Name: 检测小鼠视网膜血管系统免受糖尿病相关死亡保护的检测方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 学习使用保护性检测方法研究小鼠视网膜血管免受糖尿病损伤的机制，揭示保护丧失与损伤积累的双相过程。该方法为理解糖尿病视网膜病变的发病机制提供了重要工具。

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本研究得到了伊利诺伊州防盲协会、美国国立卫生研究院（EY031350 和 EY001792）以及防盲研究基金会的无限制资助支持。

所有动物实验均经伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理与机构生物安全办公室批准。7周龄雄性C57/BL6/J小鼠在无病原体环境中以12小时光照/12小时黑暗循环条件群养，并可自由获取食物和饮水。小鼠通过CO2窒息法实施安乐死，眼球立即摘除并进行处理18。实验动物购自商业来源（见材料表）。本研究所需的关键工具如图1所示。
1. 传递致死性刺激
<ol>
	<li>使用TBH进行氧化应激处理（离体).
	<ol>
		<li>按照机构批准的方案实施小鼠安乐死，并摘除其眼球18 (图2A).</li>
		<li>将眼球直接放入含有DMEM + 1% BSA的24孔板的各个孔中，可选择是否添加5 mM叔丁基过氧化氢（TBH）（参见 材料表）；在 37 °C 下孵育 1 小时。阳性对照样品用 DNase（50 U/100 µL）处理 10 分钟以片段化 DNA。 
		注：TBH（诱导氧化应激的试剂）的剂量选择旨在在分离的视网膜血管中诱导出易于检测且低于最大效应的细胞死亡水平。18.</li>
		<li>用10%中性缓冲福尔马林固定眼球，过夜（至少16小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细胞因子混合物诱导炎症（体内).
	<ol>
		<li>通过腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 赛拉嗪对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>使用定制的33 G针头（参见 材料表) 向玻璃体内注射每眼 1 µL 细胞因子混合物；注射位点位于距角膜缘 2-3 mm 处（图2B). 
		注意：细胞因子混合物包含 TNF-α、IL-1β 和 IFN-γ，三者比例为 1:1:1，浓度分别为 1 µg/mL、1 µg/mL 和 1500 U/µL18 （参见 材料表).</li>
		<li>注射24小时后，按照机构批准的方案对小鼠实施安乐死，摘除眼球，并用10%中性缓冲福尔马林固定过夜。 
		&#8203;注意：固定后实验最多可暂停1周，之后可重新开始。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视网膜分离
<ol>
	<li>切开眼球。
	<ol>
		<li>使用直镊子轻轻夹住视神经（图2C）。另一只手持显微刀，在距角膜缘后方2-3 mm处做一切口。</li>
		<li>将显微刀换为显微剪，沿角膜缘平行剪开，同时连同视神经一起旋转眼球，直至将眼球完全切成两半。</li>
		<li>弃去前半部分眼球，包括晶状体（图2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除巩膜。
	<ol>
		<li>使用直镊子轻轻将巩膜从视网膜上抬起1-3 mm。</li>
		<li>使用显微剪在巩膜上做两条放射状切口，切至接近视神经处，注意避免损伤下方的视网膜。</li>
		<li>使用一对弯镊夹住巩膜瓣，将其从视网膜上撕下。色素上皮层（RPE）将随巩膜一同被剥离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗视网膜。
	<ol>
		<li>使用显微铲将分离的视网膜转移至已盛有双蒸水的24孔板中的一个孔内。</li>
		<li>在室温下以中等速度轻轻振荡培养板，每30分钟至1小时更换一次水，至少更换4-5次，然后过夜静置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 视网膜血管分离
<ol>
	<li>消化：将双蒸水替换为 800 µL YL 胰蛋白酶溶液（含 3% 胰蛋白酶的 0.1 M Tris 缓冲液，pH 7.8）。在 37 °C 条件下孵育 4 小时 15 分钟，轻柔振荡或不振荡19（图 2D）。 
	注意：避免剧烈振荡，以免损伤血管系统。</li>
	<li>转移：将玻璃转移移液管的宽端浸入 YL 胰蛋白酶溶液中，用其将视网膜转移至含有无绒毛双蒸水的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>去除外核层（感光细胞）（图 2E）。
	<ol>
		<li>将视网膜半球面朝下翻转。使用直形单毛刷轻轻将视网膜压至培养皿底部。</li>
		<li>使用环形刷从视神经向视网膜周边方向轻柔刷除感光细胞。由于感光细胞未通过血管与视网膜其余部分锚定，因此可成大片脱落。</li>
		<li>使用 200 µL 移液器收集并弃去神经组织碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除玻璃体。
	<ol>
		<li>将视网膜半球翻转至朝上方向。在解剖显微镜下，使用一对弯镊（A）尽可能夹住玻璃体。 
		注意：玻璃体呈透明薄膜状组织，附着于视神经或视网膜上。</li>
		<li>用另一把弯镊（B）夹住玻璃体与视神经连接处的末端，通过将镊子 A 与镊子 B 相反方向拉开以去除玻璃体。</li>
		<li>弃去玻璃体。检查残留的玻璃体组织，并重复此步骤，彻底清除所有残留，否则将影响后续操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除残留的神经和胶质组织（图 2F）。
	<ol>
		<li>再次将视网膜半球面朝下翻转。再次使用直形刷轻轻将视网膜压至培养皿底部（切勿使用毛刷尖端）。</li>
		<li>使用环形刷从视盘向视网膜周边方向轻柔刷过血管系统，以去除残留的神经组织20。</li>
		<li>用直形刷缓慢旋转视网膜，并使用环形刷清除视网膜血管系统上所有细小的神经组织碎片，直至血管网络完全清洁（图 2G，H）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将分离的视网膜血管系统固定在显微镜载玻片上
<ol>
	<li>放置载玻片。
	<ol>
		<li>将一个洁净的封片盒（见材料表）置于解剖显微镜下，并用双蒸水充满封片盒。</li>
		<li>在解剖显微镜下使用黑色背景，以增强对比度，便于观察透光的透明血管结构。</li>
		<li>用镊子将一张洁净并已标记的载玻片放入封片盒底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转移视网膜血管系统。
	<ol>
		<li>将玻璃转移移液管的宽端浸入含YL胰蛋白酶溶液中。</li>
		<li>将清洗后的视网膜血管系统转移至封片盒内的双蒸水中，使其位于载玻片上方，并轻轻搅动以使血管系统脱离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片固定视网膜血管系统。 
	注意：当血管系统漂浮在载玻片上方时，分离的血管结构将逐渐恢复其正常的碗状形态。
	<ol>
		<li>使用环形刷将视网膜半球翻转至朝上方向，轻柔地将血管系统压向玻片表面，然后用毛发将展开的血管结构固定在玻片中央。血管系统在接触玻片时应能自然黏附。</li>
		<li>从视神经部位向周边轻轻刷动碗状的视网膜血管，使其平整贴附。</li>
		<li>向各个方向重复刷动，直至血管系统完全贴附于玻片表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>空气干燥视网膜血管系统。
	<ol>
		<li>当整个视网膜血管系统完全附着于玻片后，可轻轻抬起玻片一端，或缓慢从封片盒角落排水以减少水流扰动，随后将玻片取出（图2I）。 
		注意：血管系统在空气干燥后将变得清晰可见（图2J）。</li>
		<li>用记号笔在玻片背面标记视网膜血管系统的轮廓范围。</li>
		<li>立即进行后续染色操作，中间不得停顿。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用TUNEL染色检测细胞死亡
注意：有关此操作的详细信息，请参见 Zheng 等人21。分离的视网膜血管中缺血 ± 氧化应激诱导的凋亡小体的代表性图像见图3。
<ol>
	<li>用 PBS 重悬分离的血管组织。在 PBS 中清洗 3 次，然后在冰上用含 1% Triton X-100 的 PBS 孵育 2 分钟，以对分离的血管组织进行通透处理。</li>
	<li>用 PBS 清洗载玻片两次，以去除残留的 Triton X-100。擦干样品周围的区域。</li>
	<li>在样品上加入 50 µL TUNEL 反应混合液（见材料表）。将载玻片置于湿盒中，于 37 °C 避光孵育 60 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗载玻片 3 次，以去除 TUNEL 反应混合液。擦干样品周围的区域。</li>
	<li>滴加一滴含 DAPI 的封片剂对细胞核进行染色，并加盖盖玻片封片。于 4 °C 避光保存。 
	注意：在拍摄图像前，该步骤可暂停最多 1 周。</li>
	<li>使用共聚焦荧光显微镜拍摄所得血管组织图像（见材料表）。随机选取视神经远周缘区域的六至八个视野进行成像（图 4）。 
	注意：分离的视网膜血管中细胞因子诱导的凋亡小体的代表性图像见于图 5。</li>
	<li>分析结果。
	<ol>
		<li>对于离体（ex vivo）TBH 处理的样品，执行以下步骤。
		<ol>
			<li>使用 Image J（见材料表）统计每个视野中凋亡小体（TUNEL/DAPI 双阳性结构）的数量。计算单个样品所有视野中凋亡小体的平均数。</li>
			<li>计算随机选取的一对非糖尿病（non-DM）和糖尿病（DM）样品之间凋亡小体数量的倍数变化。</li>
			<li>采用双尾学生 t 检验判断差异是否具有统计学显著性18。 
			注意：对照组和实验组样品（non-DM 和 DM）应同时染色，因为即使操作方式相同，TUNEL 染色程度也可能存在差异。由于经验丰富的操作者每天最多可处理 10 个视网膜样品，因此建议在开始本方案前，预先规划好数量相等的对照组和实验组视网膜样品一同处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于在体（in vivo）细胞因子混合物处理的样品，执行以下步骤。
		<ol>
			<li>手动统计整个视网膜血管系统中凋亡小体（TUNEL/DAPI 双阳性结构）的数量。</li>
			<li>计算随机选取的一对非糖尿病（non-DM）和糖尿病（DM）样品之间凋亡小体数量的倍数变化。</li>
			<li>采用双尾学生 t 检验判断差异是否具有统计学显著性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Novel Retina Protection Assay for Diabetic Retinopathy Pathogenesis Study

<ol><li>Teo, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+diabetic+retinopathy+and+projection+of+burden+through+2045%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis.</a> Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).</li>
<li>Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+diabetic+retinopathy%2C+diabetic+macular+edema+and+related+vision+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+Vis+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss.</a> Eye Vis (Lond). 2, 21(2015).</li>
<li>Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+diabetic+retinopathy%3A+A+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Retina+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study.</a> Int J Retina Vitreous. 2, 21(2016).</li>
<li>Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+emerging+trends+in+the+epidemiology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy.</a> Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Dis Primers. 2, 16012(2016).</li>
<li>Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+during+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187(2018).</li>
<li>Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+onset+and+the+risk+of+proliferative+retinopathy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes.</a> Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).</li>
<li>Aiello, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy.</a> Diabetes Care. 21 (1), 143-156 (1998).</li>
<li>Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wisconsin+epidemiologic+study+of+diabetic+retinopathy.+Prevalence+and+risk+of+diabetic+retinopathy+when+age+at+diagnosis+is+less+than+30+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years.</a> Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).</li>
<li>Nathan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intensive+treatment+of+diabetes+on+the+development+and+progression+of+long-term+complications+in+insulin-dependent+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+long-term+complications+in+families+with+diabetes+in+the+diabetes+control+and+complications+trial.+The+diabetes+control+and+complications+trial+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group.</a> Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).</li>
<li>Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+and+proliferative+retinopathy+in+people+diagnosed+with+diabetes+before+age+30+yr%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr.</a> Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).</li>
<li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+From+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).</li>
<li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li>
<li>Sergeys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+characterization+of+the+streptozotocin-induced+diabetic+mouse+model%3A+Focus+on+early+inner+retinal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).</li>
<li>Sun, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+retinopathy+and+other+complications+in+patients+with+type+1+diabetes+of+extreme+duration%3A+The+joslin+50-year+medalist+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study.</a> Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+progression+of+diabetic+retinopathy+is+associated+with+transient+protection+of+retinal+vessels+from+death%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death.</a> Int J Mol Sci. 24 (13), 10869(2023).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. 76, e50489(2013).</li>
<li>Veenstra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+Retina-specific+methods+for+maintenance+of+diabetic+rodents+and+evaluation+of+vascular+histopathology+and+molecular+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).</li>
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<li>Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+death+of+retinal+microvascular+cells+in+human+and+experimental+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy.</a> J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).</li>
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<li>Podestà, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+New+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究建立了一种检测视网膜血管对糖尿病/糖尿病视网膜病变（DM/DR）相关损伤（如缺血/氧化应激和细胞因子）诱导死亡的抗性或易感性的方法。本文详细描述了该方法，该方法是对数个已发表方案19,20,21的改进。
该方案包含若干关键步骤。首先，必须精细地分离视网膜，确保血管网络的完整性，并防止出现明显撕裂。为此，可在距角膜缘后方2-3 mm处进行切口，因为视网膜与锯齿缘紧密附着，分离较为困难。其次，在整个操作过程中，所有接触血管的器械（例如单毛刷、转移移液管和镊子）均需用胰蛋白酶包被，方法是将这些工具浸入YL胰蛋白酶溶液中。这可以防止血管黏附于本方案中所使用的器械上。第三，由于微血管在普通光线下几乎不可见，因此在吸除碎片并将样本转移至显微镜载玻片的过程中需格外谨慎，以避免意外丢失样本。
对视网膜各层进行适当程度的酶消化至关重要；消化不足会导致神经组织无法与血管网络分离，而过度消化则会溶解血管丛。已有报道的消化时间范围从1小时19到过夜23不等。根据观察结果，与2小时、3小时和4小时相比，4小时15分钟的消化时间可获得最理想的效果。超过此时间进一步延长消化可能不会改善效果，反而可能破坏血管结构的完整性。
若消化后的视网膜黏附在单根毛刷上，可将毛刷多次浸入YL胰蛋白酶溶液中，以减少刷毛的黏性区域。如果毛刷仍然黏附血管组织，则应检查是否存在残留的玻璃体碎片，并用镊子将其清除。
完全去除玻璃体的最佳时机是在光感受器被清除之后，但在剩余的神经和胶质组织被移除之前。在光感受器被去除之前，视网膜保持一定的刚性。在此阶段移除玻璃体可能会导致视网膜或血管系统撕裂。残留的神经和胶质组织的精细层次在维持血管结构的曲面形态方面起着关键作用。它们可防止在玻璃体从视神经上分离时视网膜中心发生撕裂。
如果分离的血管组织完全无法黏附在显微镜载玻片上，则表明预期发生黏附的载玻片区域受到污染。可尝试将血管在载玻片表面移动以寻找具有黏性的区域，或更换另一张载玻片，或仔细清洁载玻片后重新尝试。如果血管在尚未展开成碗状之前就已黏附在载玻片上，应使用镊子将血管从载玻片上轻轻提起，使其重新在液体中自由漂浮。此步骤应使用反复浸入YL胰蛋白酶溶液中的镊子进行操作。
已有数种用于分离血管系统的替代技术被报道，但这些方法不适用于本文所述的保护性检测。例如，渗透裂解法已被用于从未固定的小鼠视网膜样本中分离血管系统，从而便于对组织进行生物化学研究24,25。然而，该方法可能无法像本文所采用的方法那样良好地保存血管系统的解剖结构。类似地，尽管组织印迹法可用于分离大段微血管系统，从而实现对血管系统电紧张性结构的分析26，但通常无法完整回收整个血管床。
本实验方法的开发是由于现有的监测毛细血管退化的方法未能解决保护性机制的问题。在糖尿病长期发展（DM）后出现的毛细血管退化，可用于判断是否已发生糖尿病视网膜病变（DR）。除了用于诊断DR之外，该指标还可用于评估某种药物或疗法是否能够预防DR的发生。然而，现有的毛细血管退化检测方法无法阐明药物作用的潜在机制。此类药物可能通过抑制驱动DR的病理事件（如氧化应激或细胞因子水平升高）发挥作用；或者，该药物可能通过增强对氧化应激和细胞因子的耐受能力，和/或促进损伤修复，从而实现保护作用。这种新型的保护性检测方法可用于确定某种特定疗法的有益效果是否涉及增强机体自身抵御糖尿病相关损伤的内源性保护系统。
该保护实验的一个缺点是无法区分视网膜血管中的两种细胞类型：内皮细胞（ECs）和周细胞（PCs）。尽管在PASH染色切片中，它们的细胞核形态具有细胞类型特异性（图6），但并非每个细胞核都表现出可明确识别的特征。大约30%的细胞核无法明确归类为EC或PC，部分原因在于从PASH染色样本获得的二维图像不能完全解析血管丛的三维结构。这一障碍可通过额外分析加以克服，例如使用细胞类型特异性标志物进行免疫荧光染色。这类能够区分两种细胞类型的图像可与TUNEL染色共标，以确定每种血管细胞类型的抗性或易损性。
这种以血管为重点的检测方法无法提供有关神经视网膜的任何信息。可开发其他检测方法来获取此类信息。例如，可制备整个视网膜的单细胞悬液，随后通过荧光激活细胞分选技术分析其抵抗性或易损性。结合细胞类型特异性标记物（包括神经和血管来源）以及细胞死亡的指示指标，将能够更全面地揭示具有抵御糖尿病/糖尿病视网膜病变介导死亡能力的视网膜细胞类型。
综上所述，本文所述的保护实验为研究小鼠糖尿病（DM）发病与糖尿病视网膜病变（DR）表现之间存在延迟现象的机制提供了一种强有力的手段。

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病（DM）的微血管并发症之一，也是发达国家劳动年龄人群失明的首要原因1。糖尿病视网膜病变的主要危险因素是高血糖的持续时间和严重程度2,3,4。尽管糖尿病会导致视网膜血管和神经成分的功能障碍5，但糖尿病视网膜病变的诊断仍基于视网膜血管系统的形态学特征6。
高血糖诱导的氧化应激是糖尿病视网膜病变（DR）发病机制的驱动因素之一7。氧化应激水平升高会导致广泛性损伤，损害线粒体功能，从而进一步增加活性氧（ROS）的水平。这些事件伴随视网膜血管渗漏、炎症性细胞因子水平升高，以及视网膜内神经细胞和血管细胞的死亡。血管细胞的丢失导致视网膜密集毛细血管网络的功能受损，进而引发缺氧，而缺氧是多种应答反应的强烈刺激因素5。这些应答包括血管内皮生长因子（VEGF）表达上调，促进血管通透性和血管生成，这是糖尿病视网膜病变晚期威胁视力阶段——糖尿病性黄斑水肿和增殖性糖尿病视网膜病变——的核心特征6。
糖尿病视网膜病变（DR）的某些特征表明，机体（包括患者和实验动物）具有抵抗该病的内在能力。患者通常在经历数十年的糖尿病（DM）后才会出现威胁视力的DR8,9,10,11,12,13。尽管糖尿病啮齿类动物模型不会发展为晚期、威胁视力的DR阶段14，但其出现的早期/轻度DR也仅在糖尿病持续数周或数月后才显现15,16。此外，在患者和实验动物中，DR均呈进行性发展，且随着糖尿病病程延长，视网膜功能障碍/损伤逐渐加重。最后，部分糖尿病患者终身未发生DR。在某些情况下，这是因为个体患糖尿病的时间不足以引发DR；而在另一些情况下，则是因为他们对DR表现出异常的抵抗力，例如“Medalist研究”中的参与者，在罹患糖尿病50年甚至更长时间后仍未出现DR17。尽管存在这些有力证据支持DR保护机制的存在及其巨大的转化医学意义，但针对该保护机制的研究尚未得到充分开展。
本文所述的保护性检测方法旨在促进研究糖尿病小鼠中糖尿病性视网膜病变（DR）为何在糖尿病（DM）发病后出现延迟。该检测方法的关键步骤应用于糖尿病（DM）和非糖尿病（非DM）小鼠，包括：（1）对眼球施加亚最大致死性损伤（ex vivo 或 in vivo），（2）分离视网膜血管系统，（3）使用TUNEL和DAPI对血管系统进行染色，（4）拍摄所得图像并定量分析TUNEL/DAPI双阳性细胞所占的百分比。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Fischer Scientific</td><td>SF100-4</td><td>固定</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>33 G 针头</td><td>Hamilton</td><td>定制的</td><td></td></tr><tr><td>氨水&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>221228-1L-PCA</td><td></td></tr><tr><td>C57/BL6/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>Jax #000664</td><td></td></tr><tr><td>细胞因子混合物</td><td></td><td></td><td>由1:1:1比例的1组成 &amp;micro;g/mL TNF-&amp;alpha;, 1 &amp;micro;g/mL IL-1 &amp;beta; 和 1500 U/&amp;micro;LIFN- &amp;gamma;</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td>任何能够清晰观察视网膜的显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子</td><td>精细科学工具（FST）</td><td>11231-30</td><td>直形尖端</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11253-25</td><td>微钝化尖端</td></tr><tr><td>易握型组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Fischer Scientific</td><td>1367820A</td><td>折断巴斯德吸管的细端，并将 &amp;ldquo;破碎的&amp;rdquo; 末端接一个橡胶吸头。</td></tr><tr><td>哈里斯改良苏木精&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>美国国立卫生研究院，贝塞斯达</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素</td><td>Millipore</td><td>11684795910</td><td>TUNEL反应混合液</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>22 mm × 22 mm</td></tr><tr><td>显微刀&amp;nbsp;</td><td>Sharpoint</td><td>72-1551</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>包埋盒&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>任何略大于显微镜载玻片的透明盒</td></tr><tr><td>高碘酸</td><td>Sigma</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸溶液</td><td></td><td></td><td>35 mM 过碘酸与 12 mM 醋酸钠&amp;nbsp; 在 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Permount封片剂&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂（含 DAPI）</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>重组人IFN- &amp;gamma;</td><td>Peprotec</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-1 &amp;beta;</td><td>Peprotec</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>重组人TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotec</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>希夫试剂基础液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱（肚脐摇床）</td><td>IBI Scientific&amp;nbsp;</td><td>BBUAAUV1S</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 无菌真空瓶</td><td>默克密理博</td><td>SCGPS05RE</td><td>制备过滤水</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 处理的载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-550-15</td><td>使用未开封包装盒中的载玻片</td></tr><tr><td>叔丁基过氧化氢（TBH）</td><td>Sigma</td><td>75-91-2</td><td></td></tr><tr><td>TRIZMA 碱</td><td>Fischer Scientific</td><td>11-101-5522</td><td>配制100 mM Tris溶液，用HCl调节pH至7.8</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1:250</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td></td></tr><tr><td>二 &amp;ldquo;刷子&amp;rdquo;</td><td></td><td></td><td>由单根黑色毛发制成&amp;nbsp; 固定在塑料移液管末端。&amp;nbsp; 一端为自由端的刷子，另一端为环状的刷子</td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>精细科学工具（FST）</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma</td><td>65351-M</td><td></td></tr><tr><td>YL 胰蛋白酶溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris（pH 7.8）中的 3% 胰蛋白酶</td></tr><tr><td>蔡司 LSM 710 荧光显微镜</td><td>蔡司显微镜</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种检测小鼠视网膜血管免受糖尿病相关死亡的保护作用的实验方法

An Assay to Detect Protection of the Retinal Vasculature from Diabetes-Related Death in Mice

糖尿病视网膜病变（DR）是一种复杂且进行性的视网膜疾病，其发病机制可分为两个 distinct 阶段。第一阶段表现为视网膜抵御糖尿病所致损伤的保护机制丧失，第二阶段则以损伤的累积为核心。传统的检测方法主要关注毛细血管退变的评估，这反映了损伤的严重程度，实质上针对的是 DR 的第二阶段。然而，这些方法仅能间接揭示视网膜血管系统的保护机制是否受损。为克服这一局限，研究人员开发了一种新方法，可直接评估视网膜的保护机制——特别是其抵御糖尿病引起的氧化应激和细胞因子等损伤的能力。尽管该保护性检测最初是为糖尿病视网膜病变设计的，但它在生理和病理条件下均具有更广泛的应用潜力。总之，理解糖尿病视网膜病变的发病机制需认识到保护机制丧失与损伤累积的双重阶段，而这一创新性的保护性检测为相关研究提供了有力工具，并可能拓展至其他医学领域。

成功分离视网膜血管可获得完整的小鼠视网膜血管网络的平铺标本，且其结构完整性得以保留（图 2J）。经高碘酸-希夫-苏木精染色（PASH）后，可区分两种血管细胞类型：内皮细胞（ECs）和周细胞（PCs）（图 6）。内皮细胞的细胞核呈长椭圆形，染色较浅，完全位于血管壁内。周细胞的细胞核呈圆形，染色深，突出于毛细血管壁之外。PASH 染色样本还可显示无细胞毛细血管，其特征为缺乏细胞核。
诱导细胞死亡的方法基于以下原理：推测保护作用是有限的，即可能被非常强烈的致死性刺激所压倒。因此，对刺激因素（包括缺血/氧化应激和细胞因子18）进行了优化，使其能够诱导出明显可检测但尚未达到最大程度的细胞死亡（图3 和 图5）。
需要强调的是，TUNEL 阳性细胞核的存在取决于诱导细胞死亡所使用的特定损伤类型。缺血/氧化应激损伤导致细胞凋亡呈现条纹状轨道模式，如图3所示；而细胞因子损伤则产生一种截然不同且界限清晰的模式，如图5所示。这两种模式均可在糖尿病视网膜病变（DR）患者视网膜血管中观察到22，提示这两类因子均可在人类中诱导细胞死亡。此外，所观察到的形态学差异为判断疾病病理过程是由氧化应激还是细胞因子驱动提供了评估依据。
<img alt="用于显微镜载玻片制备的实验室移液器、镊子和外科工具套装。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：分离小鼠视网膜血管的工具。 从左到右：包埋盒、两把单毛刷、一支倒置移液管、微型刮刀、两把弯头镊子、弹簧剪、微型刀具以及直头镊子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="离体氧化损伤，体内炎症，实验设置，24孔板，细胞研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2示意图展示向小鼠眼球递送诱导死亡的损伤刺激，随后分离视网膜血管系统的关键步骤。 (A缺血/氧化损伤的诱导 离体去核后，眼球在TBH存在下经历缺血。(B) 体内 细胞因子的玻璃体内注射给药。C将眼球切成两半。D视网膜酶消化：去除巩膜，用双蒸水洗涤视网膜过夜，在YL胰蛋白酶溶液中孵育 37 °C 在24孔板的一个孔中孵育4小时15分钟。（E) 去除感光细胞。F) 去除残留的神经和胶质组织。G）清洗后的碗状血管网络朝上。（H）在解剖显微镜载物台上，35 mm 培养皿中带有黑色背景的分离血管网络。I) 载玻片上平铺的视网膜血管结构。J载玻片上空气干燥的视网膜血管结构。该图已根据 Li 等人的研究修改。18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TUNEL 凋亡检测结果；缺血、氧化应激、对照条件下的荧光显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：ex vivo 条件下经缺血 +/- TBH 处理的小鼠视网膜血管内凋亡小体的检测。分离的视网膜血管中由缺血 +/- 氧化应激诱导产生的凋亡小体的代表性图像。每列上方标注了染色方式。（A-C）仅经历1小时缺血处理的眼球中分离出的视网膜血管。（D-F）与（A-C）相同，但1小时刺激为缺血与氧化应激（5 mM TBH）的联合处理。红色箭头指示典型的TUNEL/DAPI双阳性细胞。(G-I) 经DNase处理的阳性对照。比例尺 = 50 µm。本图改编自Li等18。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本</a>
<img alt="视神经组织的5x5拼接扫描示意图，标出用于分析的区域；显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：结果定量分析中视野选择示意图。 视网膜血管系统的5×5拼接扫描图像，合并显示TUNEL与DAPI信号。图中以红色方框标示出围绕视神经远端周边区域中选取的6至8个视野。放大倍数：200倍。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞因子处理细胞中的TUNEL和DAPI染色，显微镜分析，细胞凋亡成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：玻璃体内注射细胞因子后小鼠视网膜血管内凋亡小体的检测（体内给药）。 分离的小鼠视网膜血管中细胞因子诱导产生的凋亡小体的代表性图像。每列标题标明染色类型。（A-C）来自玻璃体内注射PBS小鼠的视网膜血管图像。（D-F）与（A-C）相同，但同时注射了细胞因子混合物。红色箭头指示典型的TUNEL阳性信号。比例尺 = 100 µm。本图已根据Li等人的研究修改18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="聚合物网络结构的显微图像，节点高亮显示；细胞黏附研究比例尺为 50 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：PASH 染色视网膜血管的代表性图像。 经历 20 周 STZ 诱导糖尿病（DM）的小鼠视网膜血管按 图 2 所述方法分离，经 PASH 染色后在可见光照射下成像。毛细血管周细胞的细胞核通常呈更圆且染色较深（蓝色箭头），而细长且染色较浅的细胞核则为内皮细胞的特征（红色箭头）。黄色箭头指向无细胞毛细血管。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

已建立一种保护性检测方法，用于监测视网膜血管对糖尿病或糖尿病视网膜病变相关损伤（如氧化应激和细胞因子）导致的细胞死亡的抵抗能力。

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是一种复杂且进行性的眶眼疾病，其发病机制可分为两个 distinct 阶段。第一阶段涉及……

我们的目标是理解糖尿病视网膜病变为何在糖尿病发病数十年后才逐渐出现。我们正在研究糖尿病视网膜病变两个阶段的发病机制，即保护作用的丧失和损伤的累积。我们的目标是通过保护性检测，研究视网膜血管在糖尿病诱导的损伤中受到的保护作用。我们的保护性检测揭示了与糖尿病视网膜病变相关的保护作用丧失和损伤累积的两个阶段。因此，这一创新性方法为理解糖尿病视网膜病变的发病机制提供了有价值的工具，其潜在应用还可拓展至糖尿病视网膜病变之外，适用于更广泛的生理与病理过程。尽管现有文献主要集中于糖尿病视网膜病变的病理改变，但关于保护性因素的研究仍存在显著的知识空白。该保护性检测方法在弥补现有研究空白方面发挥着关键作用，并帮助我们理解保护性因素在视网膜血管抵御糖尿病诱导损伤中的作用。这一新型保护性检测方法加深了我们对糖尿病视网膜病变进展机制的认识，为研究糖尿病发病与糖尿病视网膜病变（DR）表现之间延迟现象提供了有针对性的工具。该方法通过解析保护与损伤之间的相互作用，推动了相关研究进展，为靶向治疗策略的开发以及更广泛的应用提供了潜在可能。我们的未来研究将集中于明确小鼠视网膜中参与这种保护作用的特定细胞类型，包括内皮细胞、寄生虫和神经元细胞，以及该保护作用背后的分子机制。此外，我们还旨在鉴定介导这一保护机制的潜在基因。首先，将分离的视网膜组织置于含有双蒸水的24孔板中。然后将双蒸水替换为800微升YL胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下孵育4小时15分钟，孵育过程中轻柔或不振荡。使用浸入YL胰蛋白酶溶液中的玻璃转移移液管，将视网膜转移至含有无绒双蒸水的35毫米培养皿中。为去除外核层，将视网膜半球朝下翻转，并用直单毛刷轻轻将其压至培养皿底部。使用环形刷轻轻刷去视网膜的光感受器。接下来，为去除玻璃体，将视网膜半球向上翻转。在解剖显微镜下用弯头镊子夹住玻璃体。用另一把弯头镊子夹住连接视神经处的玻璃体末端。将两把镊子反向拉开，以移除并弃去玻璃体。然后再次将视网膜向下翻转，并用直头刷轻轻将其压至培养皿底部。随后，使用环形刷从视神经乳头向周边轻刷血管网络，以去除残留的神经组织。用直刷缓慢旋转视网膜，并使用环形刷去除所有细小的神经组织碎片，直至血管网络完全清洁。为安装视网膜血管网络，用环形刷将视网膜半球翻转至朝上，然后轻轻将血管网络推压到玻片表面。然后用毛发将打开的血管固定在载玻片中央。从视神经向周边轻轻刷动呈公牛头形状的视网膜血管，以展平血管组织。朝各个方向重复刷动，直至血管完全贴附于载玻片上。

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医学

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