利用成人人类成纤维细胞制备心脏细胞外基质用于培养皿包被

在本实验方案中，我们描述了一种可行的方法，用于在体外获取心脏细胞外基质，作为研究相同基质相互作用以及心肌特异性细胞外基质对心肌细胞影响的基底材料。目前的研究重点集中在开发由仿生材料制成的生物工程三维支架，这类材料可用于接种细胞。此类材料似乎可为细胞提供生物力学和空间信号提示。

细胞外基质的组成通过双向信号连接对细胞产生深远影响，导致基质组成和细胞行为持续发生改变。目前尚缺乏能够模拟生理或病理条件下典型心脏微环境的体外模型。若能在体外重现这些细胞-基质相互作用，将有助于更深入地理解其机制，从而显著改进用于组织工程与再生的仿生支架的设计。

首先，将新鲜的人心耳样本置于含有无菌 HBSS 的 100 毫米玻璃培养皿中进行清洗。轻轻晃动培养皿中的样本，以去除残留的血液。将样本转移至另一个已加入少量 HBSS 润湿的 100 毫米培养皿中。

用交叉的手术刀将样品切成约两毫米见方的小块。随后，将四个小的心肌碎片转移至35毫米培养皿中。在碎片上放置一片无菌盖玻片，并施加轻柔压力。

用移液器将1.5毫升DMEM加入培养板中。然后将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。当细胞培养达到85%融合度时，从孵育箱中取出培养板，使用无菌镊子提起盖玻片。

然后将其倒置放入一个新的35毫米培养皿中，加入无菌PBS冲洗。现在去除心肌组织碎片，再用移液器将DMEM从培养皿中吸出。

使用无菌 PBS 清洗含有长满细胞的培养皿。弃去清洗液后，向每块培养皿中加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 5 分钟。孵育结束后，将培养皿从孵育箱中取出，用显微镜观察以确认细胞是否已脱落。

接下来，向每个培养板中加入两毫升胰蛋白酶终止液（TSS），以阻断胰蛋白酶消化作用。将细胞悬液转移至无菌的15毫升离心管中，在4摄氏度下以400 × g离心5分钟。

使用5 mL血清移液管吸除上清液。然后向沉淀中加入3 mL DMEM并重悬。将细胞悬液接种至60 mm培养皿中。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。随后，用移液器向每个60毫米培养皿中加入三毫升无菌的0.2%明胶溶液。孵育后，吸除溶液，并加入三毫升无菌PBS，待后续使用。

将含有心肌成纤维细胞的培养板从培养箱中取出。移除培养板中的DMEM，用无菌PBS洗涤。弃去洗涤液后，向每块培养板中加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。

使用显微镜确认细胞脱落。随后，向每块培养板中加入 2 毫升 TSS 以终止胰蛋白酶消化，将细胞悬液转移至无菌的 15 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 400 ×g 离心 5 分钟。

使用5 mL血清移液管吸除上清液。然后向沉淀中加入3 mL DMEM并重悬细胞。从60 mm明胶包被的培养皿中移除PBS，将细胞悬液加入该培养皿中。

将成纤维细胞以汇合状态培养至多21天。培养21天后，吸除培养基，然后用3毫升PBS洗涤培养板。

吸除 PBS 后，加入一毫升脱细胞溶液，然后在倒置相差显微镜下观察培养板。两分钟后，轻轻加入四毫升 PBS 以稀释培养板中的脱细胞溶液。吸除稀释后的溶液，再用 PBS 轻柔地冲洗培养板。

最后，向培养板中加入一毫升 PBS。将包被有细胞外基质的培养板于 4°C 保存，直至后续使用。将原代心肌组织的小片段置于培养中后，可在 3 至 5 天内观察到成纤维细胞从组织块中生长出。

脱细胞处理导致血小板表面形成细胞外基质涂层。由于脱细胞作用，体外生成的心脏细胞外基质的组成和结构得以保留。