Name: 显微镜辅助分期肝切除术的关联肝分区和门静脉结扎的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 了解ALPPS分期肝切除术技术，利用PMX小鼠模型研究肝脏再生机制。本方法结合单细胞测序与CRISPR技术，揭示Gata3和Ramp2在肝细胞中的调控作用，为不可切除肝肿瘤患者的治疗提供新思路。

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本方案中的所有实验均经江西省人民医院兽医主管部门批准（编号 70/2022）。此外，所有实验步骤均严格遵守机构动物护理与使用委员会的规定。
1. 手术开始
注意：将体重为20–22 g的雄性C57BL/6小鼠饲养于通风良好的笼具中，维持在标准无病原体环境中，光照/黑暗周期为12 h/12 h。动物被提供 随意摄取 在22 ± 1 °C的受控环境温度下自由获取食物和水。手术在专用显微外科室内进行，使用手术显微镜（图1假手术组小鼠仅接受剖腹手术，但未对肝脏进行任何操作。PVL组小鼠部分门静脉分支被结扎，而ALPPS组在门静脉结扎（PVL）的基础上进一步横断中叶肝脏。
<ol>
	<li>将小鼠禁食 4–6 小时&#160;作为术前准备。 
	注意：必须进行禁食，因为进食会导致小鼠胃部膨胀，从而影响手术视野，并容易造成胃壁意外损伤。</li>
	<li>在侧边操作台上准备无菌外科器械，包括显微镊子、剪刀、腹腔牵开器以及预先制备好的 8-0 门静脉结扎缝线。将术中使用的无菌纱布和棉球浸泡于 37 °C 的生理盐水中。</li>
	<li>诱导麻醉时，先让动物暴露于 5% v/v 异氟烷 30 秒，随后以 3 vol% 异氟烷维持麻醉，直至达到深度麻醉状态。通过夹捏足趾反射来判断麻醉深度。在诱导阶段，皮下注射美托咪啶，剂量为 5 mg/kg。</li>
	<li>在动物眼睛上涂抹眼膏，并皮下注射 1 mL 乳酸林格氏液与 5% 葡萄糖的混合液，将剂量平均分配至下腹部两侧。</li>
	<li>使用小型动物专用电推剪仔细剃除腹部毛发，范围从剑突至生殖区域，两侧各延伸约 2 cm。</li>
	<li>用聚维酮碘和酒精交替消毒手术区域，共消毒 3 次&#160;。</li>
	<li>使用手术刀在皮肤正中线处做一条 2.5–3.0 cm 长的切口，随后用手术剪小心地打开腹腔。</li>
	<li>使用腹腔牵开器扩大切口，借助无菌湿润棉签轻柔牵拉十二指肠及一段小肠。用预先准备好的无菌纱布覆盖这些结构，同时暴露门静脉的肝段。</li>
</ol>
2. 门静脉结扎术（PVL）
注意：整个操作过程中所有步骤均需轻柔。处理肝组织时应使用湿润的棉球。
<ol>
	<li>剥离腹膜和肠管，确保门静脉完全暴露。</li>
	<li>在暴露主门静脉的过程中，通过缓慢、有意识地向前推进并撑开的方式，逐步环绕其分支进行操作。</li>
	<li>按以下顺序依次辨认门静脉的各个分支：（1）右后支，（2）左外侧支与左中支的汇合支，（3）尾状叶支（图2A）。</li>
</ol>
3. 门静脉分支右后支的解剖
<ol>
	<li>经门静脉主干穿过肝门时，可见右后叶的一个显著分支。</li>
	<li>使用湿润的棉球作为填充物，分离肝脏中叶与右后叶，以避免可能的损伤。</li>
	<li>务必沿格利森囊（覆盖肝脏表面的腹膜）进行解剖，并牵引一根1.5 cm长的丝线，环绕门静脉分支进行结扎。</li>
	<li>使用8-0丝线结扎门静脉的右后支。门静脉结扎成功的可靠指标是肝脏出现明显的苍白。</li>
</ol>
4. 门静脉左外侧支和左内侧支的解剖
<ol>
	<li>左外叶（LLL）和左内叶（LML）的门静脉分支共用一条主门静脉。务必仔细解剖左外叶与尾状叶之间可能存在的间隙。 
	注意：在此手术模型中，结扎左外叶和左内叶的门静脉分支最为困难，因为显微镊必须穿过门静脉周围的间隙，同时避免损伤肝脏。</li>
	<li>将显微镊从第4.1步创建的入口处插入，并缓慢移动手部操作，因为即使是最轻微的阻力，也可能提示显微镊接近了肝脏或血管。</li>
	<li>当感到阻力时，轻微调整显微镊方向，使其向前推进并穿过右内叶（RML）Glisson囊的表面（图3C）。</li>
	<li>使用预先准备好的8-0丝线，环绕左外叶和左内叶的门静脉分支进行结扎。结扎后，观察肝脏中叶出现明显的缺血分界线，同时左叶呈现苍白。</li>
</ol>
5. 门静脉分支的尾状叶支解剖
<ol>
	<li>分离尾状叶，并使用棉签填充主门静脉与尾状叶之间的潜在间隙。</li>
	<li>剥离尾状叶的腹膜，以显露该叶的门静脉分支。</li>
	<li>结扎门静脉尾状叶分支时应采用缝合贯穿法（Stitch-up suture），而非环绕结扎法（tie-around），确保缝针路径充分包绕门静脉的尾状叶分支。 
	注意：门静脉尾状叶分支结扎的难点在于该分支被肝组织包绕，且位置紧邻主门静脉。建议缝针穿透深度为 1 mm。</li>
</ol>
6. 肝脏离断与胆囊切除术
<ol>
	<li>观察肝中叶的明显分界线，并沿此线进行切开（图2B）。</li>
	<li>使用电凝笔沿分界线预先切出一条0.5 mm的切口线。</li>
	<li>使用显微镊子和电凝笔切割肝组织，同时用棉签压迫止血。 
	注意：切开过程中的难点在于掌握切割深度。目标是尽可能贴近下腔静脉将肝脏分开。术中出血较难避免，需通过反复练习掌握切开深度。可使用热灼、棉签压迫和明胶海绵辅助止血。</li>
	<li>最后切除胆囊，因其可在整个手术过程中提供良好的牵拉着力点。</li>
	<li>使用棉签施加可控压力以实现止血；若出血持续，提示下腔静脉已受损，缝合修复效果较差，应立即实施安乐死。</li>
</ol>
7. 手术的最后步骤
<ol>
	<li>关闭腹腔前，确保将小肠准确放置于腹腔内。</li>
	<li>使用6-0可吸收缝线牢固缝合腹膜和腹壁，皮肤则用4-0可吸收缝线缝合。</li>
	<li>再次对皮肤表面进行消毒，以确保最佳清洁度。</li>
	<li>在切口部位皮下注射1 mL生理盐水以及芬太尼0.02 mg/kg和美洛昔康4 mg/kg，以缓解术后疼痛并补充术中可能的液体丢失。</li>
	<li>将动物置于加温表面，以促进其自然苏醒，并监测其四肢的血液供应情况。随后将其单独饲养于笼中，继续观察直至完全恢复意识。</li>
	<li>动物恢复后，皮下注射美托咪啶，剂量为4 mg/kg，术后持续给药24小时。</li>
</ol>
8. 肝脏再生与肝功能的术中测量
<ol>
	<li>处死小鼠，并在术后第1、2、3和7天分别采集肝脏及血液样本。</li>
	<li>进行苏木精-伊红（HE）染色和肝功能检测，并检测血清炎症标志物，从而为模型构建的影响提供进一步验证。</li>
	<li>记录手术后1周内小鼠体重及未来残肝体积/体重（FLR/BW）比值的每日变化情况。</li>
</ol>

Studying Liver Regeneration of ALLPS in Animal Models for Staged Hepatectomy

<ol><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+Biological+and+pathological+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: Biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 18 (1), 40-55 (2021).</li>
<li>Chapelle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+future+remnant+liver+function+is+a+better+tool+to+pr+edict+post-hepatectomy+liver+failure+than+platelet-based+liver+scores%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Estimation of the future remnant liver function is a better tool to pr edict post-hepatectomy liver failure than platelet-based liver scores.</a> Eur J Surg Oncol. 43 (12), 2277-2284 (2017).</li>
<li>Isfordink, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+vein+ligation+versus+portal+vein+embolization+for+induction+of+hypertrophy+of+the+future+liver+remnant%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Portal vein ligation versus portal vein embolization for induction of hypertrophy of the future liver remnant: A systematic review and meta-analysis.</a> Surg Oncol. 26 (3), 257-267 (2017).</li>
<li>Linecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+adjustment+in+alpps+is+associated+with+a+dramatic+decrease+in+ear+ly+mortality+and+morbidity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Risk adjustment in alpps is associated with a dramatic decrease in ear ly mortality and morbidity.</a> Ann Surg. 266 (5), 779-786 (2017).</li>
<li>Darnis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtotal+hepatectomy+in+swine+for+studying+small-for-size+syndrome+and+portal+inflow+modulation%3A+Is+it+reliable%5BTitle%5D)+AND+%22HPB+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Subtotal hepatectomy in swine for studying small-for-size syndrome and portal inflow modulation: Is it reliable.</a> HPB (Oxford). 17 (10), 881-888 (2015).</li>
<li>Casellas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+mouse+strains+and+genetic+stability%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Inbred mouse strains and genetic stability: A review.</a> Animal. 5 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+associating+liver+partition+and+portal+vein+ligation+for+staged+hepatectomy+from+2012+to+2021%3A+A+bibliometric+analysis.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Evolution of associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy from 2012 to 2021: A bibliometric analysis. Review.</a> Int J Surg. 103, 106648(2022).</li>
<li>Parola, M., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+Pathophysiology%2C+pathogenetic+targets+and+clinical+iss+ues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: Pathophysiology, pathogenetic targets and clinical iss ues.</a> Mol Aspects Med. 65, 37-55 (2019).</li>
<li>Kikuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+associating+liver+partition+and+portal+vein+occlusion+for+st+aged+hepatectomy+on+tumor+growth+in+a+mouse+model+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of associating liver partition and portal vein occlusion for st aged hepatectomy on tumor growth in a mouse model of liver metastasis.</a> Eur J Surg Oncol. 44 (1), 130-138 (2018).</li>
<li>Schlegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpps%3A+From+human+to+mice+highlighting+accelerated+and+novel+mechanism+s+of+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Alpps: From human to mice highlighting accelerated and novel mechanism s of liver regeneration.</a> Ann Surg. 260 (5), 839-846 (2014).</li>
<li>Dili, A., Lebrun, V., Bertrand, C., Leclercq, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associating+liver+partition+and+portal+vein+ligation+for+staged+hepate+ctomy%3A+Establishment+of+an+animal+model+with+insufficient+liver+remnan+t%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepate ctomy: Establishment of an animal model with insufficient liver remnan t.</a> Lab Invest. 99 (5), 698-707 (2019).</li>
<li>Schadde, E., Hertl, M., Breitenstein, S., Beck-Schimmer, B., Schläpfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+the+associating+liver+partition+and+portal+vein+ligation+for+staged+hepatectomy+%28alpps%29+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rat model of the associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy (alpps) procedure.</a> J Vis Exp. (126), e55895(2017).</li>
<li>Allaire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+liver+resection+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Rep%22%5BJournal%5D)">New frontiers in liver resection for hepatocellular carcinoma.</a> JHEP Rep. 2 (4), 100134(2020).</li>
<li>Memi, F., Ntokou, A., Papangeli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crispr%2Fcas9+gene-editing%3A+Research+technologies%2C+clinical+applications+and+ethical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Crispr/cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications and ethical considerations.</a> Semin Perinatol. 42 (8), 487-500 (2018).</li>
<li>Saviano, A., Henderson, N. C., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics+and+spatial+transcriptomics%3A+Discovery+of+novel+cell+states+and+cellular+interactions+in+liver+physiology+and+disease+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology.</a> J Hepatol. 73 (5), 1219-1230 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究介绍了一种在小鼠中实施ALPPS手术初始阶段的方案，包括门静脉部分结扎及肝脏中叶的分离。该方法高度模拟人类ALPPS手术过程，由于小鼠肝脏具有独特的叶段结构，并且中叶接受双重门静脉供血，从而确保术后形成明确的血流分布11。值得注意的是，ALPPS手术包含两个独立的外科阶段。本研究仅展示第一阶段，即门静脉分支结扎与肝实质离断，记为PVL+T。需要特别说明的是，第二阶段（部分肝叶切除术）在本研究中并未实施。为保持描述的一致性，本文将ALPPS等同于PVL+T。尽管既往研究主要集中于大鼠模型，苏黎世大学团队曾首次报道针对小鼠的ALPPS特异性方案12，但目前仍缺乏标准化的小鼠操作流程。相较于大鼠，小鼠更易于进行遗传学操作，在肝再生研究方面具有更广泛的应用前景，因此建立小鼠特异性的ALPPS模型对于在临床相关条件下深入理解肝再生机制具有重要价值
本方案的关键步骤包括将ALPPS手术简化为门静脉结扎联合肝实质离断（PVL combined with T），并强调小鼠门静脉的解剖结构，以帮助初学者理解。每一片小鼠肝叶均有独立的门静脉，类似于临床肝切除策略（图3A）。关键操作要点在于仔细结扎门静脉分支，以防止术中出血并确保术后存活，同时需识别这些分支周围的间隙，以便于结扎操作。术中使用无菌棉球有助于保护肝脏，由于肝脏组织脆弱，操作时必须轻柔。在结扎左外侧叶和中叶时，准确找到合适的解剖间隙至关重要；对于尾状叶的门静脉分支，则需采用缝合结扎法进行处理。
两种不同的外科手术方法——门静脉结扎（PVL）和门静脉结扎联合离断（PVL+T）——产生的肝再生动力学和未来残肝（FLR）结果存在显著差异。PVL 在术后 2 天内引起中等程度的肝脏体积增加，而 PVL+T 则表现出更明显的右中叶（RML）增大，如图 4A 和 图 5A 所示。这一现象可通过未来残肝/体重（FLR/BW）比值以及 Ki67 阳性染色比例的评估进一步验证，如 图 4B、D 所示。在 FLR/BW 比值或免疫组化染色（如 Ki67/MCM2/Ccnd1）方面，按照方案步骤 1 所述的 ALPPS 操作，术后 2 天 FLR/BW 比值预期增加约 1.3–1.5 倍。Ki67 阳性染色表现为每 100 个肝细胞中有 15–20 个阳性细胞。
该方案借鉴了大鼠的ALPPS手术流程，旨在增强对解剖结构的理解，优化手术技术，并改善小鼠的术后效果。然而，该模型可能无法完全模拟在不同生理条件下小鼠的肝再生过程，因为临床ALPPS患者常伴有肝炎、肝硬化或肝癌等疾病状态。未来的研究应纳入多种肝脏或系统性疾病背景，以更准确地评估ALPPS术后的肝脏状况13。
为了评估不同组别肝衰竭的风险，我们量化了术后肝脏中的转氨酶水平，并比较了各自的生存曲线（图4D、E）。值得注意的是，ALPPS术式展现出快速肝脏再生的能力，并可纠正由肝功能不全引起的代谢紊乱。此外，考虑到肝脏存在显著的区域异质性，我们对术后不同时间点从门静脉至中央静脉区域的肝细胞进行了苏木精-伊红（HE）染色。该分析显示，肝脏在术后2-3天出现细胞凋亡和坏死，随后约在第7天肝细胞迅速恢复至术前状态（图6）。值得注意的是，不同肝区之间未观察到显著差异，提示深入研究肝脏异质性可能有助于进一步揭示肝脏再生与肝细胞多样性之间的复杂关系。
此外，在术前准备过程中，某些细节需要仔细考虑。关于术前禁食，必须注意手术需要进入腹腔。肠管扩张可能在术中影响门静脉的暴露，增加意外肠损伤的风险。一个值得关注的方面是学习曲线，其受到解剖学知识、手法灵巧性以及外科天赋等因素的影响。掌握显微操作技术通常需要约100小时的训练，相当于在约30只小鼠身上进行反复操作。
肝脏离断是ALPPS手术模型中的关键步骤。选择适当的离断程度对于防止对下腔静脉造成副损伤至关重要，这一问题将在修订后的文稿中进一步阐述。止血时必须使用电凝止血和棉签压迫法，沿缺血线从浅层到深层系统性地进行离断。值得注意的是，在细致的逐层止血后，肝脏切面未出现过度出血的情况。
总之，我们将大鼠ALPPS方案改良后应用于小鼠，显著提高了存活率并减少了术中出血。然而，关于在此背景下驱动肝脏再生的关键因素仍存在疑问：是门静脉结扎引起的血流动力学改变，还是肝脏离断所诱发的炎症反应？ALPPS最初是在肝癌患者中偶然发现的，并发展成为一种通过手术增加肝脏体积的方法，但其促进肝脏再生的具体机制至今仍未完全阐明。本研究结合CRISPR基因编辑技术和单细胞测序技术14,15，旨在揭示炎症因子、肝细胞、免疫细胞及其他细胞在肝脏再生过程中的相互作用，从而为术后肝脏再生提供新的治疗策略，并预防肝功能衰竭的发生。

肝脏具有强大的再生潜力，在因各种肝部疾病进行切除手术后，仅需短短3个月内即可迅速增殖并恢复代谢功能1。然而，为确保肿瘤切缘的完整性，往往不可避免地需要进行大范围肝切除。因此，保证足够的参与性肝组织体积，即未来肝残余（future liver remnant, FLR），显得至关重要2。在过去几十年中，ALPPS（联合肝脏离断和门静脉结扎的分阶段肝切除术）已成为肝胆外科领域的一项突破性技术，尤其适用于肿瘤切除后残余肝体积不足的患者，被誉为肝胆肿瘤外科领域最具前景的重大进展之一3。
在建立ALPPS动物模型方面已取得显著进展。理想的模型通常要求保留的肝叶具有独立的血液流入（门静脉和肝动脉）和流出（肝静脉），并且保留肝叶与拟切除肝叶之间有清晰的分界，以防止侧支循环的形成4。尽管ALPPS能够刺激残留肝组织快速再生，但这一过程的具体机制仍不明确。
目前，ALPPS 模型分为三种类型：大型动物模型（如猪和羊）、中型动物模型（如兔和啮齿类动物）以及小型动物模型（如小鼠）5。小鼠繁殖迅速且易于进行基因改造，因此在深入研究肝脏再生机制方面尤为有效6。此外，小鼠的肝脏结构，尤其是其肝中静脉，与人类高度相似，使其非常适用于 ALPPS 模型的建立。
需要注意的是，临床实践中大多数肝细胞癌患者均伴有基础肝病，这与研究中通常使用的健康肝模型不同7。因此，采用预先建立肝纤维化或病毒感染的小鼠模型，可更准确地模拟各类肝病患者在手术后的应答及术后肝再生过程8。该策略有助于发现具有临床意义的新的治疗靶点。
迄今为止，苏黎世大学和东京大学等一些知名研究团队已成功建立了小鼠ALPPS模型9,10。在受控条件下建立标准化的小鼠模型，有助于加深我们对ALPPS术后观察到的肝脏快速再生现象的理解。

<table><tbody><tr><td>5%葡萄糖注射液（500 mL）</td><td>Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)</td><td>H20003666</td><td>高效、廉价、易于获取</td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>RWD (www.rwdls.com)</td><td>R500</td><td>价格低且质量可靠，适合初学者操作使用</td></tr><tr><td>C57 BL/6</td><td>The Jackson Lab</td><td>22349-2023</td><td>品系稳定性高</td></tr><tr><td>异氟烷（isoflurane）</td><td>KCSW (kcsw.szqisoubao.com)</td><td>H19980141</td><td>持久、经济实惠</td></tr><tr><td>美洛昔康（meloxicam）</td><td>Boehringer-Ingelheim</td><td>H20020217</td><td>持久且高效</td></tr><tr><td>显微镊</td><td>maydeal</td><td>60018920</td><td>耐用且高效</td></tr><tr><td>显微器械</td><td>CH显微外科器械厂</td><td>HC-A804-1</td><td>耐用、经济实惠</td></tr><tr><td>乳酸钠林格液</td><td>Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)</td><td>H20193277</td><td>高效、廉价、易于获取</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>CH显微外科器械厂</td><td>6-0/8-0</td><td>性能价格比高</td></tr><tr><td>局部用抗体</td><td>陈新药理学公司（chenxin pharmacology）(www.cisen-pharma.com)</td><td>H20020217</td><td>有效避免切口感染</td></tr></tbody></table>

一种在显微镜辅助下建立用于分阶段肝切除术的肝脏联合分割和门静脉结扎小鼠模型

A Mouse Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy Procedure Aided by Microscopy

肝切除术被广泛认为是治疗肝部恶性肿瘤的主要方法；然而，术后肝功能衰竭仍是围手术期死亡的主要原因，严重影响患者的预后。在肝功能良好的情况下，未来残余肝体积（FLR）必须超过25%；而在肝硬化患者中，这一要求则提高至40%以上。目前，未来残余肝体积不足是肝切除手术进展的主要障碍之一。
传统增强未来肝残余体积（FLR）增生的方法主要集中在门静脉栓塞术（PVE），但其效果受到显著限制。近年来，已有大量关于一种新型两阶段肝切除技术的报道，该技术结合肝脏分割与门静脉结扎，被称为联合肝脏分割和门静脉结扎分期肝切除术（ALPPS）。ALPPS在诱导FLR增生方面比PVE更有效且作用显著。然而，ALPPS促进肝再生的具体机制尚未完全阐明。因此，在动物模型中复制ALPPS手术对于深入研究肝再生的分子机制至关重要，可提供有价值的理论与实践依据。

与PVL（方案步骤2、3、4和5）相比，接受ALPPS（步骤2、3、4、5和6）手术干预的小鼠表现出更强的细胞增殖倾向。图2展示了门静脉结扎后肝脏中叶的缺血分界线，以及肝实质离断过程中的视野，这是ALPPS与PVL之间的一个关键区别。值得注意的是，肝组织中炎症介质的水平，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素和肝细胞生长因子（HGF），均高于PVL组。这一点在图4C中可见，ALPPS组的IL-6水平高于PVL组，提示炎症可能参与了肝脏的快速再生过程。为进一步证实这些发现，已对术后两天的肝体比以及肝组织中细胞增殖标志物ki67的表达水平进行了比较分析。图4A、B和图5显示，ALPPS组的肝脏表现出更强的增殖能力。
<img alt="用于手术准备的蓝色织物上摆放的外科器械和缝合线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66098/66098fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：外科器械和耗材。（A）1：切口用局部抗生素；2：6-0、8-0 外科缝合线；3：止血明胶海绵。（B）1：剪刀和 2：持针器，用于腹腔的切开和缝合。（C）显微操作需要使用 1：剪刀，2：镊子，3、4：解剖镊，5：腹腔牵开器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66098/66098fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝脏叶解剖示意图，使用手术器械牵拉左叶的手术过程图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66098/66098fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：肝脏手术操作过程。（A）门静脉结扎与横断。依次对1、2、3进行精细结扎，同时精细分离肝中叶内的肝实质。（B）中叶的分界线以白色虚线形式直观显示。（C）经显微镜检查后，沿所划定的缺血边界对肝脏进行精细解剖分离。缩写：RLL = 右外侧叶；LML = 左中叶；LLL = 左外侧叶；RML = 右中叶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66098/66098fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术操作序列、修复技术、组织缝合、临床实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66098/66098fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：门静脉结扎。（A）右外侧叶门静脉结扎；虚线区域对应结扎的RLL。（B）左中叶和左外侧叶门静脉结扎；虚线区域表示门静脉分支结扎的入口。（C）虚线区域对应结扎的LML和LLL。（D）尾状叶门静脉结扎；虚线区域界定生理灌注的右中叶，而箭头标示位于肝实质内的尾状叶门静脉分支。缩写：RLL = right lateral lobe；LML = left middle lobe；LLL = left lateral lobe。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66098/66098fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝脏再生图表；重量、生长、IL-6、存活率、ALT；PVL 与 ALPPS；数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66098/66098fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：ALPPS 与 PVL 术后第一周内未来肝脏残余体积、动力学生长率、存活率及血浆 ALT 的比较。（A）术后评估 PVL 组和 PVL+T 组的未来肝脏残余体积（FLR）。（B）动力学生长率（KGR）定义为每日左肝相对体重比（LMR/体重）的增加量。ALPPS 组的 KGR 在术后 2 天内迅速上升，随后逐渐下降，但仍高于 PVL 组。（C）PVL 与 ALPPS 两组间的血浆 IL-6 水平。（D）PVL 和 ALPPS 术后的生存曲线。（E）PVL 与 ALPPS 两组间的血浆 AST 水平。缩写：FLR = 未来肝脏残余体积；PVL = 门静脉结扎；PVL + T = 门静脉结扎 + 肝实质离断；KGR = 动力学生长率；LMR = 左肝；ALPPS = 分期肝切除术中的联合肝脏分割与门静脉结扎；ALT = 丙氨酸氨基转移酶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66098/66098fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝脏再生实验；组织学切片，Ki67染色，细胞增殖分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66098/66098fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：门静脉结扎或联合离断术后肝脏再生的标志物与形态学特征。 （A）术后第2天，假手术组、门静脉结扎组（PVL组）和门静脉结扎联合离断组（PVL+T组）的肝脏形态学评估结果。标示区域代表再生的肝叶；比例尺 = 1 cm。（B）荧光染色显示不同手术组肝脏中细胞增殖水平存在异质性；比例尺 = 100 µm，***P &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66098/66098fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="肝脏组织学，7天内肝组织愈合过程，显微镜图像，细胞再生时间序列分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66098/66098fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：ALPPS术后从门静脉至中央静脉的组织学图像。 （A）ALPPS术后0天至第2天的肝脏HE染色结果。（B）第3天至第7天的HE染色结果。比例尺 = 100 µm。缩写：HE = 苏木精-伊红；ALPPS = 联合肝脏离断和门静脉结扎分阶段肝切除术。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66098/66098fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

联合肝脏分割和门静脉结扎分阶段肝切除术（ALPPS）已被证实可在第一阶段手术后数周内显著促进肝脏再生。已建立接受ALPPS的动物模型，以探索肝脏再生潜力并获得理想的临床效果。

肝切除术被广泛认为是治疗肝部恶性肿瘤的主要手段；然而，术后肝功能衰竭仍是围手术期...

ALPPS 可以快速促进肝脏再生。然而，目前关于啮齿类动物小动物模型以及再生机制的研究仍然不足。该模型可用于研究严重肝损伤后肝脏再生所涉及的分子和细胞通路。借助ALPPS和PMX小鼠模型，近期研究表明，肝细胞中Gata3与Ramp2的平衡调控术后肝再生过程中的肝肌性重建。单细胞测序、单细胞转座酶可及性测序以及单细胞CRISPR技术为发现正常及病变肝脏中此前未知的细胞类型和亚型开辟了道路。ALPPS技术用于无法通过手术切除的肝肿瘤患者。手术后剩余肝脏的再生能力对患者的生存至关重要。然而，ALPPS术后潜在的机制仍完全未知。基于此前关于大鼠和小鼠ALPPS GeCKO模型的报道，我们建立了一种与临床操作和天然肢体相一致的小鼠GeCKO实验方案。首先，将1毫升含5%葡萄糖的乳酸林格液经皮下注射至麻醉小鼠体内。使用小型动物专用剪毛器剃除小鼠腹部约2厘米区域的毛发。随后，用手术刀沿腹中线做一切口。使用手术剪切开切口。用腹部拉钩扩大切口，同时用无菌湿润的棉签轻柔牵拉十二指肠及一段小肠。用预先准备好的无菌棉签覆盖周围组织，以暴露门静脉的肝段。进行门静脉结扎时，需轻柔缓慢地向前推移并撑开，剥离腹膜和肠管，显露门静脉主干的各主要分支。辨认右后支、左外侧支与中叶支的汇合部以及尾状叶支。接下来，分离右后支时，应通过门静脉主干在肝门处走行时所形成的显著可见分支来定位该支。使用湿润的棉球作为填塞物，将肝脏中叶与右后叶分开。沿格利森囊进行解剖。在门静脉分支周围穿过一段长约1.5厘米的丝线结扎线。然后，使用8-0丝线结扎右侧后支。在分离左侧外侧支和中支时，首先分离左外侧叶与尾状叶之间可能存在的间隙。接着，将一对显微镊插入所创建的入口处。当遇到阻力时，轻微调整显微镊子以穿过右内叶Glisson囊的表面。用8-0丝线结扎左外侧支和中支的门静脉。结扎成功可通过肝中叶内缺血分界线观察到，左叶呈现苍白。 接下来，解剖尾状叶。用棉签填充主门静脉与尾状叶之间的潜在间隙。剥离尾状叶的腹膜，以显露该叶的门静脉分支。用缝合线结扎尾状支，确保针道充分包绕尾状支。使用电凝笔沿肝脏中叶分界线进行肝组织横断，在分界线上预先切出一条0.5毫米的切口线。借助一对显微镊子和电凝笔，切开肝组织。用棉签擦拭出血部位。最后切除胆囊，因其可作为横断过程中的良好牵引点。使用棉签施加可控压力以实现止血。完成横断和胆囊切除术后，小心地将小肠放回腹腔内。使用6-0可吸收缝线缝合腹膜和腹壁。对皮肤表面进行消毒，然后皮下注射芬太尼和美洛昔康与生理盐水的混合液，以缓解术后疼痛。将小鼠置于恒温垫上以促进苏醒。待其恢复意识后，转移至单独的笼具中。术后24小时内，皮下注射美托咪啶。接受ALPPS的小鼠表现出更高的细胞增殖倾向。ALPPS小鼠的炎症标志物，特别是白细胞介素-6，高于PVL组小鼠的水平。

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