Name: 将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 学习构建可重构开放式培养平台，实现静态屏障组织模型向动态微生理系统的转化。该平台支持流体增强培养与实时成像，兼容常规生物科学实验流程，适用于生物科学与工程实验室。

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本研究部分由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R43GM137651、R61HL154249、R16GM146687，以及美国国家科学基金会资助 CBET 2150798。作者感谢罗切斯特理工学院机械车间在铝制模具制造方面的支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

根据实验需求和最终用户的偏好，该设计可采用多种模式使用。每次实验前，请参考图2所示的决策流程图，以确定本方案所需的步骤和模块。例如，若用户希望在整个实验过程中保持敞口培养小室的格式，以便直接与Transwell型系统进行比较，则细胞接种时无需使用图案化掩膜。核心模块为市售产品（见材料表），超薄纳米膜可根据实验需求，从具有不同孔隙率和孔径的材料库中选择。 
1. 制备图案化掩模
注意：图案化掩膜用于将细胞精确定位于膜芯片的多孔区域，防止细胞沉降到周围的硅层上，以免在添加流体模块后细胞可能受到损伤16（参见图3）。单层细胞的损伤可能对屏障完整性产生不利影响，并损害实验结果。在开放式的静态培养中无需使用该掩膜，因为不存在细胞损伤的风险。
<ol>
	<li>使用补充代码文件1中提供的设计购买、机械加工或3D打印模具（图4A）。 
	注意：与高纵横比的直壁结构相比，模板壁采用锥形设计，可增加培养基容量并最大限度减少气泡滞留。</li>
	<li>使用冷压滚轮将130 µm厚的压敏胶（PSA）膜粘附到3.2 mm厚的亚克力板上（参见材料表）。</li>
	<li>根据补充代码文件2中提供的设计，使用激光切割亚克力板，形成一系列腔体（图4B）。</li>
	<li>剥离PSA膜上的保护层，并将亚克力板粘附至模具上。 
	注意：确保激光切割的亚克力板与模具对齐，使模具特征位于腔体中心（图4C）。此步骤的准确性直接影响膜上细胞定位的精度。</li>
	<li>充分混合PDMS预聚物（基础剂与催化剂比例为10:1）（参见材料表），并在真空腔中脱气，直至无可见气泡（5–15分钟）。</li>
	<li>将PDMS缓慢倒入模具腔体中，并用平整边缘刮平。 
	注意：为防止气泡滞留，应缓慢向每个腔体中倾倒PDMS。若倾倒后仍有气泡，可将模具放入真空腔中再次脱气。</li>
	<li>将PDMS在70 °C的加热板上固化1小时，随后冷却至室温。</li>
	<li>使用平头镊子从模具腔体中取出模板。</li>
</ol>
2. 流动模块的制备
注意：流体模块与核心模块的三叶草形孔具有相似的轮廓，并包含一个模制的微通道（宽度 = 1.5 mm，高度 = 0.2 mm，长度 = 5 mm）。三叶草形状有助于将通道对准多孔培养区域（图5）。
<ol>
	<li>采用标准的软光刻技术18，利用补充编码文件3中提供的设计制备具有特定结构的硅模具（图4D）。</li>
	<li>将一片130 µm厚的压敏胶膜（PSA膜）粘附至一块3.2 mm厚的丙烯酸板上。</li>
	<li>根据补充编码文件4中的设计对丙烯酸板进行激光切割，形成一系列三叶草形腔体（图4E）。 
	注意：腔体的高度决定了流体模块的高度，必须略高于核心模块孔的高度（高出0–0.1 mm），以确保密封性良好。</li>
	<li>去除压敏胶膜上的保护层，然后将激光切割后的丙烯酸板与硅模具对齐贴合，使硅模具上的三角形对准标记与丙烯酸板上的对应标记对齐。 
	注意：与步骤1.4类似，需确保激光切割的丙烯酸板与硅模具对齐，使模具结构位于每个腔体的中心位置（图4F）。此步骤决定了微通道相对于基底位置的准确性。</li>
	<li>将脱气后的PDMS缓慢倒入模具腔体中，并用平整边缘刮平表面。 
	注意：若浇注后存在气泡，需再次对模具进行脱气处理，直至气泡完全消除。</li>
	<li>将模具置于加热板上，在70 °C条件下烘烤PDMS 1小时，随后让模具自然冷却至室温。</li>
	<li>使用平头镊子小心地将流体模块从模具腔体中取出。</li>
	<li>将流体模块的微通道结构面朝上放置，并使用活检打孔器（见材料表）在通道末端位置打孔，形成核心模块的进样口和出样口。</li>
</ol>
3. 下层和上层丙烯酸外壳的制备
注意：核心模块可嵌入下部外壳中。外壳内嵌磁铁之间的相互吸引作用使流路模块与核心模块压紧并密封（图6）。
<ol>
	<li>使用补充代码文件5中提供的设计，激光切割一张2 mm厚的亚克力板，以制成带有磁铁插入孔的上部外壳。</li>
	<li>将一层130 µm厚的压敏胶膜（PSA）粘附到一块3.5 mm厚的亚克力板上。</li>
	<li>根据补充代码文件6中提供的设计，激光切割该亚克力板，以制成带有磁铁插入孔的下部外壳。 
	注意：下部外壳的厚度是一个关键参数，必须与核心模块的总厚度相匹配，以防止流体泄漏。</li>
	<li>移除PSA保护层，并将下部外壳粘接到玻璃盖玻片上。</li>
	<li>将4.75 mm镀镍钕铁硼磁铁（见材料表）压入外壳的激光切割孔中。 
	注意：确保下部和上部外壳中的磁铁以相反极性放置，以实现磁性吸引（图6）。</li>
</ol>
4. 流路系统的制备
注意：闭环流动回路包含两个作为储液池的样品收集管（图7）。入口储液池中装有聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜，以允许培养基与培养箱中的 CO2 浓度达到平衡。
<ol>
	<li>使用1 mm活检打孔器在样本收集管的管盖上打出两个孔。</li>
	<li>使用活检打孔器在另一个样本收集管的管盖上打出两个孔（分别为1 mm和4 mm），并在该管体下部打一个1 mm的孔。</li>
	<li>将20 G分配尖端插入每个1 mm孔中，并用热熔胶密封。</li>
	<li>将0.22 µm PVDF滤膜（见材料表）放入4 mm孔中，并用热熔胶密封。</li>
	<li>使用补充代码文件7中提供的设计对1.5 mm丙烯酸板进行激光切割，以制作样本固定平台。</li>
	<li>将储液装置放置在丙烯酸平台上。</li>
	<li>使用微流管连接分配尖端（见材料表）。</li>
	<li>使用21 G分配尖端将微流管连接至流体模块的入口和出口。</li>
	<li>使用蠕动泵（见材料表）进行流体循环。 
	&#8203;注意：也可根据需要选用注射泵或气动泵来驱动流体。流速应根据实验需求确定。本研究提供了一个基于经实验验证的COMSOL模型的综合表格（见补充表1），以帮助用户选择合适的流速，从而在细胞单层上实现目标剪切应力16。</li>
</ol>
5. 细胞接种
注意：与传统的膜插件类似，不同类型的细胞均可在纳米膜上进行培养。此外，可在底部通道的膜另一侧共培养第二种细胞类型15。
<ol>
	<li>在室温下用 5 µg/cm2 的纤连蛋白（见材料表）包被膜 1 小时，以改善细胞贴附。 
	注意：所选的细胞类型可能影响所需的包被条件和细胞密度。此处描述的步骤适用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs，见材料表）。</li>
	<li>使用 P200 移液器吸除包被液，并将图案化模板放入核心模块的孔中。</li>
	<li>向装置的孔和底部通道中加入细胞培养基。</li>
	<li>以 40,000 个细胞/cm2 的密度将 HUVECs 接种至孔中。 
	注意：在此密度下，HUVECs 通常在培养 24 小时后形成融合的单层细胞16,19。</li>
	<li>将装置放入培养皿中，并在培养皿内放置一个装有去离子水的 15 mL 离心管盖，以维持局部湿度。</li>
	<li>将培养皿转移至培养箱中。 
	&#8203;注意：应每隔 24 小时更换一次装置顶部孔和底部通道中的细胞培养基。更换底部通道的培养基时，可将新鲜培养基轻轻注入其中一个端口，使旧培养基从另一端口排出。</li>
</ol>
6. 重新配置为微流控模式
<ol>
	<li>在组装前，将上壳体、下壳体、流体模块、储液池、管路和分配尖端放入紫外灭菌箱中灭菌30分钟。在流路中依次循环70%乙醇和无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>用内皮细胞生长培养基填充储液池和管路（参见材料表）。</li>
	<li>将下壳体放置在样品台上。将开放式核心模块插入下壳体中。</li>
	<li>吸出模块孔中的细胞培养基。将流体模块放入孔中。</li>
	<li>放置上壳体，以密封核心模块孔中的流体模块。将进样和出样分配尖端连接至流体模块的端口。</li>
	<li>启动蠕动泵，向系统引入流体流动。</li>
</ol>
7. 引入流体后在敞口孔板中进行下游分析
注意：此处的培养时间取决于实验目的。用户可根据自身需求，选择在敞口培养板或微流控装置中进行后续分析（例如免疫细胞化学、RNA提取）。例如，若倾向于使用敞口培养板格式，应重新配置系统，并依据标准方案进行检测16,19。
<ol>
	<li>当达到所需的剪切流暴露时间后，停止泵的运行。取下进样口和出样口的分配尖端。</li>
	<li>取下上部壳体。使用镊子小心地从孔中取出流体模块。</li>
	<li>向孔中加入 100 µL 细胞培养基。根据标准操作流程进行所需的检测。</li>
</ol>

A Reconfigurable Barrier Tissue Platform with Open-Well and Microfluidic Modes

<ol><li>Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+the+Endothelial+Barrier%3A+Identifying+and+Reconciling+Controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).</li>
<li>Vera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue+barrier+models+on+hydrogel+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).</li>
<li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).</li>
<li>Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+barrier+tissues+in+vitro%3A+methods%2C+achievements%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges.</a> eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).</li>
<li>Kaisar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+experimental+models+of+the+blood-brain+barrier+for+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).</li>
<li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+microphysiological+system+%28PREDICT-96%29+to+recapitulate+hepatocyte+function+in+dynamic%2C+re-circulating+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).</li>
<li>Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microfluidic+systems+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A role for microfluidic systems in precision medicine.</a> Nature Communications. 13 (1), 3086(2022).</li>
<li>Katt, M. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+building+in+physiological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organs-on-chips+for+disease+modelling%2C+drug+development+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).</li>
<li>Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+reframing+biological+enquiry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: reframing biological enquiry.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).</li>
<li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+rapidly+integrated+debubbler+%28rid%29+module+for+microfluidic+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications.</a> Micromachines. 10 (6), 360(2019).</li>
<li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fiber+anisotropy+within+natural+collagen+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).</li>
<li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+3D+collagen+gels+with+independently+tunable+fiber+anisotropy+and+directionality%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Technologies%22%5BJournal%5D)">Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).</li>
<li>Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+to+study+the+functions+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier.</a> Bioengineering. 10 (5), 519(2023).</li>
<li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Modular+%C2%B5SiM%3A+A+mass+produced%2C+rapidly+assembled%2C+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804(2022).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+%C2%B5sim+reconfigured%3A+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802(2022).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+using+an+ultrathin+silicon+nitride+membrane-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624(2023).</li>
<li>Joshi, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineering+3D+Collagen+Matrices+with+Tumor-Mimetic+Gradients+in+Fiber+Alignment%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Hsu, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniaturized+3D+printed+pressure+regulator+%28%C2%B5PR%29+for+microfluidic+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10769(2022).</li>
<li>Rogers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+bilayer+co-culture+platform+to+study+endothelial-pericyte+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions.</a> Scientific reports. 11 (1), 12225(2021).</li>
<li>Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passing+the+vascular+barrier%3A+endothelial+signaling+processes+controlling+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).</li>
<li>Wang, Y. I., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniChip+enables+long-term+recirculating+unidirectional+perfusion+with+gravity-driven+flow+for+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).</li>
<li>Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BGo+with+the+flow%26%2334%3B%3A+how+Kr%C3%BCppel-like+factor+2+regulates+the+vasoprotective+effects+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">34;Go with the flow&#34;: how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).</li>
<li>Satoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+pressure-driven+multi-throughput+microfluidic+circulation+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system.</a> Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).</li>
<li>Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reversibly+sealed%2C+easy+access%2C+modular+%28seam%29+microfluidic+architecture+to+establish+in+vitro+tissue+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces.</a> PLOS ONE. 11 (5), e0156341(2016).</li>
<li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+extensional+flows+promote+long-range+fiber+alignment+in+3D+collagen+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels.</a> Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).</li>
<li>Hasan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+fabrication+of+flexible+nanotextured+PDMS+as+a+substrate+for+selective+cell+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Physics+%26+Engineering+Express%22%5BJournal%5D)">One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture.</a> Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).</li>
<li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineering+3D+collagen+hydrogels+with+long-range+fiber+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment.</a> Journal of Visualized Experiments. 187, e64457(2022).</li>
</ol>

J.L.M. 是 SiMPore 公司的联合创始人，并持有该公司股权。SiMPore 正在将基于超薄硅的技术商业化，包括本研究中使用的膜。

本实验方案旨在建立一种实用方法，将流体功能整合到带有超薄纳米膜的开放式培养小室平台中。该设计采用磁性锁合方式，可在实验过程中在开放式小室模式与流体模式之间切换，从而结合两种模式的优势。与传统的永久键合平台不同，磁性锁合允许在实验流程中的适当时机拆卸平台16,25,26,27。在此平台上，细胞首先在熟悉的开放式小室格式中接种并形成屏障，随后通过添加流动模块并利用磁力密封，即可将系统重新配置为流体模式。这种重构带来两个关键优势：第一，可通过流体诱导的剪切应力模拟生理条件；第二，可在流动条件下引入免疫细胞等次级组分16。磁性锁合特性提供了无需工具的组装方式，实现开放式小室与微流控格式之间的按需切换。因此，后续分析（如免疫细胞化学染色和RNA提取）可根据需要，采用标准技术在熟悉的开放式小室格式中进行，或使用微流控技术完成16。
磁密封是平台可重构设计中的一个关键参数，因此需考虑以下几点以确保其准确功能：（1）下部外壳的高度必须与核心模块的高度相匹配（公差：±0.1 mm），以正确封闭模块。（2）流体模块的高度应略高于核心模块的孔深（0–0.1 mm）。（3）该设计适用于多种材料，不要求流体模块必须由弹性体材料制成；关键是在流体模块与膜芯片的接口处嵌入一种柔软、类似垫圈的材料，以形成可靠的密封。（4）用于压装磁铁的外壳中激光切割空腔的直径必须根据所用仪器进行优化28。若空腔直径过大，磁铁可能脱落并导致液体泄漏；若空腔过小，则在插入磁铁时外壳可能开裂。遵循上述设计原则，本文介绍的磁性组装方法可应用于将其他开放式孔板系统重构为微流控模式。
为了实现可重构功能，必须使用一种能够将细胞精确定位到膜表面的图案化掩膜。该掩膜可确保细胞不会位于多孔培养区域之外（即不会位于硅支撑区域），因为后者在插入流体模块时可能受损。这一因素在共培养模型中尤为重要，因为意外接种到非目标位置的细胞无法主动参与跨膜屏障组织的形成。然而，这些错位的细胞通常会在裂解过程中被回收，可能对研究跨膜细胞间相互作用的基因表达分析引入偏差20。利用该掩膜进行开放式微室细胞接种，可通过减少传统微流控平台中固有的沿流动路径的细胞损失，提高接种效率4,16。该平台还能够整合多种细胞类型和细胞外基质（ECM）材料15,16,17。例如，可将负载细胞的水凝胶注入装置的下层通道以模拟组织腔室，同时在膜的上方构建内皮层。
尽管磁性模块和组件可以重复使用，但由于磁体在壳体中松动会降低密封力，因此在多次使用后保持有效密封可能存在问题。通过为每次实验制作新的层压模块，或在设计确定后采用注塑成型或3D打印技术大规模生产组件，可缓解这一问题。在本方案所述的方法中，流体模块需手动放置到核心模块中，系统的多路复用和自动化能力受到限制。为了提高实验通量，可将流体模块与上部壳体集成于一体化功能模块中，该模块包含内部流道和标准化的管路连接，能够同时并行灌注多个模块。
开放井核心模块的组件可大规模生产并可商业采购。系统的其他组件，如流体模块、外壳和图案化掩膜，也可进行大规模制造。此外，该平台具有可重构性，可添加传感器和执行器（例如跨内皮电阻检测模块、电穿孔模块），以实现实时刺激和测量。总体而言，该平台结合了传统方法与微流控技术，有助于在工程实验室以外的领域广泛使用。

血管屏障作为关键的界面，将血液区室与周围组织分隔开来。它们在维持稳态方面发挥着重要作用，包括招募免疫细胞、调控分子通透性，以及防止病原体侵入组织1,2。体外培养模型已被开发用于模拟体内微环境，从而系统性地研究影响健康与疾病状态下屏障特性的各种因素和条件3,4。
此类培养模型最常用的方法是类似Transwell的方法 &#34;敞口孔&#34; 构型5，其中多孔的核孔膜将充满培养基的隔室分隔开来（图1A）。在此类模型中，细胞可接种于膜的任意一侧，并已开发出多种实验方案。然而，这些系统在提供支持屏障成熟及模拟免疫细胞循环所必需的流体流动方面存在局限性 体内5,6因此，它们无法用于需要引入药物剂量、机械刺激或流体诱导剪切应力等动态流动条件的研究。6,7,8.
为了克服开放式培养皿系统的局限性，已开发出将多孔培养膜与可独立寻址的流体通道相结合的微流控平台9。这些平台能够精确控制流体路径、灌注过程、化学物质的引入、可控的剪切力刺激以及动态添加细胞的能力7,10,11,12,13。尽管微流控平台具备先进的功能，但由于其复杂的微流控操作流程以及与现有实验工作流程不兼容，尚未在生物科学实验室中得到广泛应用4,10,14。
为了弥合这些技术之间的差距，我们提出了一种采用可磁控重构的模块化系统的实验方案。该系统可根据实验的具体需求，在开放式培养皿模式与微流控模式之间轻松切换。该平台包含一种称为 m-µSiM（由硅膜驱动的模块化微生理系统）的开放式培养装置，其具有厚度为 100 nm 的细胞培养膜（纳米膜）。如图 1B所示，该纳米膜具有高孔隙率（15%）和类似玻璃的透明性。它在物理上将上层腔室与底部通道分隔开，允许分子在生理尺度长度范围内进行跨膜传输15。与传统的径迹蚀刻膜不同，后者在明场成像活细胞时存在已知的成像挑战，而该纳米膜优异的光学和物理特性使得能够清晰地观察膜两侧表面的细胞15,16,17。
本方案详细介绍了专用接种和流体模块的制备方法，并阐述了该平台的磁性重构过程。展示了如何利用该平台在静态和动态条件下建立内皮屏障。实验结果表明，在剪切力刺激下，内皮细胞沿流动方向排列，并且剪切力敏感基因的表达水平上调。

<table><tbody><tr><td>0.5 x 0.86 微流管</td><td>Langer Instruments</td><td>WX10-14 &amp;amp; DG 系列</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 一次性活检打孔器，Integra Miltex</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS，pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>20 号规格 IT 系列分配尖端</td><td>Jensen Global</td><td>JG20-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>21 号规格 NT 高级系列斜角分配尖端</td><td>Jensen Global</td><td>JG21-1.0HPX-90</td><td></td></tr><tr><td>3M 467 MP 压敏胶（PSA）</td><td>DigiKey</td><td>3M9726-ND</td><td></td></tr><tr><td>3M 468 MP 压敏胶（PSA）</td><td>DigiKey</td><td>3M9720-ND</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 标记鬼笔环肽</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12379&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分，98%，试剂级，Alfa Aesar，规格 = 10 g</td><td>VWR</td><td>AAJ64100-09</td><td></td></tr><tr><td>透明抗刮擦和抗紫外线浇铸丙烯酸板</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K171</td><td>12&quot; x 12&quot; x 1/16&quot;</td></tr><tr><td>透明抗刮擦和抗紫外线浇铸丙烯酸板</td><td>McMaster-Carr</td><td>8589K31</td><td>12&quot; x 12&quot; x 3/32&quot;</td></tr><tr><td>透明抗刮擦和抗紫外线浇铸丙烯酸板</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K191</td><td>12&quot; x 12&quot; x 7.64&quot;</td></tr><tr><td>Corning 人纤维连接蛋白，1 mg</td><td>Corning</td><td>47743-728</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，Globe Scientific，长 x 宽 = 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>10118-677</td><td></td></tr><tr><td>DOW SYLGARD 184 硅胶封装剂，透明，0.5 kg 套件</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>夹具 A1&amp;amp;A2</td><td>SiMPore Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>夹具 B1&amp;amp;B2</td><td>SiMPore Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>含 RNase 抑制剂的高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C0035C</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞成像试剂盒（488/570）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Probes Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>镀镍磁铁（直径 4.75 mm，拉力 0.34 kg）</td><td>K&amp;amp;J Magnetics</td><td>D31</td><td>3/16&quot; 直径&amp;nbsp;x 1/16&quot; 厚度</td></tr><tr><td>多聚甲醛，4% w/v 水溶液，无甲醇，Alfa Aesar</td><td>Fisher Scientific</td><td>aa47392-9M</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Langer Instruments</td><td>BQ50-1J-A</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶 SU-8 显影液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9901158</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 注射器滤器</td><td>PerkinElmer</td><td>2542913</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>University wafer, USA</td><td>1196</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0702369</td><td></td></tr><tr><td>目的基因：eNOS（Hs01574659_m1）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>目的基因：GAPDH（Hs02786624_g1）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>目的基因：KLF2（Hs00360439_g1）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Pierce 20x PBS Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>运输管样品白色盖，5 mL，无菌</td><td>VWR</td><td>100500-422</td><td></td></tr><tr><td>TRI 试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>超薄纳米多孔膜芯片</td><td>SiMPore Inc.</td><td>NPSN100-1L</td><td>设计与所有 SiMPore 膜兼容&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>uSiM 组分 1</td><td>SiMPore Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>uSiM 组分 2</td><td>SiMPore Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

微生理系统是一种微型化的细胞培养平台，用于在实验室环境中模拟人体组织的结构与功能。然而，尽管缺乏流体流动能力，基于开放孔板和膜的实验方法仍是模拟组织屏障的金标准，而微生理系统在生物科学实验室中的广泛应用仍受到限制。这一问题主要归因于现有的微生理系统与为开放孔板系统开发的标准实验方案和工具之间存在不兼容性。
本文介绍了一种可重构的基于膜的开放式微孔平台的构建方案，该平台具有开放微孔结构、增强流体流动能力，并与常规实验方案兼容。该系统采用磁性组装方法，可实现开放微孔模式与微流控模式之间的可逆切换。通过该方法，用户可灵活地在开放微孔模式下使用标准操作流程启动实验，并根据需要随时添加或移除流体流动功能。为展示该系统的实际应用及其与常规技术的兼容性，实验首先在开放微孔模式下建立了内皮细胞单层。随后将系统重构以引入流体流动，再切换回开放微孔模式进行免疫染色和RNA提取。由于该可重构设计既兼容传统的开放微孔实验流程，又具备流体增强功能，预期将在工程学与生物科学实验室中得到广泛应用。

开放井核心模块最初被放置在一个由下部外壳和盖玻片形成的特定腔室内，如图6A所示。随后，包含微通道和接入端口的流体模块被插入核心模块的井中。由于嵌入在下部和上部外壳中的磁体之间的磁吸引力，流体模块被牢固地密封在膜的硅支撑层上，如图6B所示。为了评估该磁性锁紧机制的有效性，进行了爆破压力测试，结果表明系统可承受高达38.8 ± 2.4 kPa的封闭压力。该耐压能力显著超过了细胞培养应用中通常遇到的操作压力。此外，当流速高达4000 µL/min时，系统仍无泄漏，这相当于培养区域产生74 dynes/cm2的剪切应力16。
在开发一种可在开放孔板模式与微流控模式之间切换的平台时，必须仔细考虑细胞接种方法，而这一点在传统的静态开放孔板平台中通常无需关注16。通道边界周围单层细胞的损伤可能会影响实验结果的准确性20。为解决这一问题，设计了一种可移除的掩膜模板，该模板可嵌入核心模块的开放孔内，为细胞提供特定的窗口，使其优先在膜表面沉降并形成单层（图3）。当细胞单层完成图案化并达到完全融合后，用户可灵活选择继续以开放孔板形式进行实验，或重新配置平台进入微流控模式，使细胞单层暴露于生理性的剪切应力下（图3）。磁性锁扣机制使得用户能够根据需要轻松地在开放孔板与微流控模式之间切换。例如，在完成流动刺激后，设备可恢复为开放孔板模式，使用户能够使用标准实验方案灵活地开展多种检测（如免疫染色、RNA提取和分子通透性测量）15,16。
在人体生理环境下，血管屏障会受到流体诱导的剪切应力作用，这种剪切应力是一种关键的生物物理信号，可影响屏障的结构与功能5,21,22。因此，在微生理系统中引入流体流动是一项关键要求。为了展示该平台的多功能性，采用标准操作流程在开放式微孔板格式中建立了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层。静态培养24小时后，将平台重新配置为微流控模式，使细胞单层暴露于10.7 dynes/cm2的剪切应力下持续24小时。结果显示，在流动条件下培养的细胞沿流动方向排列，而无流动条件下培养的细胞则保持随机取向（图8A、B）。剪切刺激后，平台再次被重新配置为开放式微孔板格式，以便采用标准操作流程提取RNA。结果表明，细胞在剪切应力作用下，Kruppel样因子2（KLF2）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达上调，这两种分子在健康血管中发挥抗血栓和抗动脉粥样硬化等重要功能23,24（图8C）。
<img alt="体外血管屏障模型；Transwell 与 μ-SIM 的对比，细胞培养装置的示意图与显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：比较 体外 血管屏障模型 （示意图）A）传统的Transwell样小室和（B开放井m-µSiM亮视野图像显示了汇合的HUVEC单层在径迹蚀刻膜与超薄纳米膜之间亮视野成像质量的差异。比例尺 = 100 µm改编自 Mansouri 等人。16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养流程图；微流控、开放式培养皿、接种、RNA提取选项。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：决策流程图。 基于实验需求和下游分析偏好的流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示微流控装置的细胞图案化示意图，突出开放孔模式和可逆重构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：平台的实验流程。（A）为将细胞直接定位在多孔膜上，将一个可移除的图案化掩模插入核心模块的孔中（插图显示了图案化的细胞，黄色线条表示微通道边界）。（B）在静态细胞培养过程中，该掩模可保留在装置中或移除。（C）为将平台重构为微流控模式，需用流动模块替换掩模。由于采用磁性密封机制，该配置可逆；可通过移除外壳和流动模块切换回开放孔模式。比例尺 = 200 µm。改编自 Mansouri 等人16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微加工工艺示意图；模板和流体模块模具，亚克力板组装。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：模具的示意图。（A）模板模具。（B）激光切割的亚克力板。（C）模板模具的组装视图。（D）流体模块模具。（E）激光切割的亚克力板。（F）流体模块模具的组装视图。三角形结构为对齐标记，用于辅助将亚克力板与模具进行准确贴合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流动模块示意图和三维模型；纳米膜微通道、流体端口；实验设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：三叶草形流动模块示意图。（A）流动模块与膜芯片之间的接触界面。流体流动的入口和出口端口以粉色显示。（B）PDMS流动模块的三维图像。改编自Mansouri等16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置重构的磁性组装示意图；横截面结构视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：用于装置重构的磁性组装。（A）将装置重构为微流控模式的组件示意图。具有相反磁极的嵌入式磁铁可产生吸引力以实现密封。（B）重构后装置的横截面视图，显示粉红色的血管通道和绿色的组织腔室。改编自 Mansouri 等人16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于流体流动实验分析的蠕动泵装置，配有PVDF滤膜和进出液储液槽。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：流动回路的组装示意图。 该回路由蠕动泵、两个用于供给细胞培养基并缓冲波动的储液槽、管路以及一个用于固定组件的丙烯酸支架组成。改编自 Mansouri 等人16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="内皮细胞流体动力学；微流控模式与开放式培养皿模式的比较；基因表达柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66090/66090fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：开放式培养皿与微流控模式下培养的HUVECs细胞的比较。 细胞在开放式培养皿中接种并培养24小时，以形成融合的单层细胞。在随后的24小时内，其中一组装置被重新配置为微流控模式。(A) 在流动条件下（10.7 dynes.cm-2剪切应力）培养的细胞沿流动方向排列（插图显示细胞的肌动蛋白和细胞核分别为绿色和蓝色）。(B) 在开放式培养皿中无流动条件下培养的细胞未显示定向排列。雷达图中条形的长度表示相应方向上的细胞数量。(C) 与无流动条件相比，在流动条件下培养的细胞中KLF2和eNOS基因的上调水平更高（**p &lt; 0.01，n = 3，均值 ± 标准差）。比例尺 = 100 µm。改编自Mansouri等16。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/66090fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：不同流速下纳米膜表面的剪切应力。 该表格提供了不同流速下纳米膜表面剪切应力值的相关信息。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件1：掩模模具的CAD模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S1-Stencil%20mold.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件2：用于模板模具的激光切割腔体的CAD模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S2-Laser%20cut%20cavities%20for%20stencil%20mold.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件3：流体模块的CAD模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S3-Flow%20module%20mold.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件4：流控模块模具激光切割腔体的CAD模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S4-Laser%20cut%20cavities%20for%20flow%20module%20mold.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件5：上壳体的CAD模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S5-Upper%20housing.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件6：下壳体的CAD模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S6-Lower%20housing.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充编码文件 7：亚克力载物台的 CAD 模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66090/S7-Acrylic%20stage.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种可重构的基于膜的细胞培养平台，该平台将开放式孔板格式与流体流动功能相结合。该平台与标准操作流程兼容，能够在开放式孔板和微流控培养模式之间进行可逆转换，满足工程学与生物科学实验室的不同需求。

微生理系统是一种微型化的细胞培养平台，用于在实验室环境中模拟人体组织的结构与功能。

我们正在开发可模拟人体屏障组织的模块化微生理系统。我们的系统具有独特性，因为它可以从静态开放式培养孔板重新配置为增强流动的系统。这种灵活性使得该平台能够同时应用于以生物科学和工程学为重点的实验室。我们提出了一种用于构建可重构开放式培养井平台的实验方案，该平台支持增强型流动培养及生活方式成像，且与常规生物科学实验流程兼容。我们的可重构设计允许用户在实验过程中自由切换开放式培养井模式与微流控模式，从而能够以自己熟悉的操作形式完成各个实验步骤。首先制备用于核心模块孔的图案化掩模。具体操作为，根据所需设计激光切割丙烯酸板，形成如屏幕所示的腔阵列。然后，移除固定在板上的压敏胶（PSA）薄膜的保护层。将亚克力板固定到模具上。接着，按照10:1的基础剂与固化剂比例，充分混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物。将混合物置于真空室中脱气，直至可见气泡完全去除。用平边工具一边刮平，一边缓慢将脱气后的PDMS倒入模具型腔中。将带有PDMS的模具置于加热板上，在70°C下固化1小时。随后冷却至室温。然后使用平头镊子从模具型腔中取出模板。为了制备流动模块，使用激光切割丙烯酸板，形成如屏幕上所示的三叶形型腔阵列。移除固定在激光切割板上的压敏胶膜（PSA膜）的保护层，并通过对齐三角形对准标记，将该板贴附到硅胶模具上。将脱气后的PDMS缓慢倒入模具型腔中，并用平整边缘刮平。将模具置于加热板上，在70摄氏度下烘烤PDMS一小时。待模具冷却至室温。使用平头镊子小心地从模具型腔中取出流体模块。将流体模块方向调整为微通道结构面向上方。借助活检打孔器，在通道末端创建核心入口和出口孔。使用激光切割机将一块2毫米厚的丙烯酸板切割成上部外壳，外壳上留有用于插入磁铁的孔。同样，将丙烯酸板激光切割成带有磁铁插入孔的下部外壳。去除板材上的PSA保护层后，将下部外壳粘附到玻璃盖玻片上。将直径为4.75毫米的镀镍钕磁铁压入外壳的激光切割孔中。开放式的井状核心模块嵌入由下部外壳和盖玻片形成的特定腔体内。随后，包含微通道和进出液口的流体模块被安装到核心模块的井孔中。通过下部和上部外壳中嵌入的磁铁，将流体模块牢固地密封在膜的硅支撑层上。可拆卸的模板设计为可嵌入核心模块的开放孔中，并为细胞提供特定窗口，使其优先沉降在膜表面。首先，在室温下用每平方厘米5微克的纤连蛋白溶液孵育组装好的可重构细胞培养平台的膜表面1小时，以促进细胞贴附。然后使用P200移液器吸取包被溶液。将图案化掩膜置于核心模块的孔中。向孔和装置的底部通道加入细胞培养基。将人脐静脉内皮细胞接种至孔板中。将装置放入培养皿内。在培养皿中加入含有去离子水的15毫升锥形管盖，以维持局部湿度。将培养皿装置转移至培养箱中。若需在流动条件下培养细胞，请将平台从开放培养孔重新配置为微流控模式。具体操作为：用内皮细胞生长培养基填充储液池和管路。将下部外壳放置在样品台上。将开放式微孔核心模块插入下部外壳中。然后移除模板，吸出模块微孔中的细胞培养基，并将流体模块放入微孔中。接下来，将上部外壳放置到位，以密封核心模块孔中的流体模块。将进样和出样分配尖端连接到流体模块的端口。启动蠕动泵，使流体进入系统。当达到所需的剪切流暴露时间后，停止泵。移除进样口和出样口的分配尖端，然后取下上部壳体。使用镊子小心地从孔中取出流室模块。最后，在进行所需的检测之前，向孔中加入 100 µL 细胞培养基。在流动条件下培养的细胞沿流动方向排列，而在无流动条件下培养的细胞则保持随机取向。细胞暴露于剪切应力可导致Kruppel样因子2和内皮型一氧化氮合酶的上调，二者在维持血管健康中发挥关键作用。

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Research

科研

JoVE Journal

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