Name: 识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境群体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 了解利用流式细胞术分离和表征骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病小鼠模型中骨髓微环境基质细胞群体的方法。该方案结合机械与酶解消化及磁珠分选技术，为研究肿瘤进展中骨髓微环境变化提供了可靠工具。

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我们感谢罗切斯特大学医学中心流式细胞术核心实验室的支持。本研究由美国血液学会学者奖、白血病研究基金会奖以及授予 J.B. 的美国国立卫生研究院资助项目 R01DK133131 和 R01CA266617 资助。

所有动物实验均按照罗切斯特大学动物资源委员会批准的方案进行。小鼠在罗切斯特大学的动物饲养设施中繁殖和维持。为建立高危骨髓增生异常综合征（MDS）模型，采用 commercially available NHD13 小鼠模型19。在此模型中，在疾病发生前的8周龄雌性NHD13小鼠中分析骨髓基质细胞。从头发生的急性髓系白血病（AML）按先前所述方法建立6,11,20。用于诱导AML的癌基因（如MLL-AF9和NRas）被标记GFP或YFP，从而可通过流式细胞术分析非白血病性的GFP阴性骨髓细胞群。简言之，将10周龄雌性C57BL/6J小鼠移植入表达GFP/YFP的小鼠AML细胞，并在移植后2周采集骨髓。尽管本研究出于示范目的使用雌性小鼠，该方案同样适用于雄性或雌性小鼠。也可使用单侧股骨或全部长骨进行操作。
1. 骨髓采集
注意：有关动物解剖方案的详细信息，请参见 Amend 等人26。
<ol>
	<li>用70%乙醇清洗研钵和研杵，再用预冷的FACS缓冲液（表1）冲洗，并将其置于冰上冷却，以备开始收获前使用。同时，将MACs缓冲液（表1）放置于实验台，使其升至室温。</li>
	<li>根据机构动物护理与使用指南及规程实施动物安乐死。</li>
	<li>在实验台上，用70%乙醇彻底喷洒小鼠，直至其毛发湿润。使用镊子和弯头剪刀，提起腹部皮肤，在腹部两侧各做一条长约0.5 mm的切口，位置位于腹部外侧。接着，在远离腹部的一端再做一条0.5 mm的切口。向下拉扯，去除小鼠腿部的皮肤和毛发。</li>
	<li>将剪刀垂直于骨盆，用镊子向上拉股骨的同时向下按压。股骨头应从骨盆脱离。在髌股关节处分离股骨和胫骨。将骨骼置于盛有FACS缓冲液的6孔板中，并置于冰上。</li>
	<li>使用实验室级组织处理工具去除骨骼上的组织，并将清理后的骨骼转移至另一盛有新鲜FACS缓冲液的6孔板中，置于冰上。</li>
	<li>将所有骨骼放入研钵中，加入2–5 mL FACS缓冲液，确保所有骨骼完全浸没于缓冲液中（根据处理的骨骼数量调整缓冲液体积）。用研杵以环形运动方式研磨和捣碎骨骼，直至骨髓组织完全释放。</li>
	<li>使用3 mL注射器，通过反复吸取和冲入液体的方式，在研钵中均质化骨髓悬液。</li>
	<li>使用3 mL注射器从研钵中吸取液体，经70 µm细胞滤网过滤至置于冰上的50 mL离心管中。用FACS缓冲液将滤网上残留的骨组织碎片冲洗回研钵中，并返回步骤1.7，再次进行均质化和过滤。此部分即为骨髓组分。</li>
	<li>用FACS缓冲液将研钵中剩余的骨碎片（骨小梁）冲洗回研钵，再用FACS缓冲液将其冲入15 mL离心管中，以确保获得最大细胞得率。此部分即为骨小梁组分。</li>
</ol>
2. 骨髓消化
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心骨髓 5 分钟。倾去并弃除上清液。</li>
	<li>用 2 mL 骨髓消化液混合物（表 1）重悬骨髓，并转移至 15 mL 离心管中。在旋转仪上 37 °C 孵育 45 分钟。</li>
	<li>加入 10 mL FACS 缓冲液以终止酶消化反应。将混合物经 70 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 400 x g 离心 7 分钟，收集沉淀。</li>
	<li>用 1 mL 红细胞裂解缓冲液（见材料表）重悬骨髓沉淀。冰上孵育 4 分钟。</li>
	<li>加入 10 mL FACS 缓冲液以终止裂解反应。将混合物经 70 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。</li>
</ol>
3. 骨针的消化
<ol>
	<li>涡旋步骤1.9中得到的骨小梁，静置使其沉淀。弃去上清液，保留底部的骨组织。</li>
	<li>将骨小梁重悬于1 mL骨小梁消化液混合物中（表1）。</li>
	<li>将试管置于旋转仪上，37 °C孵育60分钟。</li>
	<li>加入10 mL FACS缓冲液以终止酶消化反应。将混合物经70 µm细胞滤网过滤，收集至含有已裂解红细胞并已完成消化的骨髓的50 mL试管中。</li>
</ol>
4. 染色
<ol>
	<li>轻轻混匀骨小梁和骨髓细胞悬液。</li>
	<li>取 10 µL 细胞悬液，使用 0.4% 台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数活细胞数量，操作步骤参照已发表的实验方案27。从细胞悬液中收集 50,000 个细胞作为未染色对照。</li>
	<li>将剩余细胞在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 100 µL FACS 缓冲液重悬细胞。 
	注意：可对抗体进行滴定以确定最佳稀释比例。抗体的选择（表位和荧光染料）可根据需要定制。</li>
	<li>进行磁性去除抗体染色时，加入 FC Block（每 25 × 106 个细胞加 1 µL）、CD45-APC（每 25 × 106 个细胞加 10 µL）和 Ter119-APC（每 25 × 106 个细胞加 4 µL）（参见 材料表）。</li>
	<li>冰上孵育 20 分钟。用 FACS 缓冲液洗涤，取出约 50 µL（含 50,000 个细胞）作为 APC 染色对照，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟，再用 100 µL FACS 缓冲液重悬。</li>
	<li>对细胞悬液进行磁性去除用微珠染色时，加入 mIgG（每 25 × 106 个细胞加 8 µL）和 Anti-APC 微珠（每 25 × 106 个细胞加 20 µL）（参见 材料表）。</li>
	<li>冰上孵育 20 分钟。用 10 mL FACS 缓冲液洗涤，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
</ol>
5. 通过磁性分选去除样本
注意：此步骤使用市售的手动磁力架，按照制造商说明书进行操作。此步骤也可使用自动磁力架完成（参见材料表）。
<ol>
	<li>用 2 mL MACs 缓冲液（表 1）洗涤 LD 柱，弃去流出液，并更换收集管。</li>
	<li>将最多 1 × 108 个细胞重悬于 MACs 缓冲液中，并通过带有 35 µm 细胞筛帽的 5 mL 试管过滤。</li>
	<li>将 LD 柱置于磁力分离架上，在柱下方放置一个 5 mL 试管以收集流出液。</li>
	<li>将细胞悬液加入已准备好的 LD 柱中。让阴性组分流过并进入收集管。用 1 mL MACs 缓冲液洗涤柱子两次，将洗脱液收集至同一试管中。此即为下文步骤 5.6 中所用的阴性组分。</li>
	<li>从磁力分离架上取下 LD 柱，将其置于一个新的 5 mL 试管上。使用移液器将 3 mL 缓冲液加入柱中，并用柱塞冲洗出阳性标记的细胞。</li>
	<li>将阴性和阳性组分在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。用 100 µL FACS 缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>用 0.4% 台盼蓝对阴性和阳性组分各取 10 µL 进行细胞计数。后续骨分析/内皮细胞 panel 染色所用体积将基于此细胞计数结果。</li>
	<li>从阳性组分中取 50,000 个活细胞用于流式细胞术设门对照。</li>
</ol>
6. 骨分析/内皮细胞面板染色
注意：补偿步骤应遵循标准的流式细胞术操作规程，包括所有适当的染色和设门对照。
<ol>
	<li>对于CD45/Ter119阴性细胞群的染色（每1 × 106个细胞各加1 µL抗体），加入CD31-PE-Cy7、Sca-1-BV421、CD51-PE和CD140a-PE-Cy5（见材料表）。</li>
	<li>冰上孵育20分钟。加入2 mL FACS缓冲液洗涤，然后在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>加入1 mL FACS缓冲液和1:1000稀释的碘化丙啶（PI）进行活/死细胞染色，随后将样品经装有35 µm细胞滤网帽的5 mL试管过滤。</li>
	<li>使用多色流式细胞仪分析细胞。</li>
</ol>

Isolation and Characterization of Bone Marrow Microenvironment in Myeloid Neoplasms

<ol><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li>
<li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li>
<li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li>
<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
<li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li>
<li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+stem+cells+and+microenvironment%3A+Biology+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+%CE%B2-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li>
<li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).</li>
<li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li>
<li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot%3A+Acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li>
<li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mll+translocations%2C+histone+modifications+and+leukaemia+stem-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.</a> Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).</li>
<li>Yoshimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+alterations+in+rna+splicing+and+epigenetic+regulation+drive+leukaemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis.</a> Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li>
<li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+genome-wide+crispr+screen+identifies+the+rna-binding+protein+staufen2+as+a+key+regulator+of+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia.</a> Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+mll-af9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).</li>
<li>Tikhonova, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+microenvironment+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.</a> Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).</li>
<li>Balderman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+bone+marrow+microenvironment+improves+outcome+in+a+murine+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 127 (5), 616-625 (2016).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

小鼠白血病模型已被广泛用于鉴定促进侵袭性髓系白血病进展的细胞内在信号和微环境驱动信号6,19,21。本文介绍了一种基于流式细胞术的综合性实验方案，用于定义骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）小鼠模型中骨髓微环境的细胞组成。
在获取实验样本的流式细胞术数据之前，必须仔细校正荧光信号重叠。同时，必须包含所有适当的染色和设门对照。这些步骤可使实验人员确认抗体阳性或阴性染色真实反映了目标细胞标志物的表达情况，而非荧光光谱重叠或自发荧光所致的人为假象。尽管本方案仅描述了部分选定的细胞表面标志物，但可根据实验需求扩展抗体组合。例如，可加入CD144（Ve-Cadherin） 体内 在收获小鼠之前即可作为内皮细胞的另一个特异性标志物5,29尽管此处指示的荧光染...

骨髓微环境由造血细胞、非造血性基质细胞以及细胞外基质组成1,2。该微环境可促进造血干细胞的自我更新，调控谱系分化，并为骨组织提供结构和机械支持1,2,3,4,5。基质细胞微环境包括成骨谱系细胞、成纤维细胞、神经细胞和内皮细胞6，而造血微环境则由淋巴系和髓系细胞群体构成1,2,3。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞相关疾病（如骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的发生发展中发挥重要作用7,8,9,10,11。研究表明，成骨谱系细胞中的突变可促进MDS、AML及其他骨髓增殖性肿瘤的发生发展10,12,13,14。
骨髓增生异常综合征是一组源于造血干细胞突变的白血病前期疾病。MDS 常伴随造血干细胞分化受阻以及发育异常细胞的产生，这往往可导致骨髓衰竭。MDS 是美国最常诊断的髓系肿瘤，其3年生存率约为35%–45%15。MDS 通常伴有向急性髓系白血病（AML）转化的高风险。这种并发症可能是致命的，因为由 MDS 衍生的 AML 对大多数治疗具有耐药性且容易复发。由于造血干细胞和祖细胞中的染色体易位或突变而从头发生的 AML 同样常对标准化疗耐药16,17。由于 MDS 和 AML 主要发生于老年人群，大多数患者诊断时年龄超过60岁，因此多数患者不适合接受根治性骨髓移植。因此，迫切需要鉴定疾病进展过程中的新型调控因子。由于骨髓微环境可为恶性细胞提供支持14，明确疾病进展过程中骨髓微环境的变化可能有助于发现以抑制肿瘤微环境重塑为靶向的新型治疗策略。因此，迫切需要识别并表征骨髓基质细胞群体在疾病进展中的变化，这些基质细胞可能为恶性细胞提供支持。
已建立多种小鼠急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）模型，可用于研究疾病发生和进展过程中骨髓微环境的变化6,1,19,20,21,22。本文描述了利用逆转录病毒诱导的AML小鼠模型6,20，以及 commercially available Nup98-HoxD13（NHD13）高危MDS向AML转化模型19，来鉴定骨髓基质细胞群体变化的实验方案。移植了de novo AML细胞的小鼠通常在20–30天内死于该疾病6。NHD13小鼠在约15–20周时出现血细胞减少和骨髓发育异常，最终转化为AML，近75%的小鼠在约32周时死于该病。为分析小鼠模型中骨髓微环境的细胞群体，需取材骨骼，通过酶消化法处理骨髓和骨小梁，随后利用磁珠分选富集CD45-/Ter119-非造血细胞群体。尽管此前已有类似分析方法的报道11,13,22,23,24,25，但这些方法通常仅关注骨髓或骨组织，未将来自两种来源的细胞同时纳入分析。结合这些细胞群体的表征与基因表达分析，可全面理解细胞造血微环境在疾病起始和进展过程中所起的支持作用（图1）。尽管下述方案主要聚焦于逆转录病毒诱导的AML模型和遗传性MDS模型，但这些策略可轻松适用于研究任何感兴趣的小鼠模型中骨髓微环境的变化。

<table><tbody><tr><td>1 mL 移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>AVANT</td><td>L211511-CS</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L型移液器吸头</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>24-140RL</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 单独包装无菌血清移液管</td><td>Globe Scientific</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 真空过滤瓶</td><td>NEST</td><td>344021</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 吸液移液管</td><td>NEST</td><td>325011</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L型移液器吸头</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>24-150-RL</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 单独包装无菌血清移液管</td><td>Globe Scientific</td><td>1780</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 单独包装无菌刻度吸管</td><td>Globe Scientific</td><td>1740</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管&amp;nbsp; 12 x 75 mm 规格</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞滤网帽，12 x 75 mm 型号</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>6孔，平底，低蒸发盖</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>带防水防潮层的吸水垫</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>APC 微珠</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro 分离仪</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>4425745</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）</td><td>BD 生物科学</td><td>553141</td><td>0.5 mg/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>66.000 g/mol</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 抗体 (D7)</td><td>Invitrogen</td><td>404-5981</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室&amp;nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳气体钢瓶</td><td>Airgas</td><td>CD50</td><td></td></tr><tr><td>CD31（PECAM-1）单克隆抗体（390），PE-Cyanine7</td><td>Invitrogen</td><td>25-0311-82</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>CD45单克隆抗体（30-F11），APC</td><td>Invitrogen</td><td>17-0451-82</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>细胞滤网 70 &amp;micro;m 尼龙&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials 玛瑙研钵和研杵；125 mL</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-63100-62</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶来自 &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138-500MG</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>STEMCELL</td><td>7415</td><td></td></tr><tr><td>康宁迷你离心机</td><td>CORNING</td><td>6770</td><td></td></tr><tr><td>康宁 Stripettor Ultra 移液控制器</td><td>康宁</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，粉末</td><td>Gibco</td><td>117105041</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x 红细胞裂解缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇，KOPTEC，符合英国药典（BP）、欧洲药典（Ph. Eur.）、美国药典（USP）分析规格（200 Proof）</td><td>VWR</td><td>89125-174</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锋利</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Foundation B 胎牛血清</td><td>GeminiBio</td><td>900-208</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&amp;nbsp;PIPETMAN L 移液器入门套装</td><td>FisherScientific&amp;nbsp;</td><td>F167370G</td><td></td></tr><tr><td>格劳费镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) 10x</td><td>gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>BINDER</td><td>C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>K222101</td><td></td></tr><tr><td>LABGARD II级A2型生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>LD 柱</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LSE 漩涡混合器</td><td>CORNING</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>647800L6</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACsmix 管式旋转仪&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>mIgG</td><td>Millipore-Sigma</td><td>18765-10mg</td><td>2 mg/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nup98-HoxD13 (NHD13) 小鼠</td><td>杰克逊实验室&amp;nbsp;</td><td>010505</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 CD51 抗体（RMV-7）</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 CD140a 抗体（仅供研究使用）</td><td>Biolegend</td><td>135920</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Plastipak 3 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶 - 1.0 mg/mL 水溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS&amp;nbsp; 分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall X Pro / ST Plus 系列离心机</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>75009521</td><td></td></tr><tr><td>TER-119 单克隆抗体（TER-119），APC</td><td>Invitrogen</td><td>17-5921-82</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>超纯 0.5 M EDTA，pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr></tbody></table>

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

骨髓微环境由多种不同的细胞群体组成，例如间充质基质细胞、内皮细胞、成骨细胞系细胞和成纤维细胞，这些细胞为造血干细胞（HSCs）提供支持。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞相关疾病（如骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的发生发展中发挥重要作用。HSCs中与MDS相关的突变会导致分化受阻以及进行性骨髓衰竭，尤其在老年人群中更为显著。MDS常可进展为治疗抵抗性的AML，后者是一种以未成熟髓系原始细胞快速积聚为特征的疾病。已知患有这些髓系肿瘤的患者的骨髓微环境会发生改变。本文介绍了一种从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离并进行表型鉴定骨髓微环境细胞的全面实验方案。对骨髓微环境细胞群体的变化进行分离和表征，有助于明确其在疾病起始和进展中的作用，并可能推动针对骨髓基质细胞中促癌性改变的新型治疗策略的开发。

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于分析骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病小鼠模型中骨髓微环境细胞群，例如内皮细胞和间充质基质细胞图1). 图2 展示了目标细胞群的设门策略，首先通过前向散射和侧向散射特征，在消化后并去除CD45/Ter119阳性细胞的组分中选择细胞（P1）。图中显示了白血病样本中P1细胞的示例设门结果图2A). 选择单细胞而排除双联体进行此分析，P2（图2B). 图 2C 显示门控以选择碘化丙啶阴性活细胞，P3。为聚焦于非造血基质细胞群体，选择 CD45-/Ter119- 的细胞，P4（APC，Y轴） 与. 选择 SSC-A（图 2D）。此初始设门策略适用于所有待分析样本。
小鼠白血病模...

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。

骨髓微环境由不同的细胞群体组成，例如间充质基质细胞、内皮细胞、成骨谱系细胞以及……

我们的研究旨在探索骨髓微环境的变化如何影响肿瘤生长。我们建立了一种流式细胞术检测方案，用于分析骨髓和骨组织中的非免疫细胞，重点关注海洋性血液系统恶性肿瘤。该方法可适用于多种镜像模型中骨髓的研究。本研究聚焦于在癌症进展过程中分离并鉴定骨髓基质细胞群体的变化。了解这些变化对疾病发生和发展的影响，可能为靶向骨髓基质细胞中促进癌症的改变提供新的治疗策略。我们的实验方案独特地结合了机械消化与酶消化、磁珠耗竭法以及流式细胞术，以明确骨髓微环境的细胞组成。该方法通过采用磁性分离技术，并整合来自骨组织和骨髓的细胞，从而更全面地呈现这一微环境。首先，从安乐死后的解剖小鼠骨骼中取出组织。将清洗后的骨骼放入置于冰上的新六孔板中，六孔板内含有FACS缓冲液。将骨骼转移至研钵中，加入2到5毫升FACS缓冲液。以环形运动研磨骨骼，直至释放骨髓。用3毫升注射器反复抽吸并冲洗骨髓，以使其均质化。将匀浆液吸入另一支注射器中，然后通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升离心管中。用FACS缓冲液将滤筛上的组织块冲洗回研钵中，再次进行匀浆。按之前方法对冲洗后的组织进行过滤。接下来，用FACS缓冲液将残留的骨小梁冲洗回研钵中。然后将组织块转移至15毫升离心管中，以确保获得最大产量。为了消化骨髓，首先在4摄氏度下以300G离心5分钟。将骨髓沉淀重悬于2 mL消化液中。将混合液转移至15 mL离心管，然后在37°C下于旋转仪上孵育45分钟。随后加入10 mL FACS缓冲液以终止酶消化反应。将混合物通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升离心管中。在4摄氏度下以400G离心7分钟。用1毫升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。接下来，加入 10 毫升 FACS 缓冲液以终止裂解。然后将混合物如前所述过滤至 50 毫升离心管中。最后，在 4 摄氏度条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于 100 微升 FACS 缓冲液中。消化骨针时，先将骨针涡旋混匀，然后倾去上清液，保留底部的骨组织。接下来，将骨针重悬于1毫升骨针消化液中。将离心管置于旋转仪上，在37摄氏度下孵育60分钟。最后，加入10毫升FACS缓冲液终止消化反应。将混合物过滤到含有已裂解红细胞并已消化的骨髓的50毫升离心管中。首先，将分离的小鼠骨髓悬液与骨小梁悬液混合。用移液器吸取10微升细胞悬液滴加到血细胞计数板上进行计数。将细胞悬液在4°C条件下以300×g离心5分钟。然后将沉淀重悬于100 µL FACS缓冲液中。为通过抗体进行磁性去除染色，加入Fc阻断剂CD45 APC和TER-119 APC。然后用FACS缓冲液洗涤细胞悬液。离心剩余混合物后，将沉淀重悬于100 µL的FACS缓冲液中。为使用磁性微珠进行耗竭染色，向细胞悬液中加入小鼠IgG和抗APC微珠。将混合物置于冰上孵育20分钟。用2毫升MACS缓冲液洗涤LD柱。将细胞重悬于缓冲液中，然后通过带有35微米细胞筛网帽的5毫升试管进行过滤。接下来，将LD柱置于磁力分离架上，并在柱下方放置一个5 mL试管，用于收集穿流组分。用移液器将细胞悬液加入LD柱中，收集阴性组分流穿液至试管中。用1 mL MACS缓冲液洗涤柱两次，每次的洗脱液均收集至同一试管中。将 LD 柱置于新的 5 毫升离心管上。用移液器向柱中加入 3 毫升缓冲液。然后将带正电荷标记的细胞冲洗至一个 5 毫升离心管中。将阳性和阴性组分均进行离心。然后将沉淀重悬于100 µL FACS缓冲液中。保留CD45 TER-119阴性组分，每10⁶个细胞加入1 µL每种抗体。将悬液置于冰上 20 分钟。然后用 2 毫升 FACS 缓冲液洗涤悬液，再进行离心。向沉淀中加入 1 毫升缓冲液，并用移液器加入碘化丙啶以进行活细胞染色。最后，将样品通过35微米细胞滤网过滤至5毫升离心管中，随后在多色流式细胞仪上分析细胞。在急性髓系白血病微环境内，小动脉内皮细胞显著扩增，同时伴随窦状内皮细胞群体的减少。在8周龄时，间充质基质细胞出现轻微扩增。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境群体

本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。...

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

检测微小残留病（MRD）是急性髓系白血病（AML）中用于优化风险评估和预测复发的重要预后生物标志物。这些关于MRD一致且准确识别与检测的最佳实践指南和建议，可有助于制定有效的AML治疗决策。...

全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。...

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

在此，我们介绍一种用于表征巨核细胞分化的免疫表型分析策略，并展示该策略如何利用荧光激活细胞分选仪对处于不同发育阶段的巨核细胞进行分选。该方法可应用于人类原代组织，也可用于体外培养生成的巨核细胞 体外.

从人类原代来源或分化样本中对人巨核细胞进行免疫表型分析和细胞分选 体外 来自造血祖细胞

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

在此，我们介绍一种易于实施、标准化的微生理系统，该系统能够反映人类骨髓的复杂性 体内...

用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。...

在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

了解利用流式细胞术分离和表征骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病小鼠模型中骨髓微环境基质细胞群体的方法。该方案结合机械与酶解消化及磁珠分选技术，为研究肿瘤进展中骨髓微环境变化提供了可靠工具。

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

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