Name: 使用光学相干弹性成像量化环境生物膜的弹性特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 了解光学相干弹性成像技术如何量化环境生物膜的弹性特性。该方法可测量杨氏模量，为生物膜管理策略提供关键数据支持。

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作者感谢美国伊利诺伊州罗克福德的Aqua-Aerobic Systems, Inc.公司提供了本研究中所用的颗粒状生物膜。作者同时感谢美国国家科学基金会通过资助编号#210047和#193729提供的支持。

1. 系统设置
<ol>
	<li>收集系统组件，包括商用OCT系统（主机、支架、成像头和计算机）、波形发生器、换能器、延迟/脉冲发生器、带BNC接口的开关、BNC电缆和适配器、光学支架及夹具。</li>
	<li>将函数发生器的同步信号连接至开关，再将开关的另一端口连接至延迟发生器。</li>
	<li>将函数发生器的输出端连接至换能器引线。</li>
	<li>将延迟发生器的输出端连接至OCT主机背面的触发通道。延迟发生器输出的信号为触发脉冲，用于启动OCT系统中扫描光学元件的运动。</li>
	<li>开启系统各组件（OCT主机、计算机、函数发生器和延迟发生器），并启动OCT软件。</li>
	<li>设置延迟发生器，向OCT主机发送晶体管-晶体管逻辑（TTL）触发信号。触发信号的具体要求请参考OCT系统使用手册。</li>
	<li>将换能器置于OCT镜头下方。换能器一端粘附有3D打印的楔形尖端，作为弹性波的线源。</li>
</ol>
2. 图像采集
<ol>
	<li>在OCT软件中，选择多普勒采集模式，并启用外部触发。</li>
	<li>将颗粒状生物膜置于样品台上的透镜下方，并通过平移台将其移至换能器尖端处。确保换能器与样品表面轻柔接触，如图2所示。本研究使用了两种不同标称直径（4.3 mm和3.3 mm）的颗粒状生物膜（也称为颗粒污泥），以探究生物膜尺寸对其力学性能的影响。这些样品为商业获取。 
	注意：本研究所用的样品台由带有多个半球形凹槽的3D打印塑料板构成。该样品台无法实现原位条件下的测量，因此在测量过程中需引入自然环境中的水，以防止样品干燥。</li>
	<li>在样品监视窗口中，通过点击感兴趣线的起点与终点（即波传播路径）来设定扫描区域。使该线段与换能器尖端对齐，并确保其与尖端边缘垂直。</li>
	<li>设定扫描区域内的像素数量和样品深度，并增加所记录的B扫描（二维横截面图像）数量，以提高OCE图像的信噪比。本文结果采用沿扫描路径1523个像素、深度方向1024个像素的设置，共采集50帧B扫描图像。</li>
	<li>点击扫描 按钮并打开开关。此时OCT和OCE图像应出现在屏幕上。需在触发超时时间和扫描准备时间内激活开关。</li>
	<li>确保参考光强处于最佳范围内，并将样品置于OCT显微镜物镜的焦区位置。正确聚焦的样品，其顶部边缘应接近图像的上边缘。</li>
	<li>通过增加左侧色标条的上限值并降低右侧色标条的下限值，调节显示工具栏中OCE图像的相位等高线，以增强条纹对比度。</li>
	<li>按下前面板上的正弦 按钮，配置函数发生器输出单一频率的正弦电压，并设定测量的起始激励频率。本研究的测量频率范围从4 kHz开始，至9.6 kHz结束。&#160;按下Output键以启用输出端口。</li>
	<li>设定适用于测量的合适电压值。该值应使条纹可见度最大化，同时避免相位卷绕。对于本研究中的生物膜及测量频率范围，通常5至10 V的电压可获得具有良好对比度的相位图。</li>
	<li>点击记录 按钮，采集OCT和OCE图像。</li>
	<li>在不同频率下重复测量，以获得具有不同波长（或条纹周期）的弹性波场横截面图像。</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>获取像素的物理尺寸。x 方向的物理像素尺寸通过将 x 方向的视场除以 x 方向的图像尺寸，再乘以因子 2 得到。&#160;z 方向的物理像素尺寸通过将 z 方向的视场除以 z 方向的图像尺寸得到。视场和图像尺寸的数值存储在结构数组中，该数组包含图像信息，可通过 ThorImageOCT 软件包中 MATLAB SDK 提供的 OCTFileOpen 函数访问。</li>
	<li>分别使用 OCTFileGetIntensity 和 OCTFileGetPhase 函数获取 OCT 和 OCE 矩阵，并对记录的帧取平均值。这些函数在 ThorImageOCT 软件包的 MATLAB SDK 中提供。</li>
	<li>通过对图像进行二值化处理，并从上到下检测每一列中的白色像素，获取样品上边缘的像素位置。</li>
	<li>使用 improfile 函数提取 OCE 图像沿该边缘的相位分布，并计算实际尺寸下的累积弧长。通过取连续点在 x 和 z 方向上缩放后差值的模的累积和来计算弧长。</li>
	<li>利用 plomb 函数，对测得的 OCT 相位分布（即来自 OCE 图像）相对于累积弧长进行空间快速傅里叶变换。</li>
	<li>确定频谱中峰值的位置。该位置代表波的空间频率。通过换能器激励频率（单位为 Hz）与空间频率（单位为长度的倒数）的比值计算波速（或相速度）。</li>
</ol>

Rapid and Non-Destructive Characterization of Biofilm Elastic Properties

<ol><li>Mahto, K. U., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilm+and+extracellular+polymeric+substances+in+the+moving+bed+biofilm+reactor+for+wastewater+treatment%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour+Technol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review.</a> Bioresour Technol. 345, 126476(2022).</li>
<li>Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+study+of+the+effect+of+operating+variables+on+reactor+performance+and+microbial+diversity+in+laboratory-scale+activated+sludge+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors.</a> Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).</li>
<li>Briones, A., Raskin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+dynamics+of+microbial+communities+in+engineered+environments+and+their+implications+for+process+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability.</a> Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).</li>
<li>Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+sorption+and+biodegradation+in+the+removal+of+organic+micropollutants+by+membrane+aerated+biofilm+reactor+%28MABR%29+with+different+biofilm+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness.</a> Water Res. 236, 119935(2023).</li>
<li>Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anaerobic+granular+sludge+using+a+rheological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach.</a> Water Res. 106, 116-125 (2016).</li>
<li>Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rheological+approach+to+analyze+aerobic+granular+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">A rheological approach to analyze aerobic granular sludge.</a> Water Res. 50, 171-178 (2014).</li>
<li>Lin, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructure+of+anammox+granules+and+mechanisms+endowing+their+intensity+revealed+by+microscopic+inspection+and+rheometry%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry.</a> Water Res. 120, 22-31 (2017).</li>
<li>Liou, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+mechanical+characterization+of+granular+biofilms+by+optical+coherence+elastography+measurements+of+circumferential+elastic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves.</a> Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).</li>
<li>Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+viscoelastic+properties+of+granular+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Layered viscoelastic properties of granular biofilms.</a> Water Res. 202, 117394(2021).</li>
<li>Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+elastic+properties+of+skin+by+measuring+surface+waves+from+an+impulse+mechanical+stimulus+using+phase-sensitive+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography.</a> J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).</li>
<li>Ramier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+shear+modulus+of+the+human+cornea+using+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography.</a> Sci Rep. 10, 17366(2020).</li>
<li>Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+wave+speed%2C+dispersion%2C+and+viscoelastic+modulus+of+cornea+using+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography.</a> Optics Express. 27 (12), 16635(2019).</li>
<li>Crespo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+determination+of+human+corneal+elastic+modulus+using+vibrational+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea+Ext+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography.</a> Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).</li>
<li>Ambrozinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+micro-tapping+for+non-contact+4D+imaging+of+tissue+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity.</a> Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).</li>
<li>Pitre, J. J. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nearly-incompressible+transverse+isotropy+%28NITI%29+of+cornea+elasticity%3A+model+and+experiments+with+acoustic+micro-tapping+OCE%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE.</a> Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).</li>
<li>Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+human+corneal+shear+wave+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Optom+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography.</a> Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).</li>
<li>Rosenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+pore+size+and+connectivity+in+a+thick+mixed-cultured+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm.</a> Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).</li>
<li>Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondestructive+characterization+of+soft+materials+and+biofilms+by+measurement+of+guided+elastic+wave+propagation+using+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography.</a> Soft Matter. 15, 575-586 (2019).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

OCT 系统中可达到的成像深度由光源的光穿透能力决定，而穿透能力取决于光源的波长。此外，波长还决定了轴向分辨率。较长的波长能够更深入地穿透样品，但与较短波长相比，其轴向分辨率会降低。横向&#160;分辨率则取决于系统的数值孔径和波长，较短波长可提供更高的分辨率。增大数值孔径会带来折衷，即限制了焦深29。空间分辨率受限于能够以足够信噪比检测到的最短弹性波波长。目前的 OCE 方法仅限于 0.5 mm9,30。尽管该技术受样品尺寸的限制，但它应适用于多种类型的生物膜。生物膜的形态，无论是颗粒状还是平坦状，均不会阻碍该技术的应用。样品的透明度也在决定穿透深度方面起着作用。高透明度的材料允许光完全穿过整个样品，使其难以被观察到；而不透明的样品则会阻碍光的穿透，导致其内部结构细节极少9,28。在本研究的背景下，毫米量级的穿透深度已足够。
这些测量的另一个可能问题是，在较大的样品中，由于样品尺寸不会限制弹性波的周期数，光学相干断层扫描（OCT）显微镜的视场（FOV）可能成为可测周期数的限制因素。本研究中的测量受限于9 mm × 9 mm的视场；因此，该OCT显微镜无法分辨波长大于9 mm的弹性波。采用视场更宽的镜头可实现对更大样品的成像，从而在较低频率下获得更多的干涉条纹。然而，在较高频率下也会出现挑战。对于本研究中的样品，当频率超过10 kHz时，波会经历显著的衰减，导致相位差分布的幅度减小，从而增加空间频率确定的难度。这一问题可通过提高函数发生器的电压来缓解，从而增大换能器的位移。然而，位移的增加仅在一定范围内有效，因为过大的位移最终会导致相位缠绕9。另一种方法是通过采用更高功率的光源来提高系统的灵敏度，以抵消大位移引起的相位缠绕，并促进对微弱激励下动态响应的检测。更高的灵敏度有助于实施声学OCE方法，这类方法具有非接触加载的优势，但更容易受到高衰减的影响31。
在对生物膜进行这些测量时，保持样品的湿润至关重要。干燥会导致刚度不必要地增加，而这与研究目的无关，因为重点是评估样品在其天然环境下的特性。我们未研究光照引起的干燥问题。然而，需要指出的是，在整个测量过程中，定期添加了来自自然环境的水，并在此期间通过OCT图像监测样品形态，未观察到形态发生明显变化。此外，在放置换能器和采集OCE图像时，必须考虑OCT图像中识别出的结构特征。沿波传播路径上的非均质性可能扭曲波场，因此应予以避免9。同时，与生物膜保持轻柔接触至关重要，因为过大的压力除了可能改变其力学特性外，还可能导致波场失真。最后，扫描区域必须与波阵面垂直，以确保能够从测量中准确确定谐波的空间频率。
对于某些频率，两个样品中的波速均观察到显著变化，这可归因于样品的内在非均质性、特定频率下的波场特性以及波传播路径的形态。我们此前已证明，由于微结构的非均质性，分段颗粒状生物膜中测得的波速分布呈现非均匀性9。因此，在颗粒状生物膜上应用该技术时，必须在样品多个位置进行测量，以获得具有代表性的平均结果。
关于色散曲线的一个重要观察结果是，它们在不同样本尺寸下表现出明显不同的行为。对于较大的样本，曲线在测量范围内保持相对恒定。然而，对于较小的样本，波速随频率增加而呈现上升趋势，尤其是在频率范围的较低部分更为显著。这一现象可归因于低频下黏弹性效应的存在以及弹性波导模式的产生。在之前的研究中，我们已通过更复杂的反演模型对这些效应进行了考虑8,9,18。
需要注意的是，在好氧颗粒污泥系统中，生物量在反应器高度方向上的分布并不均匀。在非曝气阶段，较大的颗粒倾向于沉降在反应器底部。这种不均匀的分布导致不同粒径的聚集体接触到的底物量存在差异，因此不同粒径的聚集体表现出不同的群落组成。此外，由于剩余污泥是选择性排出，较大的颗粒通常在反应器中保留更长时间，而较小的颗粒则更容易被去除32。杨氏模量的显著差异提示生物膜的组成、年龄与其机械性能之间可能存在关联。
综上所述，光学相干弹性成像（OCE）方法为评估生物膜中弹性波传播速度提供了一种快速且非破坏性的手段。该方法克服了流变学测量的局限性，并相较于其他弹性成像技术展现出更优的性能8,18。此外，该方法的应用范围不仅限于颗粒状生物膜，还可扩展至任何具有适当光学穿透深度且尺寸足够大以被系统分辨的部分透明样品，例如水凝胶33、角膜34和皮肤35。该方法未来的改进方向主要包括以下几个方面：首先，将谐波弹性波的频率提升至数百kHz范围，可实现数微米量级的波长，从而达到相近尺度的空间分辨率；其次，通过将OCT系统的光学功率从目前的2 mW提升至20 mW，以增强光学探测系统的信噪比；最后，将用非接触式的声辐射压力源替代现有的接触式谐波激励器。这一改进将实现无创、非破坏性操作，并允许在生物膜样本的原生环境中对其进行检测。

在废水处理和水资源回收中，附着生长反应器中的有益生物膜正被越来越多地用于促使微生物将有机物、氮和磷等不理想的污染物转化为易于从水中去除的稳定形态1。在这些系统中，生物膜表现出的功能（即生化转化）与其内部栖居微生物的多样性以及这些微生物所获得的营养物质密切相关2。因此，持续的生物膜生长可能对维持反应器功能的稳定性构成挑战，因为新生的生物膜可能改变其整体代谢过程、传质特性以及群落组成。尽可能稳定生物膜环境可防止此类变化的发生3。这包括确保营养物质的持续供应，并通过维持稳定的厚度来保持生物膜结构的稳定4。对生物膜的刚度和物理结构进行监测，将使研究人员能够深入了解生物膜的整体健康状况及其功能表现。
生物膜具有黏弹性特性5,6,7。这种黏弹性导致其在受到外部机械力作用时，会产生瞬时变形和缓慢的、与时间相关的变形。生物膜的一个独特之处在于，当其受到较大程度的形变时，其行为类似于黏性液体；相反，在受到微小形变时，其响应则类似于固体5。&#160;此外，在小形变区域内，存在一个形变范围，使得生物膜表现出线性的力-位移关系5,6,7。在此线性范围内的形变最适合用于评估生物膜的力学特性，因为可获得可重复的测量结果。已有多种技术可用于量化该范围内的弹性响应。光学相干弹性成像（OCE）是一种新兴技术，正被应用于分析生物膜在线性范围（应变数量级为10-4-10-5）内的力学行为8,9。
迄今为止，OCE 最成熟的应用是在生物医学领域，该技术已被用于表征仅需浅表光学通路的生物组织。&#160;例如，Li 等人利用 OCE 表征了皮肤组织的弹性特性10。其他研究者则表征了猪和人角膜组织的各向异性弹性特性，并研究了这些特性如何受眼内压的影响11,12,13,14,15,16。OCE 方法在生物膜研究中的一些优势在于其非破坏性，具有介观尺度的空间分辨率，无需任何样品制备，且检测速度快；该方法可提供物理结构&#160;和弹性特性的共定位测量结果（如孔隙率、表面粗糙度和形貌）8,9,17,18。
光学相干弹性成像（OCE）方法利用相敏光学相干断层扫描（OCT）测量弹性波在样品中传播时的局部位移。OCT是一种低相干光干涉仪，可将样品位移的局部变化转化为光谱仪记录的光强变化。OCT技术还已被应用于生物膜研究，用于表征介观结构、三维孔隙分布以及生物膜的形变17,19,20,21。此外，Picioreanu 等人通过OCT截面形变图像的流固耦合逆向建模，估算了生物膜的力学特性22。
另一方面，光学相干弹性成像（OCE）测量结合逆向弹性动力学波建模，可获得弹性波在样品中的传播速度，从而实现对样品弹性与黏弹性特性的表征。本课题组已将OCE技术改进用于生物膜弹性与黏弹性特性的定量测量8,9,18，并在琼脂糖凝胶平板样品上通过剪切流变测量验证了该技术的准确性18。由于测得的弹性波速度与样品的弹性特性密切相关，OCE方法能够提供对生物膜特性的精确且可靠的估计。此外，弹性波振幅在空间上的衰减可直接关联材料中的黏性效应，从而反映其黏弹性特性。我们已报道了利用弹性动力学波模型对在旋转环形反应器（RAR）中生长于试片上的混合菌群细菌生物膜以及具有复杂几何结构的颗粒状生物膜进行的OCE黏弹性特性测量18。
光学相干弹性成像（OCE）技术也是用于黏弹性表征的传统流变学18的一种强大替代方法。流变学方法最适合具有平面几何形状的样品。因此，对于具有任意形状和表面形貌的颗粒状生物膜，无法在流变仪上进行准确表征8,23。此外，与OCE不同，流变学方法可能难以适用于实时测量，例如在流动池中进行生物膜生长过程中的测量24,25。
本文表明，利用光学相干弹性成像（OCE）测量表面波的频率无关波速，可在无需复杂模型的情况下表征生物膜的弹性特性。这一进展将使OCE方法更易于被更广泛的生物膜研究领域用于研究生物膜的力学性质。
图1展示了本研究中所用光学相干断层扫描（OCT）系统的示意图。该系统包含多种仪器，包括商用谱域相敏OCT系统、延迟发生器、函数发生器和压电换能器。OCT系统基于干涉原理工作，采用中心波长为930 nm的宽带光源。所采集的光强信号与样品中复杂的结构细节相关，经后处理单元分析后转换为样品的横截面图像——通常称为OCT图像。OCT成像深度取决于样品中由局部折射率变化引起的光散射程度，在生物组织和生物膜中的成像深度通常限于1–3 mm。由于样品中的光相位和干涉强度会受到运动调制，OCT可用于检测样品局部的位移。我们在光学相干弹性成像（OCE）方法中利用OCT对位移的高灵敏度，追踪样品中弹性波的稳态位移场。具体而言，函数发生器输出正弦电压以驱动压电换能器。该换能器随之产生周期性的伸缩运动。换能器的振荡位移通过位于其顶端的3D打印楔形探头，在样品表面施加正弦力，从而在样品中激发谐性弹性波。楔形探头与样品表面轻柔接触，确保在执行器从样品表面撤回后样品仍保持完整。为记录样品中的局部位移，系统在样品每个像素位置采集一系列时间间隔固定的相邻深度扫描。每个像素点连续扫描之间的光相位差与该点的局部垂直位移成正比。通过来自函数发生器的触发脉冲并在延迟发生器中进行延时，实现换能器位移与OCT系统扫描光学元件之间的同步。该同步步骤有助于获取样品局部光相位分布的一致横截面图像。这些图像与样品中局部垂直谐性位移成正比，被称为OCE图像。通过在不同换能器激励频率下采集OCE图像，可获得弹性波长和波速随频率的变化关系。所测得的波速数据通过弹性动力学模型进行分析，以确定样品的弹性特性。

<table><tbody><tr><td>3D 打印样品支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D 打印楔形探头</td><td></td><td></td><td>3 mm 宽度</td></tr><tr><td>BNC 电缆</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>延迟发生器</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG535</td><td>DG535 数字延迟/脉冲发生器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>33250A 80 MHz 函数/任意波形发生器</td></tr><tr><td>颗粒状生物膜</td><td>Aqua-Aerobic Systems</td><td></td><td>取自好氧颗粒污泥反应器（Aqua-Aerobic Systems, Inc.）</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Release 2022a (MATLAB 9.12)</td></tr><tr><td>压电换能器</td><td>Thorlabs</td><td>PK2JUP1</td><td>分立式压电堆栈，75 V，30.0 &amp;micro;m 位移</td></tr><tr><td>SD-OCT 系统</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Ganymede II，LSM03 扫描透镜</td></tr><tr><td>ThorImageOCT</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>版本：5.5.5</td></tr></tbody></table>

利用光学相干弹性成像技术量化环境生物膜的弹性特性

Quantifying Elastic Properties of Environmental Biofilms using Optical Coherence Elastography

生物膜是由微生物细胞及其自身产生的胞外聚合物（EPS）构成的复杂生物材料，形成高度有序的网络结构。本文详细介绍了针对生物膜弹性表征而定制的光学相干弹性成像（OCE）测量方法的实施过程。OCE是一种非破坏性光学技术，能够在高空间和时间分辨率下，对部分透明的软材料进行微观结构、形态以及黏弹性特性的局部成像。我们提供了一份全面的操作指南，详细说明了该技术正确实施所需的关键步骤，并介绍了从实验数据中估算颗粒状生物膜整体杨氏模量的方法，内容涵盖系统搭建、数据采集和后期处理。在讨论部分，我们深入探讨了OCE所用传感器的物理原理，并分析了OCE测量在空间和时间尺度上的基本限制。最后，我们展望了OCE技术未来可能的发展方向，以推动其在环境生物膜弹性测量中的应用。

本研究中使用的颗粒状生物膜（也称为颗粒污泥）为商业获取。颗粒是通过自聚集形成的球形生物膜，这意味着它们无需载体或生长表面即可形成26。 图3A展示了由于颗粒状生物膜内部局部折射率空间变化而产生的代表性横截面OCT图像。该生物膜的标称直径为3 mm。图像中可见一些靠近样品表面的内部结构，包括孔隙和空腔。随着样品深度增加，光学散射增强，导致OCT光源无法到达样品中心区域，因此中心区域无任何可辨识的信息。图3B展示了在换能器激励频率为5.1 kHz时样品的横截面OCE图像。图像中的局部对比度与样品中传播的弹性波引起的局部垂直位移相关。沿传播路径的条纹物理间距对应于弹性表面波的波长。该表面波在样品表面附近传播，其穿透深度接近波长。由于OCT光源在样品中的光学穿透能力有限，图像中无法观察到表面波位移的空间范围。沿弹性波传播路径的光学相位分布（图4A）用于确定表面波的空间频率。通过对接收到的数据进行快速傅里叶变换（FFT；图4B），并选取FFT频谱幅值最大的频率，即可获得该空间频率。 
选择足够幅度的函数发生器电压至关重要，以产生在OCE图像中具有最佳对比度的干涉条纹图案。然而，应避免使用过高的电压，因为这可能导致OCE图像中出现相位卷绕现象，如图5A所示。相位卷绕的产生是由于测量中的光学相位差被限制在-π到π的区间内。当相位超出其中一个极限时，它会被折叠至相反的极限，从而形成不连续的相位分布。因此，需要进行相位解包裹处理，而这会带来挑战并可能引入潜在误差。另一个影响波测量准确性的因素是OCE图像中所包含的条纹数量。在较低换能器频率下（如图5B所示），由于颗粒尺寸较小，表面波的完整振荡周期可能无法被完全捕捉，导致FFT谱对空间频率（或波长倒数）的估计出现错误。空间频率估计的另一误差来源是OCT图像中存在空间上重叠的弹性波模式，例如表面波和体剪切波。这些波模式相互混合，形成复杂的干涉图样，难以分析。除表面波外，其他类型的波模式可能在换能器附近引入干涉效应，具体取决于样品特性、激励频率和振幅。图6展示了一幅在5.5 kHz激励频率下获得的OCE图像示例，其中局部激励点附近的体剪切波与表面波场发生干涉。图7A描绘的相位分布偏离了图4A中观察到的衰减正弦波模式，这是由多种波模式叠加所致。因此，相应的FFT谱呈现出更宽的峰值，如图7B所示。类似现象也可能出现在缺陷附近，例如孔隙或弹性/黏弹性性质显著变化的区域。在这些区域，入射波或表面波与来自缺陷的散射波发生干涉，从而改变了局部位移场。
我们计算了两种不同标称直径（4.3 mm 和 3.3 mm）的颗粒状生物膜在 4.0 至 9.6 kHz 频率范围内的表面波波速。波速曲线被称为色散曲线。在所用设置下，每次色散测量耗时约 15 分钟。在选定的频率区间内，光学相干弹性成像（OCE）图像中存在多个正弦位移轮廓周期，从而能够精确确定空间频率并呈现显著的相位对比。图 8 展示了获得的色散曲线。这些曲线代表每个样品内三个位置的平均色散曲线。表面波波速趋近于一个恒定值，称为瑞利波波速 cR，其与样品的剪切模量通过以下关系相关联：
cR = ((0.862 + 1.14ν)/ (1 + ν)) × (G/r)1/2
其中，G 为剪切模量，r 为质量密度，ν 为泊松比27,28。由于弹性波的穿透深度小于样品的直径，因此该值保持恒定。本质上，弹性波在样品表面附近传播，其波速与杨氏模量的平方根成正比28。然而，由于测量噪声的存在，该频率范围内的波速并非完全恒定。对于较小的样品，我们取 6.0 至 9.6 kHz 频率范围内的波速平均值；对于较大的样品，则取 4.0 至 9.6 kHz 频率范围内的平均波速。该平均波速随后用于估算样品的杨氏模量。
由于样品含水量高，我们假设其不可压缩，因此ν = 0.5。对于不可压缩固体，cR 直接与 E = 3G 相关，其中 E 为样品的杨氏模量27,28。图8中的虚线表示不同样品的瑞利波波速。我们假设生物膜主要成分为水，密度为1000 kg/m3。因此，计算得到粒状生物膜的杨氏模量分别为：名义直径为4.3 mm的样品为85 kPa，名义直径为3.3 mm的样品为205 kPa。该测量结果证实了该技术能够区分不同生物膜之间力学性能的差异。
<img alt="光学相干断层扫描示意图；OCT系统、波前、生物膜、压电换能器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：光学相干弹性成像系统装置示意图。图中显示了本实验所用系统的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="采用激光激发和光度传感器进行材料分析的光学表征装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：安装好的样品。 颗粒状生物膜被放置在样品支架上，同时传感器与其表面轻轻接触。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光学相干断层扫描横截面相位图像；1 mm比例尺；颜色相位图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：颗粒状生物膜的OCT与OCT图像。 （A）OCT图像。（B）表面波在5.1 kHz频率下传播的OCE图像，显示良好的条纹对比度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="相位与探针长度及空间频率关系图；光谱相位分析；数据偏移检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：相位分布与快速傅里叶变换（FFT）。 针对 图 3B 所示图像，（A）样品顶部边缘的相位差分布，以及（B）相位差分布的快速傅里叶变换（FFT），显示一个尖锐的峰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="相位缠绕示意图；三维表面分析中相位变化的光学测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：颗粒状生物膜的OCT与OCT图像。 （A）表面波在5.1 kHz频率下传播的OCE图像，显示相位缠绕现象。（B）表面波在1.3 kHz频率下传播的OCE图像，未形成完整周期。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="波前相位图；光学中的体波；以弧度为单位的相位梯度，1 mm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：OCE图像显示多种模式的组合。 该图像来自样品的另一位置，展示了在5.5 kHz频率下传播的波的多种模式组合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="探针线长与空间频率的相位分析图，显示以弧度为单位的相位偏移。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：相位分布与傅里叶变换（FFT）。 针对 图6 所示图像，(A) 样品顶部边缘的相位差分布，以及(B) 相位差分布的傅里叶变换（FFT），显示一个更宽的峰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="波速与频率关系图，4.3mm 和 3.3mm 样品，瑞利波分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66118/66118fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图 8：频散曲线。展示了两种不同尺寸样品在不同频率下的波速，并附有标准差误差棒。曲线平坦部分对应的瑞利波波速在图上方标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66118/66118fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文重点介绍了光学相干弹性成像（OCE）技术在快速、无损表征生物膜弹性特性方面的有效性。我们阐明了实现准确测量的关键OCE实施步骤，并提供了两种颗粒状生物膜的杨氏模量值。

生物膜是由微生物细胞及其自身产生的胞外聚合物基质构成的复杂生物材料，其中微生物细胞被包裹在结构有序的网络中……

我们的研究旨在利用光学相干弹性成像技术，表征环境生物膜的力学特性。我们希望理解并预测生物膜的组成和结构如何影响其力学性能。最终，这些知识将被用于增强或消除不同类型的生物膜，具体取决于实际应用需求。对于表征生物膜机械性能这一特定研究方向，我们拥有流变仪、纳米压痕技术以及原子力显微镜等方法。此外，还有一些新兴的开发性技术，例如光镊、磁镊、数字图像相关技术，以及其他多种方法。以往大多数使用的技术要么侧重于整体机械性能的测量，而忽略了介观尺度的特性，要么进行高度局部化的测量，这些测量在介观尺度上并不具有代表性。介观尺度至关重要，因为这一尺度与生物膜的物理特性密切相关。首先，我们改进了光学清除弹性成像技术，用于表征环境生物膜的力学性质。在此基础上，我们开发了相关方法，同时还开发了逆向建模工具，以处理具有分层黏弹性特性的生物膜，并分析其复杂的微观结构。我们的研究团队致力于量化污水处理厂中生物膜的力学特性。因此，我们希望了解影响生物膜稳定性和性能的因素。例如，生物膜的刚度是否会影响其脱落速率？首先，收集系统组件，包括商用光学相干断层扫描仪（OCT）、波形发生器、换能器、延迟发生器、带有BNC接口的开关、BNC电缆和适配器、光学支架和夹具。将函数发生器的同步信号连接至开关，然后将开关的另一端口连接至延迟发生器。现在，将函数发生器的输出端连接至换能器引线。将延迟发生器的输出端连接至OCT基座单元背面的触发通道。打开函数发生器、延迟发生器、OCT基座单元以及计算机。然后启动OCT软件。将换能器置于OCT镜头下方。在OCT软件中，选择多普勒采集模式并启用外部触发。将市售的颗粒状生物膜置于样品台的镜头下。使用平移台，将生物膜移向传感器的尖端，确保尖端与样品表面轻轻接触。在样品监测窗口中，单击所选直线的起点和终点，以确定扫描区域。接下来，将扫描路径方向的像素数设置为 1,523，样品深度方向的像素数设置为 1,024。将 B 扫描次数增加至 50，以提高光学相干弹性成像（Optical Coherence Elastography，OCE）图像的信噪比。单击扫描按钮并打开开关。当图像显示在屏幕上后，确保参考强度处于最佳范围内。然后将样品置于OCT显微镜物镜的焦区位置。在显示工具栏中，提高左侧色标条的上限值，并降低右侧色标条的下限值，以调节OCE图像中的相位等高线。配置函数发生器时，按下 Sign 按钮以产生单一频率的正弦电压，起始激励频率为 4.6 kilohertz。然后将电压设置为适当值，并通过按下 Output 键启用输出连接器。接下来，点击 Record 按钮，采集 OCT 和 OCE 图像。在不同频率下重复测量，以获得具有不同波长的弹性波场的横截面图像。

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