环氧树脂包埋后关联光学与电子显微镜技术

相关光镜与电镜技术是一种完全稳定的显微技术，能够结合荧光显微镜提供的定位信息和电镜提供的超微结构信息。然而，该技术的主要挑战在于如何在电镜样品制备后仍保持荧光信号或荧光探针的活性。利用这种荧光蛋白，我们可以在透射电镜下实现环氧树脂包埋后的荧光相关光镜成像，从而同时保留荧光信号与超微结构。

首先，取一块小鼠脑组织，将其表面修整成直角梯形。使用超薄切片机配合金刚石刀，切成厚度为100纳米的切片。从切片带中分离出单个切片，放入水浴中漂浮。

在镀有金纳米颗粒的盖玻片中央加入一滴双蒸水。用样品环挑取一片组织，将其翻转并置于水滴表面。移除样品环，使组织片留在水滴表面。

然后使用记号笔，在盖玻片另一侧的切片周围画出一个环形区域。首先，取一片表达 mScarlet 的小鼠脑组织超薄切片。在盖玻片上的超薄切片处加入 10 微升封片缓冲液，并将一片新的洁净盖玻片置于封片缓冲液上。

将两张带有超薄切片的盖玻片放入成像室中。在倒置荧光显微镜的明场成像模式下，利用环形标记定位切片，并移动至切片的一个角落。打开白光，采集明场图像。

然后关闭白光，启动激光器，采集同一视野的荧光图像。关闭激光器后，移动至相邻视野，重叠区域约为10%。采集第二个视野的明场和荧光图像，并记录成像路径，以便拼接视野。

现在，使用导航图定位目标细胞。激活激光器，采集目标细胞的300帧荧光图像，然后关闭激光器。

随后，打开白光光源，采集约100张连续的明场图像。为准备用于电子显微镜的切片，用双蒸水充满一个玻璃瓶。从成像室中取出载玻片，用镊子夹取超薄切片，并将其分离。

用盖玻片压紧切片，用双蒸水洗去封片缓冲液，并使其干燥。使用单面刀片在超薄切片周围划出井字刻痕。

在刻痕的每个角落滴加 10 微升 12% 氢氟酸。缓慢将盖玻片放入水中，随后使带状薄膜和超薄切片漂浮于水面。

将未包被的载网置于切片上，使切片位于载网中心。用石蜡膜覆盖载玻片。用镊子夹取带有切片的载网，于室温下晾干。

首先，获取表达 mScarlet 的小鼠脑组织的明场和荧光图像。在 ImageJ 中定位原始数据，利用不同视野的多张明场图像创建导航图。然后打开 ImageJ，依次进入插件菜单，点击拼接（stitching），选择网格或图像集拼接（grid or collection stitching）。点击类型选择网格（grid），按列蛇形排列（snake by column）。

选择“上”和“左”为顺序，然后单击“设置切片大小”。导航以选择数据路径，单击“设置文件名”，然后勾选“显示融合”。要导入特定细胞的连续明场图像，请单击“文件”并选择“导入”，然后选择图像序列。

对于这些图像的总强度投影，请转到图像，选择堆栈，点击Z投影，然后点击“求和切片”。接着选择编辑，点击反相，以反转总强度投影图像并增强金纳米颗粒的可见性。接下来，导入序列荧光图像。

要创建强度总和投影图像，请点击图像并选择图像栈。然后进入Z轴投影，点击“sum slices”（总和切片）并以TIFF格式保存图像。打开明场和荧光图像的强度总和投影图像。

转到图像，选择颜色，然后单击“合并通道”，将明场图像的总强度投影与荧光图像合并。随后，选择图像并单击“类型”，接着选择“RGB颜色”，将复合图像的格式转换为RGB。金纳米颗粒将显示为绿色，荧光蛋白将显示为红色。

然后将图像保存为TIFF文件。首先，打开配准软件并搜索EasyClemv0。找到后，点击EasyClemv0，点击“image”或“sequence”，选择“open”以导入电子显微镜图像以及明场与荧光图像的复合图像。

在 EasyClemv0 界面中，单击 2D XYT 以选择非刚性 2D 或 3D 作为配准模式。在 EasyClemv0 窗口中，单击“选择待变换和调整大小的图像”右侧的下拉框（通常为 FM），选择复合 RGB 彩色 TIFF；然后单击“选择不进行修改的图像”右侧的下拉框（通常为 EM），选择六通道图像 TIFF。单击“开始”以启动配准过程。

在电子显微镜图像窗口的六通道图像TIFF中，单击一个金纳米颗粒以在其上放置第一个点。在荧光显微镜图像窗口的复合RGB彩色TIFF中，单击对应的金纳米颗粒以在其上放置第一个点。然后单击“更新变换”以确认荧光显微镜与电子显微镜信号中金纳米颗粒的对齐，并通过单击“停止”完成配准。

要导出包含四个通道图像的对齐图像堆栈，请单击叠加图像，选择图像或序列，然后单击“另存为”。接着打开图像 J，单击“文件”，选择“打开”以导入叠加图像。转到“图像”菜单，单击“堆栈”，然后选择“堆栈转图像”以将图像分离为四个通道图像。

随后，选择图像并点击颜色，然后选择合并通道，将三个通道合并为一幅复合图像。要将复合图像转换为相关光镜和电镜图像，请选择图像，然后选择类型并点击RGB颜色。