Name: 肠神经系统谱系与人多能干细胞的分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 了解利用人多能干细胞在化学限定条件下分化为人肠神经元的体外培养方法。该方案通过神经嵴诱导生成SOX10阳性神经嵴细胞，最终获得具有神经突的功能性肠神经元，为肠神经系统发育研究、疾病建模和再生医学提供可扩展的细胞平台。

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本工作获得了加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究计划和桑德勒基金会的资助，以及美国出生缺陷基金会资助项目（编号：1-FY18-394）、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（1DP2NS116769-01）、NIH主任创新者奖（DP2NS116769）（授予F.F.）以及美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目（R01DK121169）（授予F.F.）。H.M. 获得了拉里·L·希尔布洛姆基金会博士后奖学金、NIH T32-DK007418 博士后奖学金以及加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究计划独立博士后奖学金的支持。

1. 培养基制备
注意：本方案中提到的浓度均为培养基组分的终浓度。所有培养基均须在超净工作台中无菌条件下配制，并于4 °C避光保存。请在2周内使用完毕。
<ol>
	<li>人多能干细胞维持培养基：将无饲养层人多能干细胞维持培养基添加剂（20 µL/mL）与其基础培养基混合。</li>
	<li>培养基A：将骨形态发生蛋白4（BMP4；1 ng/mL）、SB431542（10 μM）和CHIR99021（600 nM）加入分化基础培养基中。</li>
	<li>培养基B：将SB431542（10 μM）和CHIR99021（1.5 μM）加入分化基础培养基中。</li>
	<li>培养基C：将SB431542（10 μM）、CHIR99021（1.5 μM）和视黄酸（RA，1 μM）加入分化基础培养基中。</li>
	<li>神经嵴完全培养基（NCC培养基）：将FGF2（10 ng/mL）、CHIR99021（3 μM）、N2添加剂（10 μL/mL）、B27添加剂（20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂（10 μL/mL）和MEM非必需氨基酸（MEM NEAAs，10 μL/mL）加入神经基础培养基（neurobasal medium）中。</li>
	<li>肠神经嵴细胞培养基（ENC培养基）：将GDNF（10 ng/mL）、抗坏血酸（100 μM）、N2添加剂（10 μL/mL）、B27添加剂（20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂（10 μL/mL）和MEM非必需氨基酸（MEM NEAAs，10 μL/mL）加入神经基础培养基（neurobasal medium）中。</li>
	<li>乙二胺四乙酸（EDTA）1×：将500 mM EDTA（1000×）用PBS稀释至终浓度为500 μM。 
	注意：除非另有说明，本实验方案中始终使用不含Ca2+和Mg2+的PBS。</li>
</ol>
2. 培养板的包被
<ol>
	<li>基底膜基质包被培养板：迅速解冻一份500 μL的基底膜基质冻存液，加入50 mL预冷的DMEM:F12培养基中，使用50 mL血清移液管剧烈吹打使其充分混匀并稀释。用稀释后的基底膜基质溶液对培养板孔进行包被（每平方厘米100 μL）2 （每平方厘米表面积）后，在37 °C下孵育过夜。使用前吸除包被液。为防止基底膜基质凝胶化，此步骤应尽快操作，并使用冷的DMEM:F12培养基溶解冻存的基质 aliquot。 
	注意：在解冻（置于冰上）和分装（试管置于冰上）过程中，应保持基底膜基质处于低温，以防止凝固。</li>
	<li>PO/FN/层粘连蛋白包被板：用 PBS 稀释 1000 倍浓缩液，配制 15 μg/mL 多聚鸟氨酸（PO）溶液。按每平方厘米 100 μL 的量将 PO/PBS 溶液加入孔中进行包被2 根据培养板表面积加入相应体积的PO/PBS，37 °C过夜孵育。次日，吸除PO/PBS，按每平方厘米100 μL的体积对孔进行包被。2 用含有2 μg/mL纤连蛋白（FN）和2 μg/mL层粘连蛋白的现配FN/层粘连蛋白/PBS溶液包被培养板表面。在37 °C孵育至少2 h后即可使用。使用前吸除FN/层粘连蛋白/PBS溶液。</li>
</ol>
3. hPSC 培养的维持
注意：所有细胞培养步骤均在加湿培养箱中，于 5% CO2 和 37 °C 条件下进行。
<ol>
	<li>从hPSC培养物中吸除hPSC培养基，并加入新鲜培养基（每平方厘米200 μL）2 每隔一天更换一次培养基（按每平方厘米培养皿表面积计算），直至细胞集落融合度达到约80%。</li>
	<li>传代时，吸除hPSC培养基，每平方厘米用100 μL PBS洗涤细胞2 的培养孔表面积。 
	注意：必须使用 Ca2+ 和 Mg2+ 用游离的PBS洗涤细胞。</li>
	<li>加入500 μM EDTA（每平方厘米100 μL）2 （按培养孔表面积计算）。更换培养板盖，通过倒置显微镜观察细胞，监测克隆边缘是否出现脱落（2–4 分钟）。</li>
	<li>使用5或10 mL刻度吸管向每个孔中加入等体积的hPSC培养基，并通过反复吹打数次以机械法收获细胞。 
	注意：EDTA 孵育的最佳时间取决于 iPSC 系。在脱离集落时避免剧烈吹打，以免导致集落过度解离和细胞死亡。当传代以开始分化培养时，将细胞与 EDTA 孵育的时间延长 1–2 分钟。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。离心细胞（2分钟，290 × g） g，20-25 °C）并小心弃去上清液。</li>
	<li>用适量的hPSC培养基重悬细胞，并转移至已包被基底膜基质的新培养板孔中。 
	注意：常规人多能干细胞（hPSC）传代培养时，使用1:18至1:24的传代比例（1:18指将一个6孔板中单个孔的细胞消化后，取其中三分之一接种至一个全新的完整培养板中）。启动分化培养时，采用5:6的传代比例。</li>
	<li>在5% CO₂条件下孵育2 和 37 °C。</li>
</ol>
4. 神经嵴诱导
注意：此步骤在示意图中表示如下 图1A当细胞融合度达到约80%时开始神经嵴（NC）分化。若按5:6比例传代，通常在1-2天内可达到此状态（见上文）。在第0天使用多能性且完全未分化的hPSC细胞启动NC分化。为获得高分化效率，细胞集落边缘应尽可能少含已分化细胞。当集落较大，或在倒置显微镜下观察到集落中心开始增厚或变暗时，应及时传代并接种hPSC用于分化。相较于接种细胞数量（该数值因细胞系不同可能在每平方厘米50,000至200,000之间波动），关注细胞融合度和形态更为可靠。2.
<ol>
	<li>第0天，将hPSC维持培养基更换为含有1 ng/mL BMP4、10 μM SB431542和600 nM CHIR99021的A培养基（每平方厘米培养面积加入200 μL培养基）2 （单位为孔表面积）</li>
	<li>第2天，细胞应达到100%汇合度。轻柔吸除用过的A培养基，加入含10 μM SB431542和1.5 μM CHIR99021的B培养基（每平方厘米培养面积加入200 μL培养基）2 （单位为孔表面积） 
	注意：在神经嵴诱导过程中，随着细胞培养的生长，细胞可能会从底层单层脱落。为避免细胞过度丢失，应轻柔地从孔板一侧移除旧培养基并添加新鲜培养基。</li>
	<li>第4天，再次使用培养基B对细胞进行换液（每平方厘米培养面积加入200 μL培养基）2 （单位为孔表面积）</li>
	<li>第6天，将培养基B更换为含有10 μM SB431542、1.5 μM CHIR99021和1 μM视黄酸的培养基C（每平方厘米加入400 μL培养基）2 （单位为孔的表面积）</li>
	<li>第8天和第10天的喂养操作同第6天。</li>
</ol>
5. ENC 类球体的形成
注意：此步骤在图1B中以示意图形式表示。
<ol>
	<li>第12天，轻柔吸除C培养基，并用每平方厘米100 μL的PBS洗涤细胞2 的培养孔表面积。加入相同体积的细胞解离溶液，于5% CO₂条件下孵育30分钟2 和 37 °C。</li>
	<li>将细胞解离溶液与含有10 ng/mL FGF2、3 μM CHIR99021、10 μL/mL N2添加剂、20 μL/mL B27添加剂、10 μL/mL L-谷氨酰胺添加剂和10 μL/mL MEM NEAA的NCC培养基等体积混合进行稀释。使用血清移液管收集单细胞悬液，并转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>离心细胞（2 分钟，290 x g，20–25 °C）并小心弃去上清液。</li>
	<li>使用10 mL血清移液管，加入12 mL（用于完整的6孔板）NCC培养基，并通过机械吹打1–2次彻底重悬细胞。将细胞悬液转移至超低吸附培养板中。 
	注：约 10 cm2 将ENC单层细胞重悬于2 mL NCC培养基中，并转移至超低吸附培养板的一个孔内。此操作相当于将一个完整的6孔神经诱导培养板中的细胞全部转移至一个完整的6孔超低吸附培养板中。</li>
	<li>第14天，轻轻摇晃培养板，使小球体聚集于每孔中央。使用1000 μL移液器，沿每孔边缘缓慢以环形方式吸除用过的NCC培养基，注意避免吸走悬浮的球体。</li>
	<li>用原始体积的NCC培养基喂养细胞。</li>
</ol>
6. 外胚层神经诱导
注意：此步骤在图1B中以示意图形式表示。
<ol>
	<li>第15天，采用与第14天相同的技术，轻柔地移除培养基，并用PBS洗涤类球体。尽可能去除PBS，避免损伤类球体。</li>
	<li>加入细胞解离溶液（每cm2孔表面积加入100 μL），在5% CO2、37 °C条件下孵育30分钟，将类球体解离为单细胞。</li>
	<li>使用10 mL血清移液管，向每孔加入等体积的ENC培养基（含10 ng/mL GDNF、100 μM抗坏血酸、10 μL/mL N2补充剂、20 μL/mL B27补充剂、10 μL/mL L-谷氨酰胺补充剂和10 μL/mL MEM非必需氨基酸，在Neurobasal培养基中配制），通过2–3次机械吹打破碎残留的类球体。将细胞转移至50 mL锥形管中。 
	注意：避免因强力吹打或使用尖端开口较小的移液管而造成过度剪切应力和细胞死亡。</li>
	<li>离心细胞（2分钟，290 × g，20–25 °C），小心弃去上清液。使用10 mL血清移液管加入约5–10 mL ENC培养基，上下吹打1–2次，彻底重悬细胞。</li>
	<li>使用台盼蓝染色及细胞计数方法（如血细胞计数板）测定活细胞浓度。 
	警告：台盼蓝为疑似致癌物，请小心操作并妥善处理废弃物。</li>
	<li>加入足够体积的ENC培养基，使接种密度约为每mL 1,000,000个细胞，每cm2表面积接种约300,000–400,000个活细胞。吸除孔板中FN/层粘连蛋白/PBS溶液。 
	注意：根据计划对肠神经元（EN）培养物进行的检测选择合适的板型，因为此步骤为本方案中的最终传代步骤。肠神经元前体细胞可在第15天冻存。使用细胞解离溶液解离类球体后，将前体细胞以约5 × 106个细胞/mL的密度重悬于冻存液（如10% DMSO或Stem-cellbanker）中。需要时，在含5 μM Y-27632 ROCK抑制剂的温热ENC培养基中快速解冻。将细胞接种至目标板型中，数小时后更换为新鲜ENC培养基。</li>
	<li>轻柔地将细胞加入PO/FN/层粘连蛋白包被的孔中。避免气泡滞留在细胞悬液下方，防止细胞无法附着于PO/FN/层粘连蛋白包被表面，尤其是在使用孔径较小的板（如384孔板）时。否则可能导致细胞死亡。</li>
	<li>每隔一天使用ENC培养基（每cm2孔表面积200 μL）换液，持续至第30–40天；此后降低换液频率（每周一次或两次），但加倍换液量（每cm2孔表面积400 μL）。 
	注意：此操作至关重要，因为频繁更换培养基可能促进神经元培养物从孔表面脱落。为前瞻性防止脱落，尤其是长期培养时，建议每周在ENC培养基中补充纤连蛋白（FN，2 µg/mL）和层粘连蛋白（laminin，2 µg/mL）。</li>
</ol>

Derivation of Enteric Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述的分化方案提供了一种可靠的方法 体外 在30-40天内从人多能干细胞获得肠神经元的方法（图1E) 以及在较老的培养物中表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和 SOX10 的肠胶质细胞&#62; 第55天13,14,19,22这些神经元和胶质细胞是通过将人多能干细胞（hPSCs）逐步分化为迷走神经和肠神经嵴细胞，进而诱导为肠神经元和胶质细胞前体而获得的。13,14神经嵴细胞表达神经嵴标志物，即转录因子 AP-2 alpha 和 AP-2 beta，分别为 TFAP2A 和 TFAP2B21我们先前已证明，CD49 可作为标记物用于指示人多能干细胞来源的神经嵴细胞的分化效率14该方法的效率与成功率取决于多种因素的综合作用。首先，所有操作步骤必须在无菌条件下进行至关重要。对人多能干细胞（hPSC）培养物进行支原体污染检测非常重要，因为支原体污染会不利影响干细胞的生长，且无法通过肉眼观察发现。其次，使用均匀且正确包被的培养板可降低hPSC培养出现不均一生长以及神经嵴（NC）培养物和较老神经元从孔板表面脱落的风险。第三，为了实现高效的分化，起始所用的hPSC细胞必须具有多能性且完全未分化。hPSC克隆在克隆边缘应尽可能少地出现分化细胞。当克隆体积较大，或在相差显微镜下观察到克隆中心开始增厚或颜色变深时，应进行传代或接种以启动分化。不需要的分化细胞（通常为间充质样细胞）不仅会降低整体分化效率，还可能导致随着培养时间延长，神经元从孔板表面脱落。因此，建议在前15天内密切监测早期神经嵴（ENC）培养物。在高效分化条件下，约第6天时培养表面会出现深色圆盘状结构，提示在第12至15天时已形成高效的类球体。此外，在类球体阶段（第12–15天），悬浮的球状结构表面应光滑图1D在第12至15天维持3D球状体阶段，通常足以提高肠神经嵴细胞（ENC）的纯度，以利于后续培养物向肠神经嵴谱系的分化。然而，对于需要早期且高纯度ENC前体细胞群体的研究，建议使用CD49D进行荧光激活细胞分选（FACS）。CD49D是SOX10:hPSC来源的神经嵴谱系特异性表面标志物，已在多种细胞系中成功应用。13,14有关使用FACS分离CD49D+细胞的更多信息以及设门策略的建议，请参阅Barber等人的论文中的图2D、框1及补充图6。14第四，为了最大化效率，hPSC 细胞的分化应在其呈单层且汇合度约为 80% 时开始。这意味着在第 2 天时培养物应达到完全汇合。汇合度过低会负面影响分化效率，而过于密集的培养物则细胞死亡率较高，并可能促使不需要的分化细胞出现。
第15天重新接种细胞是本方案中的一个重要步骤。这是单层神经元培养的最后一次细胞传代，因此应根据计划进行的实验来选择培养板的布局。接种至每孔的细胞数量会显著影响神经元的多样性以及仍附着于孔表面的老化神经元数量。通常，每平方厘米接种250,000–350,000个细胞的密度较为适宜2 （每96孔板每孔约75,000–100,000个细胞，或每24孔板每孔500,000–700,000个细胞）较为理想。从第30–40天开始，可考虑在培养基中添加纤连蛋白和层粘连蛋白（每周不超过一次），以预防神经元脱落，特别是对于计划进行长期神经元培养的细胞。此时&#160;建议将喂养频率减少至每5-7天一次，并在添加新鲜培养基前保留部分原有培养基。这有助于降低对神经元突起造成不必要的物理应激。考虑到培养基蒸发（尤其是培养板边缘孔）的影响，可从每孔中移除75 µL培养基，并添加100 µL新鲜培养基。根据经验，生长在聚合物盖玻片底成像培养板上的细胞培养物往往存活时间更长，且更牢固地附着于孔表面。因此，对于需要极长时间神经元培养的实验（例如与其他细胞类型的共培养），建议使用聚合物盖玻片底成像培养板。尽管经空气干燥的PO/FN/层粘连蛋白包被培养板仍可能实现有效的分化，但本实验方案未对此进行系统性验证。因此，建议使用新鲜包被的培养板。
本方案基于 Barber 等人先前发表的方案14与使用含血清替代因子（如KSR）培养基的传统ENC诱导方法相比13,14目前的方案所使用的培养基成分是化学成分明确的。这种条件有利于实现更一致的分化，并可通过调控培养条件开展更精确的发育研究。该方案具有良好的稳健性，可从多个独立的诱导性多能干细胞系和胚胎干细胞系（如 H9、UCSF4 和 WTC11）中稳定地诱导生成肠神经元培养物。本方案的一个显著优势在于能够生成多种类似于人体肠神经系统中存在的肠神经系统神经元亚型。例如，可通过流式细胞术和荧光成像检测不同肠神经系统神经化学表型特异性标志物的表达情况图1F，）。典型情况下，源自人多能干细胞的肠神经元群体中，一氧化氮合酶1（NOS1）阳性细胞比例为5%–20%；胆碱乙酰转移酶（CHAT）阳性细胞比例为40%–60%；γ-氨基丁酸（GABA）阳性细胞比例为15%–30%；5-羟色胺（5-HT）阳性细胞比例为15%–30%。然而，这些指标在多大程度上 体外 这些亚型之间的结构与功能连接性被准确建模 体内 细胞网络仍需进一步研究。此外，对单个亚型进行单细胞分析以扩展其转录谱，不仅有助于更准确地比较 体内 和 体外 细胞身份的鉴定不仅有助于发育和分子研究，还将推动未来针对药物发现和再生医学中特定亚型富集的方案优化。
尽管培养物中含有不同类型的神经元，且在较老的培养物中还含有胶质细胞，但该方案不会生成自然存在于其中的其他细胞类型 体内 肠神经系统（ENS）的微环境，例如肌肉细胞、上皮细胞和免疫细胞。研究ENS在健康与疾病状态下与这些细胞类型的相互作用，需要投入优化共培养体系和肠道类器官系统。总体而言，一种强大的方法是从人多能干细胞（hPSCs）生成ENS的不同亚型 体外 在此描述。可扩展的培养体系适用于人类肠神经系统发育研究、毒理学检测以及疾病建模实验，旨在开发药物疗法并提供可用于治疗肠神经病变的可移植细胞。

肠神经系统（ENS）是周围神经系统中最大的组成部分。ENS 包含超过 4 亿个位于胃肠道内的神经元，几乎控制着肠道的所有功能1对肠神经系统（ENS）发育、功能及其在肠神经病变中缺陷的分子机制的理解，需要获得可靠且真实的肠神经元来源。人类原代组织的获取受限，而动物模型在许多肠神经病变中无法重现关键的疾病表型。人类多能干细胞（hPSC）技术已被证明在提供所需细胞类型方面具有极大优势，尤其是对于那些难以从原代组织中分离的细胞类型，可实现无限供应。2,3,4,5,6,7. 本文详细介绍了逐步且稳健的方法 体外 从人多能干细胞（hPSCs）获取肠神经元培养物的方法。这些可扩增的hPSC来源培养物为发育研究、疾病建模和高通量药物筛选提供了新途径，并可为再生医学提供可移植细胞。
肠神经元谱系起源于胚胎发生过程中肠神经系统（ENS）发育通路的神经嵴（NC）细胞。在胚胎中，神经嵴细胞出现在折叠的神经板边缘。这些细胞增殖、迁移，并分化为多种不同类型的细胞，包括感觉神经元、施万细胞、黑色素细胞、颅面骨骼细胞以及肠神经元和胶质细胞8,9,10。细胞命运的决定取决于神经嵴细胞所来源的前后轴位置，即颅部神经嵴、迷走神经嵴、躯干神经嵴和骶部神经嵴。肠神经系统由迷走神经嵴和骶部神经嵴细胞发育而来，其中迷走神经嵴细胞因沿肠管全长广泛迁移并定植于肠道，构成了肠神经元的主体11。
从多能干细胞（PSCs）诱导神经嵴细胞（NC细胞）通常需要联合使用双抑制SMAD通路和激活WNT信号通路12,13。直到最近，所有NC细胞诱导方案均依赖于含有血清及其他动物源性添加物的培养条件。化学成分未定义的培养基不仅降低了NC细胞诱导的可重复性，也阻碍了发育机制的深入研究。为克服这些问题，Barber等14开发了一种在化学成分明确的培养条件下进行NC细胞诱导的方案，相较于依赖血清替代物（如KSR）的其他方法具有明显优势13,14。该方案通过更换基础培养基并优化Fattahi等先前提出的从人多能干细胞（hPSCs）诱导肠源性神经嵴细胞的流程而实现。这一改进后的体系构成了本文所呈现的hPSC分化方案的基础。该方案首先通过精确调控BMP、FGF、WNT和TGFβ信号通路以及添加视黄酸（RA），在15天内诱导生成肠源性神经嵴（ENC）细胞。随后，通过施加胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）进一步诱导获得肠神经系统（ENS）谱系细胞。所有培养基成分均为化学成分明确的物质，可在30至40天内稳定获得肠神经元培养物。
除了本文所述的单层细胞培养系统外，已有其他神经嵴诱导方法被开发出来，这些方法采用悬浮培养的类胚体15,16。研究表明，这些培养体系中的迁移细胞可表达神经嵴标志物，其中一部分代表迷走神经嵴。通过与原代肠道组织共培养，可富集这些体系中的肠源性神经嵴前体细胞。这些研究中使用的培养基包含多种因子的组合，如神经生长因子、NT3 和脑源性神经营养因子。目前尚不完全清楚这些因子如何影响肠神经元前体细胞的命运决定。要对单层培养与类胚体培养体系中的肠源性神经嵴诱导效率进行有效比较，还需更多数据支持。鉴于这两种策略的培养体系存在差异，应根据具体应用目的对每种方法进行考量和优化。
本文所述方案具有可重复性，我们及他人已使用不同的人多能干细胞（诱导性和胚胎性）系成功验证过该方案8,14,16。

<table><tbody><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（无血清，不含维生素A）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质，Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A14133-2</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养离心机</td><td>Eppendorf，型号 5810R</td><td>02262501</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离液，Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>锥形管</td><td>USA scientific</td><td>1475-0511, 1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>分化基础培养基，Essential 6</td><td>Life Technologies</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 无谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>无饲养层hPSC维持培养基，Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;D systems</td><td>233-FB/CF</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>人多能干细胞，H9 ESC</td><td>WiCell</td><td>RRID: CVCL_1240</td><td></td></tr><tr><td>具有湿度、温度和CO2控制的培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Herralcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1300系列 II级A2型</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Cultrex</td><td>3400-010</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺添加剂，Glutagro</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>多孔板，Falcon</td><td>BD</td><td>353934, 353075</td><td></td></tr><tr><td>N-2添加剂</td><td>CTS</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS（无钙镁）</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头填充器</td><td>Eppendorf</td><td>Z768715-1EA</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>USA scientific</td><td>1111-2830</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E, 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>PO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>聚合物盖玻片底成像板，ibidi</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R&amp;D systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二盐酸盐</td><td>R&amp;D systems</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

从人多能干细胞分化出肠神经系统谱系

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

人类肠神经系统（ENS）是一个由多种胶质细胞和神经元细胞构成的庞大网络，具有显著的神经递质多样性。ENS 控制肠道蠕动、酶的分泌以及营养物质的吸收，并与免疫系统和肠道微生物组相互作用。因此，ENS 的发育性或获得性缺陷可导致多种人类疾病，并可能参与帕金森病症状的发生。由于动物模型系统的局限性以及获取原代组织的困难，对人类 ENS 的研究面临重大的实验挑战。本文提供了一项详细的方案，用于高效 体外 利用定义明确的培养条件，从人多能干细胞（hPSC）诱导生成肠神经系统谱系。本方案在15天内将hPSC定向分化为肠源性神经嵴细胞，并在30天内获得多种功能性的肠神经元亚型。该平台为发育研究、疾病建模、药物筛选及再生医学应用提供了可扩展的资源。

该方案提供了一种在化学成分明确的培养条件下，由人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肠神经嵴及肠神经元的方法（图1A- B）。高质量神经元的生成依赖于高效的肠神经嵴诱导步骤。可通过观察游离球体的形态来直观评估，这些球体应呈圆形、表面光滑，直径约为0.1–0.4 mm，如图所示。 图1C这些类球体还应表达神经嵴标志物SRY-盒转录因子10（SOX10）。17,18，如图所示 图1D在肠神经元诱导阶段，神经突起最早可在第25-30天可见图1E）。然而，在分化效率较低且含有不期望的间充质细胞污染的情况下，这一过程可能会延迟。人类肠神经系统由表达不同神经递质的多种神经元组成。这种异质性在体外分化模型中得以重现。 体外 根据所提供的方案，可通过细胞染色方法（如免疫荧光成像和流式细胞术）按照先前描述的方案评估关键标志物的表达13,14,19,20,21 (图1F，G).
<img alt="神经分化时间线、化合物给药以及荧光显微镜；流式细胞术分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66133/66133fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：从人多能干细胞（hPSCs）衍生人肠神经嵴细胞及肠神经元亚型。（A）由hPSC诱导肠神经嵴（ENC）细胞。方案（第0-12天），显示从hPSCs衍生ENC细胞所用的培养基组成。（B）ENC细胞聚集成球及从ENC细胞诱导肠神经元。方案（第12-15天），显示ENC细胞成球所用的培养基组成。随后，通过含GDNF和AA的培养基处理，生成并成熟肠神经元。（C）在不同分化时间点，正在分化的hPSCs的代表性相差图像。比例尺：1000 µM。（D）第14天，来源于SOX10::GFP表达的H9诱导多能干细胞（iPSC）的ENC细胞球。比例尺：1000 µm。（E）第33天神经元的相差图像。比例尺：400 µm。（F-G）第40天神经元中神经递质标志物的免疫荧光成像（F）和流式细胞术分析（G）。比例尺：50 µm。缩写：BMP4 = 重组人BMP4蛋白；RA = 视黄酸；FGF2 = 重组人碱性成纤维细胞生长因子；GDNF = 重组人胶质细胞系源性神经营养因子；AA = 抗坏血酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66133/66133fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

从人类多能干细胞（hPSC）中诱导生成肠神经系统（ENS）谱系细胞，为研究ENS的发育与疾病以及再生医学应用提供了可扩展的细胞来源。本文详细描述了一种 体外 利用化学成分明确的培养条件从人多能干细胞分化出肠神经元的方案

人类肠神经系统（ENS）是由多种胶质细胞和神经元细胞构成的庞大网络，具有显著的神经递质多样性。ENS 控制……

本文提供了一种在完全明确的条件下，由人类多能干细胞生成人类肠神经元的方法。我们利用这些细胞来研究人类肠神经系统的发展及其功能。我认为，人类肠神经系统的发育、生理学及病理生理学研究一直面临巨大挑战，其原因在于肠神经系统细胞的稀有性、神经嵴前体细胞的短暂存在特性，以及组织获取和分离的困难。这是一种从人多能干细胞（HPSCs）生成真实且具有功能的人类肠神经元的可靠平台。通过克服长期以来在组织获取方面的技术难题，该平台可提供可扩展培养的肠神经系统组分，用于疾病建模、药物发现以及肠神经系统发育与功能的研究。为诱导神经嵴形成，按每平方厘米孔表面积加入200微升培养基A，替换人多能干细胞培养物中的维持培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两天。轻轻吸去含有100%汇合细胞的孔中的培养基。然后根据孔表面积，每平方厘米加入约200微升的B培养基。在第四天，按每平方厘米孔表面积加入200微升B培养基，对细胞进行换液。将细胞继续培养两天后，弃去B培养基，更换为每平方厘米孔表面积400微升的C培养基。首先，取已进行神经嵴诱导的第12天人多能干细胞培养物。轻柔地吸除细胞中的C培养基。每平方厘米孔表面积加入 100 微升 PBS 洗涤细胞，然后移除 PBS。向细胞中加入等体积的细胞解离溶液，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。向培养板中加入等体积的 NCC 培养基。然后使用刻度移液管收集细胞悬液，并转移至15毫升锥形管中。在20至25摄氏度条件下，以290 ×g离心2分钟。小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。使用10毫升血清移液管将12毫升NCC培养基加入细胞沉淀中。通过反复吹打使沉淀悬浮，形成均匀的细胞悬液。随后将细胞悬液转移至超低吸附培养板中。第14天，轻轻摇晃细胞培养板，使小型类球体聚集在每个孔的中央。使用P1000微量移液器从每个孔的边缘缓慢吸除废弃培养基。用原始体积的NCC培养基重新更换培养液。第15天，小心移除培养基。向孔中加入PBS以洗涤类球体，然后尽可能吸除PBS，注意避免扰动类球体。接下来，按每平方厘米孔表面积加入100微升细胞解离液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。使用10毫升血清移液管，向每孔加入与解离液体积相等的ENC培养基。使用移液器机械吹打溶液，以破坏任何残留的球状体。然后将细胞转移至50毫升锥形管中。离心后弃去上清液，操作同前。然后将细胞重悬于5至10毫升ENC培养基中。使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞浓度。现在，加入足量的ENC培养基，使每平方厘米培养面积接种约30万至40万个活细胞，细胞密度约为每毫升100万个细胞。然后吸出孔中的溶液。接着将细胞接种至含有PO/FN层粘连蛋白包被孔的培养板中。每隔一天补充一次培养基，每平方厘米孔表面积加入200微升ENC培养基，持续培养至第30至40天。神经嵴诱导后观察到表面光滑的高质量悬浮球状结构。这些球状体表达神经嵴标志物SOX10。在肠神经元诱导期间，第25至30天观察到神经突起的生长。

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科研

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利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

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源自人多能干细胞（hPSC）的神经嵴（NC）细胞在模拟人类发育与疾病以及细胞替代治疗方面具有巨大潜力。本文介绍了一种目前广泛使用的无饲养层改良方法in...

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