识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

我们的研究旨在探索骨髓微环境的变化如何影响肿瘤生长。我们建立了一种流式细胞术检测方案，用于分析骨髓和骨组织中的非免疫细胞，重点关注海洋性血液系统恶性肿瘤。该方法可适用于多种镜像模型中骨髓的研究。

本研究聚焦于在癌症进展过程中分离并鉴定骨髓基质细胞群体的变化。了解这些变化对疾病发生和发展的影响，可能为靶向骨髓基质细胞中促进癌症的改变提供新的治疗策略。我们的实验方案独特地结合了机械消化与酶消化、磁珠耗竭法以及流式细胞术，以明确骨髓微环境的细胞组成。

该方法通过采用磁性分离技术，并整合来自骨组织和骨髓的细胞，从而更全面地呈现这一微环境。首先，从安乐死后的解剖小鼠骨骼中取出组织。将清洗后的骨骼放入置于冰上的新六孔板中，六孔板内含有FACS缓冲液。

将骨骼转移至研钵中，加入2到5毫升FACS缓冲液。以环形运动研磨骨骼，直至释放骨髓。用3毫升注射器反复抽吸并冲洗骨髓，以使其均质化。

将匀浆液吸入另一支注射器中，然后通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升离心管中。用FACS缓冲液将滤筛上的组织块冲洗回研钵中，再次进行匀浆。按之前方法对冲洗后的组织进行过滤。

接下来，用FACS缓冲液将残留的骨小梁冲洗回研钵中。然后将组织块转移至15毫升离心管中，以确保获得最大产量。为了消化骨髓，首先在4摄氏度下以300G离心5分钟。

将骨髓沉淀重悬于2 mL消化液中。将混合液转移至15 mL离心管，然后在37°C下于旋转仪上孵育45分钟。随后加入10 mL FACS缓冲液以终止酶消化反应。

将混合物通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升离心管中。在4摄氏度下以400G离心7分钟。用1毫升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。

接下来，加入 10 毫升 FACS 缓冲液以终止裂解。然后将混合物如前所述过滤至 50 毫升离心管中。最后，在 4 摄氏度条件下以 300 × g 离心 5 分钟。

弃去上清液后，将沉淀重悬于 100 微升 FACS 缓冲液中。消化骨针时，先将骨针涡旋混匀，然后倾去上清液，保留底部的骨组织。

接下来，将骨针重悬于1毫升骨针消化液中。将离心管置于旋转仪上，在37摄氏度下孵育60分钟。最后，加入10毫升FACS缓冲液终止消化反应。

将混合物过滤到含有已裂解红细胞并已消化的骨髓的50毫升离心管中。首先，将分离的小鼠骨髓悬液与骨小梁悬液混合。用移液器吸取10微升细胞悬液滴加到血细胞计数板上进行计数。

将细胞悬液在4°C条件下以300×g离心5分钟。然后将沉淀重悬于100 µL FACS缓冲液中。为通过抗体进行磁性去除染色，加入Fc阻断剂CD45 APC和TER-119 APC。

然后用FACS缓冲液洗涤细胞悬液。离心剩余混合物后，将沉淀重悬于100 µL的FACS缓冲液中。为使用磁性微珠进行耗竭染色，向细胞悬液中加入小鼠IgG和抗APC微珠。

将混合物置于冰上孵育20分钟。用2毫升MACS缓冲液洗涤LD柱。将细胞重悬于缓冲液中，然后通过带有35微米细胞筛网帽的5毫升试管进行过滤。

接下来，将LD柱置于磁力分离架上，并在柱下方放置一个5 mL试管，用于收集穿流组分。用移液器将细胞悬液加入LD柱中，收集阴性组分流穿液至试管中。用1 mL MACS缓冲液洗涤柱两次，每次的洗脱液均收集至同一试管中。

将 LD 柱置于新的 5 毫升离心管上。用移液器向柱中加入 3 毫升缓冲液。然后将带正电荷标记的细胞冲洗至一个 5 毫升离心管中。

将阳性和阴性组分均进行离心。然后将沉淀重悬于100 µL FACS缓冲液中。保留CD45 TER-119阴性组分，每10⁶个细胞加入1 µL每种抗体。

将悬液置于冰上 20 分钟。然后用 2 毫升 FACS 缓冲液洗涤悬液，再进行离心。向沉淀中加入 1 毫升缓冲液，并用移液器加入碘化丙啶以进行活细胞染色。

最后，将样品通过35微米细胞滤网过滤至5毫升离心管中，随后在多色流式细胞仪上分析细胞。在急性髓系白血病微环境内，小动脉内皮细胞显著扩增，同时伴随窦状内皮细胞群体的减少。在8周龄时，间充质基质细胞出现轻微扩增。