部，因此在啮齿类动物中实施内窥镜检查具有较大挑战性。本文介绍了一种新型经口喉镜检查方法，可在小鼠和大鼠中实现近距离、无遮挡的喉部运动视频成像。该方案的关键步骤包括精确的麻醉管理（以防止麻醉过量导致吞咽消失和/或引发呼吸窘迫相关死亡风险）以及使用显微操作器控制内窥镜（使单名研究人员即可稳定记录喉部运动视频，用于后续定量分析）。
重要的是，该方案可在同一动物上随时间重复进行，以专门研究各种病理状态对喉部功能的特定影响。本方案的一个新颖优势在于能够可视化吞咽过程中气道的保护情况，而在人类中由于会厌倒转覆盖喉入口，导致声门被遮挡而无法观察，因此无法实现。因此，啮齿类动物为专门研究正常与病理状态下喉部气道保护机制提供了独特的机会，最终目标是发现能有效恢复喉部正常功能的治疗方法。

成功应用本小鼠喉镜检查方案可在健康和疾病状态下，对自主呼吸及诱发吞咽过程中的喉部进行近距离可视化观察，如图6所示。此外，该方案可在同一批啮齿类动物中多次重复使用，从而实现对喉部功能/功能障碍随时间变化的动态研究。如图7所示，我们在一个喉返神经（RLN）损伤的大鼠手术模型中，于4个月内成功重复实施该喉镜检查方案达6次，以研究其自发恢复模式（相关数据尚未发表）。在之前的研究中曾尝试使用异氟烷（ISO）麻醉替代酮胺合剂（KX），结果导致在接受右侧喉上神经直接电刺激以诱发吞咽的啮齿类动物中，吞咽动作几乎完全被抑制（图8）31,32。即使ISO浓度低至2%时仍出现该现象；进一步降低ISO浓度则会引起动物自发运动，因此未予采用。ISO的这一混杂效应凸显了在本方案中选择合适麻醉方式的重要性。
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本方案描述了一种用于小鼠和大鼠的经口序贯喉镜检查方法，通过优化的麻醉方案以及精细调节的内镜操作技术，可在动物呼吸和吞咽过程中实现对喉部的近距离、无遮挡视频成像。

喉是哺乳动物体内一个至关重要的器官，具有三大主要功能——呼吸、吞咽和发声。已知有多种疾病可影响……

我的研究探讨跨物种（包括人类、犬、马和啮齿类动物）神经系统疾病中的吞咽异常。我们重点关注喉部功能障碍，这种功能障碍可能导致吸入性肺炎和呼吸衰竭。然而，目前尚未建立有效的预防和治疗方法。本方案旨在解决的研究空白是在正常与受损喉部气道保护功能的转化型啮齿类动物模型中，对吞咽过程中喉部功能进行客观测量。该方案具有纵向、高细节地对同一只啮齿类动物在疾病进展过程中（无论是否接受治疗）的喉部功能和气道保护能力进行重复评估的优势，从而加深我们对多种神经系统疾病病理生理机制及治疗作用机制的理解。首先，向已麻醉的啮齿类动物注射格隆溴铵。将其放入预热的感应笼中，在保温站上用手术单覆盖笼子10分钟，以尽量减少视觉刺激。剃除麻醉后啮齿类动物的颏下区域和髋部区域的毛发。将其转移至定制的内窥镜平台。然后，将啮齿类动物仰卧固定在加热平台上，并用耳杆稳定其头部。使用手术胶带将呼吸传感器固定在动物腹部，紧邻剑突下方。用透明薄膜覆盖动物躯干，以观察呼吸过程中的腹部运动，并辅助体温调节。保持后肢和下腹部暴露。用酒精棉片对剃毛区域进行消毒。然后，使用22号针头在颏下皮肤处刺出一个小开口。通过颏下皮肤中线处将无菌的同心针电极插入舌根。在髋部皮下放置接地电极。随后，调整呼吸传感器的位置以及DMG针电极的插入深度，以获得两个通道清晰的电生理信号。将内窥镜连接至显微操作器。将一根锥形棉签置于门齿后方，与下颌垂直，以打开啮齿类动物的口腔。旋转棉签，在舌头的背侧表面轻轻推动，使舌头略微伸出。用轻柔的手法捏住舌头，将其轻轻拉出，偏向门齿一侧。将内窥镜从与舌头牵拉同侧的门齿旁插入。然后打开光源，以避免对啮齿类动物造成伤害。使用微型拭子清除可见的食物残渣和多余唾液，以降低误吸风险。持续调整内窥镜位置，直至屏幕中央对准下咽部，并能辨认关键解剖结构。每5分钟定期检查啮齿动物舌头是否有缺血迹象，例如颜色变暗或色素沉着。现在，将显微探针沿内窥镜插入，并用其轻轻按压软腭，以便从远处观察喉部。缓慢推进内窥镜，使其位于软腭与会厌之间，同时保持喉部位于视野中央。通过微调内窥镜尖端的位置，避免损伤黏膜和造成气道阻塞。观察诱发性吞咽动作，其特征为与可见的下颌下降及喉部呼吸同步的突然声门闭合事件。通过对喉黏膜施加压力诱发5至10次吞咽，以观察舌肌电图的爆发性活动以及呼吸轨迹中可见的短暂呼吸暂停。小心地将内窥镜回撤至口咽部而不完全取出，并将下咽部置于视野中央，以清晰观察会厌和腭垂。为了恢复鼻腔呼吸，使用微型拭子轻轻按压舌根部以触发吞咽动作，使腭帆与会厌重新耦合，并将会厌固定于腭膜下方。随后，用浸有生理盐水的棉签湿润舌头及门齿，并将舌头复位至口腔内的正常位置。给予啮齿类动物阿替美唑，并对其背部和腹部进行手动刺激，以加快恢复。 然后，将动物置于预热的复苏笼中，并放置在加热台上以从麻醉中恢复。当啮齿类动物在复苏笼中能够自主活动后，将其放回已预热

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科研

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神经科学

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了解微创小鼠喉镜检查技术，用于在呼吸和吞咽过程中对喉部运动进行纵向高清成像。该方法结合优化麻醉方案与精细内窥镜操作，为研究神经疾病中的喉功能障碍提供客观评估工具。

用于呼吸和吞咽过程中喉部运动近距离成像的小鼠微创喉镜检查

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