Name: 果 蝇 幼虫脑和细胞系的Poly A尾长测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解使用GI-tailing方法测量果蝇神经系统中特定基因poly-A尾长的技术。该方法可分析Dscam等稀有转录本，揭示神经发育中独特的mRNA调控机制。

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本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目R01NS116463（资助对象：J.K.）以及内华达大学里诺分校的细胞与分子成像核心设施支持，该核心设施由美国国立卫生研究院资助项目P20GM103650支持，并用于本研究所报告的科研工作。

1. 饲养与筛选 果蝇 幼虫
<ol>
	<li>在25 °C的加湿培养箱中，将果蝇品系（w1118，野生型）维持/培养于标准果蝇培养基上。</li>
	<li>在产卵后72小时，挑选10只游走期3龄幼虫。</li>
	<li>将幼虫放入一个35 mm的空培养皿中，用镊子将幼虫转移至含有自来水的新培养皿中，轻轻清洗。重复此步骤2次，以去除残留的食物。</li>
</ol>
2. 从大脑中分离 果蝇 幼虫（图1)
<img alt="果蝇幼虫中枢神经系统解剖过程示意图，包含使用图钉、移液器、镊子和剪刀的步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1解剖 果蝇 3龄幼虫脑rd 幼虫游走期 (A示意图 果蝇 幼虫。B-G幼虫解剖。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>将10只幼虫置于含有冰冷PBS的解剖皿中。</li>
	<li>将幼虫背面向上放置（可通过沿体长方向分布的气管管识别），用解剖针固定其两端于皿底，随后在幼虫后端体壁上做一小切口。</li>
	<li>使用显微解剖剪沿背侧中线从前端方向剪开体壁。</li>
	<li>用巴斯德移液管在皿中以PBS冲洗幼虫体内3次，短暂冲洗以暴露脑组织。</li>
	<li>用镊子定位并轻轻提起脑组织，再使用显微解剖剪小心分离。</li>
	<li>将分离的脑组织转移至装有冰冷PBS并置于冰上的1.5 mL微量离心管中；收集所有幼虫的脑组织。随后按照第4节所述方法，使用RNA微量提取试剂盒进行RNA提取。 
	注意：应在15分钟内完成10只幼虫的解剖，以防止组织损伤和RNA降解。</li>
</ol>
3. Drosophila S2 Schneider 细胞
<ol>
	<li>培养 果蝇 S2 细胞在 果蝇 添加10%胎牛血清（FBS）的Schneider培养基 25 °C 在湿润的培养箱中培养至密度为 8 × 106 至 10 × 106 细胞/mL，存活率不低于90%。</li>
	<li>在50 mL无菌圆锥形管中，将细胞稀释至2.5 × 106 细胞/mL，使用Schneider's 果蝇 含10% FBS且预热至37°C的培养基 25 °C.</li>
	<li>将8 mL细胞悬液（20 × 106 将细胞接种至100 mm培养皿中，加入4 mL培养基，使总体积达到12 mL（第1天）。</li>
	<li>将培养的细胞置于培养箱中孵育 25 °C 在湿润的培养箱中。 
	注意：细胞在培养 12–16 小时后（第 2 天）与培养板的黏附较为松散。</li>
	<li>将适当的DNA质粒转染入细胞中24.</li>
	<li>在湿润的培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>孵育后，加入5 mL预冷的PBS，轻轻吹打收集细胞（第4天）。</li>
	<li>将细胞转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>通过在 1,000 × g 离心沉淀细胞 g 5 分钟 4 °C.</li>
	<li>用预冷的 PBS 轻柔吹打洗涤细胞 2 次，通过在 1,000 × g 5 分钟 4 °C.</li>
	<li>使用RNA小量提取试剂盒进行RNA提取。 
	注意：以下步骤均需在无菌超净工作台内进行。</li>
</ol>
4. 从 Drosophila 幼虫脑组织和S2细胞中提取总RNA
<ol>
	<li>幼虫脑 通过短暂离心去除 PBS（5,000 × g，8 秒短时离心） g).</li>
	<li>添加 600 µL 加入RNA裂解缓冲液，用塑料研磨棒匀质化10次。在体视显微镜下目视检查试管，确保完全裂解。</li>
	<li>在 1,000 × g 5 分钟 4 °C 以去除组织碎片。将澄清的上清液转移至无核酸酶的微量离心管中。</li>
	<li>使用RNA微量提取试剂盒，按照制造商说明书提取RNA。 
	注意：由于幼虫脑样本中的RNA含量极少，使用RNA微量提取试剂盒对这些样本至关重要。</li>
	<li>S2细胞： 移除 PBS，并根据制造商说明书提取 RNA。</li>
	<li>通过分光光度法和琼脂糖凝胶电泳测定RNA产量和质量。
	<ol>
		<li>通过测量提取的RNA在A处的光密度来确定其纯度和浓度260 nm 和 A280 nm，分别。确保A260 nm/A280 nm 比值 ≥2.0 且 RNA 浓度为 &gt;350 ng/µL 用于下游应用。 
		注意：从10个样本中提取RNA的典型产量为 果蝇 幼虫大脑的含量约为500-800 ng/µL 或 2.5-4 µg 在 5 µL对于S2细胞，产量约为2-3 µg/µL (15-30 µg 在 15 µL). 分离得到的 RNA 可在 -80 °C 用于长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. RNA 凝胶的制备与电泳
<ol>
	<li>1.5% 变性 RNA 凝胶（100 mL） 
	注意：甲醛可通过皮肤接触和吸入蒸气产生毒性；操作时应在化学通风橱中进行。
	<ol>
		<li>将三片琼脂糖片剂（1.5 g）溶解于 82 mL MOPS 缓冲液（补充文件 1）中，直至片剂完全崩解形成细小颗粒。</li>
		<li>将琼脂糖悬液在微波炉中加热至溶液澄清，确保所有颗粒完全溶解。</li>
		<li>将溶液冷却至约 60 °C。</li>
		<li>加入 18 mL 37% 甲醛，轻轻旋转混匀。将溶液倒入制胶板中，并在通风橱中静置使其凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 样本制备与电泳
	<ol>
		<li>将 RNA 样本稀释至 200 ng（5 µL），并加入 5 µL 2x RNA 上样染料。</li>
		<li>在干式恒温仪中于 70 °C 加热样本 5 分钟。</li>
		<li>在第一泳道加入 2 µL RNA ladders，相邻泳道各加入 10 µL 样本。</li>
		<li>在 MOPS 缓冲液中以 100 V 电压对 5 × 6 cm 凝胶进行电泳 60 分钟。 
		注意：根据扩增片段大小调整电泳条件。</li>
		<li>在紫外透射仪上观察凝胶。 
		注意：出现一条大小约为 600 个核苷酸的单一条带表明 RNA 制备完整（见 图 2A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 多聚(A)尾长度测定
<img alt="用于cDNA分析的多聚腺苷酸尾化过程示意图及毛细管凝胶电泳。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：RNA样品制备及多聚腺苷酸尾检测。（A）RNA凝胶图像显示来自黑腹果蝇（Drosophila）幼虫脑（左侧）和S2细胞（右侧）的总RNA，在1.5%甲醛琼脂糖凝胶上分离。泳道M显示单链RNA标记物的大小（以核苷酸计）。注意在约600 nt处出现一条主要的RNA条带，来源于rRNA。（B）多聚腺苷酸尾检测示意图。缩写：G/I = 鸟苷/肌苷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>GI加尾（图2B）
	<ol>
		<li>将试剂保持在冰上，配制以下混合液（20 µL）：最多14 µL总RNA样品（1 µg）、4 µL 5x加尾缓冲液混合物和2 µL 10x加尾酶混合物。</li>
		<li>在热循环仪中37 °C孵育60分钟。</li>
		<li>加入1.5 µL加尾终止溶液，冰上放置2分钟。 
		注意：可立即进行逆转录，或在-80 °C保存GI加尾后的RNA样品，待进行逆转录时再使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录与PCR扩增
	<ol>
		<li>按照补充文件1中所述条件，配制混合液并进行孵育以合成cDNA。</li>
		<li>稀释cDNA样品，并按照补充文件1中的说明进行PCR扩增DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物
<ol>
	<li>取步骤 6.2.2 中的少量 PCR 产物（2-5 µL），在 2.5% 琼脂糖凝胶中以 100 V 电泳 45 分钟，进行质量控制分析。</li>
	<li>通过测序从凝胶中回收的 PCR 条带，验证基因特异性及接头特异性反应的 PCR 特异性。</li>
</ol>
8. 毛细管电泳
<ol>
	<li>使用生物分析仪配合高灵敏度DNA试剂盒，对基因特异性PCR和多聚腺苷酸特异性PCR的1 µL扩增产物（0.5–5 ng/µL）进行高分辨率凝胶电泳。观察是否出现分辨清晰的峰，以判断实验是否成功。</li>
</ol>
9. 数据分析：多聚(A)尾长度测定（图3）
<img alt="电泳图谱分析流程图；峰和弥散信号分析；数据导出过程；实验室数据工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：Poly(A) 尾长度和峰值得测量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>访问数据
	<ol>
		<li>要访问数据，请在软件中打开 xad 文件。</li>
		<li>在树状视图面板中选择样本名称或梯度标记。 
		注意：这将显示所选样本的电泳图谱或类似凝胶的图像。下端标记为35个碱基对（bp），上端标记为10,380 bp，这些是用于将梯度数据（50–7,000 bp）与样本孔数据对齐的内参标准。</li>
		<li>放大或缩小电泳图谱和类似凝胶的图像以显示细节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行峰形和弥散信号分析
	<ol>
		<li>要获取峰的大小，请打开选定样本的电泳图谱。</li>
		<li>右键单击电泳图谱并选择手动积分，通过拖动水平线手动选择峰。</li>
		<li>在峰表中观察峰的数值。识别出峰高最大的峰，该峰代表单个样本的poly(A)尾长度。在所示示例中，其值为346 bp。</li>
		<li>启用顶部菜单中的显示/隐藏设定点图标，并等待右侧弹出一个新面板。</li>
		<li>选择高级，向下滚动找到执行弥散信号分析，并勾选该复选框。这将在电泳图谱标签页中添加区域表。</li>
		<li>从一个样本的电泳图谱中选择，并进入区域表，该表显示起始 [bp]和终止 [bp]菜单。要设置起始和终止 [bp]，请在电泳图谱上右键单击并选择区域以添加添加区域。</li>
		<li>在区域表中的任意单元格上右键单击，选择修改区域，将弹出一个小窗口，可在其中自定义设置区域。 
		注意：例如，我们为GAPDH设置了300 bp至550 bp的区域。基因特异性的GAPDH PCR扩增产物峰位于265 bp处。通用引物（表1）通过与G/I尾RNA退火，使poly(A) PCR产物长度增加35 bp。因此，GAPDH RNA上的第一个腺嘌呤核苷酸起始于300 bp（265 + 35）。我们任意设定poly(A)尾的最大长度为250 bp（300 + 250 = 550）。根据区域表，程序返回该区域内的平均大小为387 bp。</li>
		<li>使用公式（1）计算目标mRNA上的poly(A)尾长度： 
		poly(A)尾长度 = (A - B - 35) （1） 
		其中A为电泳图谱中poly(A)特异性PCR产物的平均bp值（例如GAPDH为387 bp），B为电泳图谱中基因特异性PCR产物的峰bp值（例如GAPDH为265 bp），“35”为通用反转录引物标签的长度。 
		注意：根据上述计算，GAPDH的平均poly(A)尾长度为387 - 265 - 35 = 87 bp。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 可视化 poly(A) 尾长度分布
<ol>
	<li>通过文件 | 导出 | 样本数据将数据导出为 csv 文件，以获取样本数据。 
	注意：导出的 csv 文件在 X 轴上显示的是运行时间，而非bp。</li>
	<li>进入某个样本的电泳图，在电泳图选项卡中勾选显示片段大小，以自动将区域表中的数据从bp转换为运行时间。在本示例中，70.39 s 至 86.28 s 对应于 300 bp 至 550 bp。</li>
	<li>打开 csv 文件，选择运行时间从70.39 s到86.28 s的数值以生成图表。为了在图表的 X 轴上显示 bp 大小，可将包含 bp 大小的电泳图导出为图像文件，并将其叠加在电子表格生成的图表上，从而准确匹配 poly(A) 尾长度分布中的 bp 大小。</li>
</ol>

Quantifying the Poly(A) Length of Genes from the Drosophila Nervous System

<ol><li>Stewart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylation+and+nuclear+export+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polyadenylation and nuclear export of mRNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).</li>
<li>Machida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+of+poly%28A%29-binding+protein+with+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).</li>
<li>Eisen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+cytoplasmic+mRNA+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism.</a> Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).</li>
<li>Liudkovska, V., Dziembowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+RNA+tailing+by+metazoan+terminal+nucleotidyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622(2021).</li>
<li>Goldstrohm, A. C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+deadenylase+complexes+diversify+mRNA+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).</li>
<li>Schmidt, M. J., Norbury, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylation+and+beyond%3A+emerging+roles+for+noncanonical+poly%28A%29+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases.</a> Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).</li>
<li>Laishram, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28A%29+polymerase+%28PAP%29+diversity+in+gene+expression+-+Star-PAP+vs+canonical+PAP%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP.</a> FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).</li>
<li>Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+initiation+of+Drosophila+development+by+regulated+polyadenylation+of+maternal+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs.</a> Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).</li>
<li>Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanos+and+pumilio+establish+embryonic+polarity+in+Drosophila+by+promoting+posterior+deadenylation+of+hunchback+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA.</a> Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).</li>
<li>Passmore, L. A., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mRNA+poly%28A%29+tails+in+regulation+of+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).</li>
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<li>Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAM-seq%3A+Full-length+mRNA+sequencing+reveals+principles+of+poly%28A%29+tail+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control.</a> Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).</li>
<li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+regulates+Dscam+expression+through+a+noncanonical+function+of+the+cytoplasmic+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein.</a> Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).</li>
<li>Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insects%27+RNA+profiling+reveals+absence+of+%26%2334%3Bhidden+break%26%2334%3B+in+28S+ribosomal+RNA+molecule+of+onion+thrips%2C+Thrips+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Insects' RNA profiling reveals absence of &#34;hidden break&#34; in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci.</a> Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294(2015).</li>
<li>Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+in+the+nervous+system%3A+to+what+lengths+will+3%27+UTR+extensions+take+us%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us.</a> Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).</li>
<li>Sement, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Uridylation+prevents+3%27+trimming+of+oligoadenylated+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了从徘徊期3rd 龄幼虫阶段解剖Drosophila幼虫脑组织的技术，以及从Drosophila S2细胞进行样品制备的方法。由于mRNA具有不稳定性，样品收集过程需要格外谨慎。在幼虫脑组织解剖过程中，应避免在分离时损伤脑组织，并且组织不应长时间保存在溶液中。每次解剖操作时间应控制在8–10分钟内。此外，在解剖液中添加RNase抑制剂可能有助于保护RNA完整性。对于S2细胞的培养与转染操作，所有步骤均应在超净工作台内进行。
RNA 提取步骤需要额外注意。我们建议使用经过 RNase 去除溶液预处理的层流式洁净工作空间。除了 RNA 产量外，还必须检测 RNA 的完整性，以确保样本在解剖和提取过程中未发生降解。RNA 完整性可通过变性琼脂糖凝胶电泳进行可视化分析。Drosophila 的总 RNA 呈现单一的条带模式，因为其 28S rRNA 会解离成两个大小相等的亚基，与 18S rRNA 共迁移25。当使用单链 RNA ladder 时，可观察到一条大小约为 600 个核苷酸的单一主条带（图 2A）。
分离的RNA样本进行G/I加尾处理（图2B）。利用酵母多聚腺苷酸聚合酶（PAP）17在RNA的3′端添加鸟苷和肌苷残基，从而保护RNA的3′端免受酶降解。新合成的带有G/I标签保护的全长RNA通过通用反向引物（3′端标记的C10T2）进行逆转录，获得cDNA样本。随后使用位于多聚腺苷酸化位点上游的基因特异性正向/反向引物进行PCR扩增，产生一条清晰的条带。而使用基因特异性正向引物与通用反向引物进行的PCR反应则生成长度不一的DNA分子，在凝胶电泳中表现为弥散条带（smear），反映出多聚(A)尾长度的异质性。PCR产物随后通过毛细管凝胶电泳进行分析。
设计引物时需要注意，基因特异性正向/反向引物的扩增片段长度应在50-300 bp范围内。测试多个正向引物有助于找到最适合用于评估poly(A)尾长度的引物。我们建议将反向引物设计在预测的poly(A)起始位点上游附近，这样可以方便地直接计算poly(A)尾的长度。进行PCR反应时，必须设置“无逆转录酶对照”以排除基因组DNA污染导致的扩增。强烈建议通过退火温度梯度实验对PCR条件进行优化。鉴于本方法的特点，在分析发生可变多聚腺苷酸化的mRNA分子的poly(A)尾长度时需要额外考虑。例如，许多基因会经历可变多聚腺苷酸化，从而产生不同的3'非翻译区（3'UTR）亚型26。我们建议使用不同的PCR引物组分别研究各个3'UTR亚型。
我们强烈建议在每次毛细管凝胶电泳运行中均包含基因特异性的PCR产物，因为每次运行中可能存在几个核苷酸的迁移差异。在计算poly(A)尾长度时，必须使用基因特异性PCR产物的实际碱基对大小，而非理论大小。
一些RNA会经历额外的转录后修饰，包括末端尿苷酸化27。当mRNA发生尿苷酸化时，G/I加尾法可能不适用于测量poly(A)尾的长度。这是因为通用反向引物可能无法有效扩增在3'端含有非腺嘌呤核苷酸的mRNA分子。G/I加尾法是一种基于PCR的方法，可能会因更高效地扩增较短片段而引入不必要的偏差。因此，使用者在解读结果时应谨慎。
通过本文介绍的方法，我们证明了G/I加尾技术可有效用于检测果蝇（Drosophila）神经系统及S2细胞中的poly(A)尾长度。当与毛细管电泳联用时，该方法具有高度定量性。尽管高通量分析可实现全局性的poly(A)尾分析，但低通量的基于PCR的G/I加尾方法在单转录本分析、预实验以及对其他方法的验证中仍具有重要价值。总之，方法的选择取决于具体的研究问题和目标。研究人员应根据实验需求和资源条件，选择最适合的方法。

大多数真核生物mRNA在细胞核内由经典的多聚腺苷酸聚合酶（poly(A)聚合酶）在其3′末端通过添加非模板依赖的腺苷酸进行转录后多聚腺苷酸化。完整的poly(A)尾在mRNA的整个生命周期中至关重要，因其对mRNA的核输出必不可少1，可促进与poly(A)结合蛋白的相互作用从而增强翻译效率2，并赋予mRNA抵抗降解的能力3。在某些情况下，poly(A)尾还可由非经典的poly(A)聚合酶介导在细胞质中进一步延长4。在细胞质中，poly(A)尾的长度动态变化，并影响mRNA分子的寿命。目前已知多种聚合酶和去腺苷酸化酶参与调控poly(A)尾的长度5,6,7。例如，poly(A)尾的缩短与翻译抑制相关，而poly(A)尾的延长则增强翻译活性8,9。
越来越多的基因组学研究揭示了poly(A)尾长度在真核生物多个生物学过程中的基础性作用，包括生殖细胞发育、早期胚胎发育、学习与记忆相关的神经元突触可塑性以及炎症反应10。目前已有多种方法和检测技术被开发用于测量poly(A)尾长度。例如，RNase H/oligo(dT)检测法利用RNase H在有或无oligo(dT)存在的情况下分析poly(A)尾长度11,12。其他研究poly(A)尾的方法包括针对3'末端的PCR扩增技术，如cDNA末端快速扩增poly(A)检测法（RACE-PAT）12,13和连接酶介导的poly(A)检测法（LM-PAT）14。对PAT检测法的进一步改进包括ePAT15和sPAT16。在3'末端进行酶促G加尾17,18或G/I加尾&#160;是PAT检测法的其他变体。这些技术的进一步优化还包括使用荧光标记引物结合毛细管凝胶电泳进行高分辨率分析，该方法被称为高分辨率poly(A)检测法（Hire-PAT）19。这些基于PCR的检测方法可实现快速且高灵敏度的poly(A)长度定量。
随着下一代测序技术的发展，诸如PAL-seq20和TAIL-seq21等高通量测序方法能够实现转录组范围内的多聚腺苷酸化分析。然而，这些方法仅能提供36–51个核苷酸的短测序读长。因此，FLAM-Seq22被开发用于全长mRNA的全局性尾部长度分析，并可产生长读长序列。Nanopore技术23可实现无需PCR扩增的直接RNA或直接cDNA测序，用于多聚(A)尾长度的估算。然而，这些高通量方法也存在局限性：它们需要大量的起始材料，成本高昂且耗时较长。此外，利用高通量方法分析稀有转录本极具挑战性，而在需要分析少量转录本、进行预实验或验证其他方法时，低通量的基于PCR的方法仍具有优势。
我们最近的研究表明，Dscam1 mRNA 在 Drosophila 中具有较短的 poly(A) 尾巴，这需要细胞质 poly(A) 结合蛋白通过 G/I 尾巴法在 Dscam1 3'非翻译区（3'UTR）上进行非常规结合24。本文中，我们提供了一种简化的组织制备流程，并介绍了从 Drosophila 神经系统和 Drosophila S2 细胞中定量 mRNA poly(A) 长度的方法。

<table><tbody><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)</td><td>Research Product Internation (RPI)</td><td>M92020</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 DNA 检测试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 软件 2100 Expert 免费下载试用版</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259</td></tr><tr><td>Apex 100 bp-低分子量 DNA 标准 Marker</td><td>Genesee Scientific</td><td>19-109</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯 (DEPC)</td><td>Research Product Internation (RPI)&amp;nbsp;</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>DNA 染料（紫色上样缓冲液 (6x)）</td><td>New England biolabs&amp;nbsp;</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila &lt;/em&gt;S2 细胞系</td><td>Drosophila Genomics Resource Center 货号 #181</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Schneider&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Genesee scientific&amp;nbsp;</td><td>20-276</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>镊子 Dumont 5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fine Science tools&amp;nbsp;</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Research Product Internation (RPI)&amp;nbsp;</td><td>P32200</td><td></td></tr><tr><td>多聚(A)尾长度检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>764551KT</td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler 低分子量 RNA 标准 Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SM1833</td><td></td></tr><tr><td>RNA 上样缓冲液 (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNA 微量提取试剂盒</td><td>Zymoresearch&amp;nbsp;</td><td>R1050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA 小量提取试剂盒</td><td>Zymoresearch&amp;nbsp;</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>剪刀 - Vannas 弹簧剪 - 2.5 mm 刃口</td><td>Fine Science tools&amp;nbsp;</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>TopVision 琼脂糖片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R2802</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸-EDTA (TAE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

从 poly a 尾长度的测量 果蝇 幼虫大脑与细胞系

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

多聚腺苷酸化是一种关键的转录后修饰过程，可在mRNA分子的3'端添加多聚(A)尾。多聚(A)尾的长度受到细胞过程的严格调控。mRNA多聚腺苷酸化的失调与异常基因表达以及多种疾病相关，包括癌症、神经系统疾病和发育异常。因此，理解多聚腺苷酸化的动态变化对于揭示mRNA加工和转录后基因调控的复杂性至关重要。
本文介绍了一种用于测定从RNA样本中分离出的poly(A)尾长度的方法 果蝇 幼虫大脑和 黑腹果蝇 Schneider S2 细胞。我们采用了鸟苷酸/肌苷酸（G/I）加尾法，该方法利用酵母多聚腺苷酸聚合酶在 mRNA 的 3' 端酶促添加 G/I 残基。这一修饰可保护 RNA 的 3' 端免受酶解降解。随后使用通用反义引物对具有完整长度多聚(A)尾的 RNA 进行逆转录。接着，采用针对目的基因的基因特异性寡核苷酸与用于逆转录的通用序列寡核苷酸进行 PCR 扩增。 
这将扩增出包含目的基因多聚腺苷酸尾的PCR产物。由于多聚腺苷酸化并非均一的修饰过程，会产生长度不同的尾部结构，因此PCR产物具有多种大小，从而在琼脂糖凝胶电泳中呈现弥散条带模式。最后，对PCR产物进行高分辨率毛细管凝胶电泳分析，并根据多聚腺苷酸尾PCR产物与基因特异性PCR产物的大小进行定量。该技术为分析多聚腺苷酸尾长度提供了一种简单且可靠的工具，有助于我们更深入地理解mRNA调控的复杂机制。

在此，我们分析了 poly(A) 尾的长度 Dscam1 和 GAPDH 从 果蝇 幼虫大脑（图4). 分离的RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。在约600个核苷酸大小处出现单一RNA条带，表明RNA样品完整图 2A）。RNA经过G/I加尾处理，并使用Agilent 2100生物分析仪进行高分辨率毛细管电泳。利用Agilent 2100 Expert软件导出凝胶图像，并进行相应拼接。来自PCR的产物 GAPDH 和 Dscam1 特异性基因引物对显示出清晰的单一条带，而基因特异性引物与通用引物组合则呈现出明显的弥散条带模式（图4A 和 表1），表明 poly(A) 长度存在差异 GAPDH 和 Dscam1 mRNAs。在 图4B，采用涂片分析法获取GAPDH和Dscam1的平均poly(A)尾长度。电泳图谱被导出并调整以表示poly(A)尾长度（图4C).
类似地，我们对S2细胞进行了poly(A)尾长度分析（图5）。为了确定……的作用 Dscam1 3'非翻译区在缩短poly(A)尾中的作用，将含有DNA质粒转染至S2细胞中 Dscam1 编码区，可选择以下任一方式 SV40 3'非翻译区或 Dscam1 3'非翻译区。最小 SV40 3'非翻译区被选为控制元件 Dscam1 3'非翻译区，因为SV40 3'UTR已被广泛用作重组DNA质粒的最小转录终止和多聚腺苷酸化信号。提取总RNA后进行逆转录PCR、G/I加尾及高分辨率毛细管电泳图5）。结果显示，来自 poly(A) 尾长度分布 SV40 3'UTR 质粒呈现出与内源基因相似的模式 GAPDH 而 poly(A) 尾长度分布来自 Dscam1 3'UTR 质粒呈现出与内源基因相似的模式 Dscam1 幼虫脑组织中的 mRNA
<img alt="电泳凝胶分析，GAPDH 与 Dscam1，poly(A) 长度；柱状图和荧光图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：幼虫脑组织中 GAPDH 和 Dscam1 的 poly(A) 尾长度测定。（A）毛细管凝胶电泳将基因特异性 PCR 产物分离为离散条带（第一和第二泳道），分别对应 GAPDH2 和 Dscam1。使用通用反向引物进行 PCR 扩增时，产物呈现弥散条带分布（第三和第四泳道）。* 表示非特异性条带。（B）通过弥散条带分析计算平均 poly(A) 尾长度。（C）根据导出的 csv 文件重建 poly(A) 尾长度分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析Poly(A)尾长度的电泳结果；条形图和线形图显示荧光强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：转染Dscam1 DNA质粒的Poly(A)尾长度测定。 培养的Drosophila S2细胞共转染含有Dscam1编码区以及Dscam1或SV40的3′非翻译区（3′UTR）的Dscam1构建体。(A) 毛细管凝胶电泳图像显示了基因特异性PCR产物，对于SV40（Dscam1-SV40 3'UTR）和Dscam1（Dscam1-Dscam1 3'UTR）分别呈现为离散条带（第一和第二泳道）。使用通用反向引物扩增的PCR产物则呈现弥散条带模式（第三和第四泳道）。* 非特异性条带。(B) 平均Poly(A)尾长度通过弥散条带分析计算得出。(C) Poly(A)尾长度分布由导出的csv文件重建。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dscam1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上游引物 (5’-3’) CGCAGCCACAACAATTGAATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>下游引物 (5’-3’) AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上游引物 (5’-3’) CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>下游引物 (5’-3’) TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上游引物 (5’-3’) CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>下游引物 (5’-3’) AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>通用下游引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>下游引物 (5’-3’) GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCCCTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本方案中使用的引物。
补充文件 1：溶液成分与 PCR 设置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116_JOVE_Supp%20FIle%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

该方案描述了一种高效且可靠的方法，用于定量分析目的基因的 poly(A) 尾长度 果蝇 神经系统，可轻松适用于其他物种的组织或细胞类型。

从 poly A 尾长度的测量 果蝇 幼虫大脑与细胞系

多聚腺苷酸化是一种关键的转录后修饰，可在mRNA分子的3'端添加多聚(A)尾。多聚(A)尾的长度是……

多聚腺苷酸化是一种转录后修饰，可在mRNA分子的3'端添加多聚A尾。多聚腺苷酸化的失调与异常基因表达及多种疾病相关，包括神经系统疾病。我们的方法提供了一种经济高效、高分辨率的分析手段，用于测量 poly-A 尾巴长度。用于 poly-A 尾巴分析的高通量方法，如下一代测序以及高通量测序，可提供丰富的信息。然而，利用这些方法分析稀有转录本极具挑战性。基于PCR的方法通常通量较低，但可轻松用于分析少量转录本。GI加尾法便是其中之一。通过该方法，我们发现 Dscam mRNA 含有较短的 poly-A 尾巴。Dscam 是一种神经元细胞黏附分子，参与多种重要的神经发育过程。由于Dscam mRNA与其他大多数mRNA不同，含有较短的poly-A尾，因此其翻译受到独特的基因调控，这也是我们试图回答的问题之一。

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JoVE Journal

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