Name: 从成人成纤维细胞中生产心脏细胞外基质，用于培养皿包被 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习从成人心脏成纤维细胞中制备心脏细胞外基质的方法，用于培养皿包被以研究细胞与基质相互作用。该技术为心脏组织工程和再生医学研究提供了重要的体外模型。

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心脏组织取自因缺血性心肌病导致终末期心力衰竭而接受心脏移植的患者。所有用于实验的标本均在患者知情同意且不包含患者身份信息的情况下采集，采集过程遵循意大利那不勒斯费德里科二世大学伦理委员会批准的方案，并符合《赫尔辛基宣言》中规定的原则。本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列于材料表中。
1. 实验准备
<ol>
	<li>准备无菌器械/装置：一把大型手术剪、两套精细镊子、两把显微解剖剪、一个1 L无菌瓶、一个500 mL无菌瓶和一个250 mL无菌瓶。</li>
	<li>用70%乙醇对22 mm × 22 mm盖玻片消毒数秒。使用10 mL移液管吸除乙醇，将盖玻片置于37 °C烘箱中干燥，随后在高压灭菌器中灭菌。</li>
	<li>将市售粉末状盐溶解于无菌双蒸水中。在1 L无菌瓶中加入0.35 g碳酸氢钠粉末，配制pH为7.4的1 L Hank's平衡盐溶液（HBSS）。在无菌操作台中使用0.22 µm滤膜过滤灭菌，4 °C保存备用。</li>
	<li>称取0.1 g磷酸二氢钾、4.0 g氯化钠、0.1 g氯化钾和0.575 g磷酸氢二钠，用于配制500 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将各组分溶解于无菌双蒸水中，检测pH值（7.4）。在无菌操作台中通过过滤灭菌，4 °C保存备用。</li>
	<li>向45 mL HBSS中加入5 mL胎牛血清（FBS），配制终体积为50 mL的胰蛋白酶终止液（TSS）。4 °C保存备用。</li>
	<li>量取223.75 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），加入25 mL FBS（终浓度10%），再加入1.25 mL青霉素-链霉素溶液（pen/strep，终浓度0.5%），配制用于成纤维细胞分离与培养的DMEM。4 °C保存备用。</li>
	<li>将0.2 g猪皮来源的明胶粉末加入100 mL PBS中，配制0.2%（w/v）明胶溶液。 
	注：本研究中所用各溶液的组分及相应浓度详见表1。</li>
</ol>
2. 通过心房心肌组织碎片外植法原代培养人源心脏成纤维细胞
注意事项：步骤 2.2–2.3 应在无菌条件下进行。该方案已针对直径约 0.3 cm 的心房组织样本进行验证，此尺寸为活检标本的典型大小，可分离出约 2 × 106 个成纤维细胞。
<ol>
	<li>将新获取的右心耳组织样本置于100 mm玻璃培养皿中，用无菌HBSS洗涤，并轻轻振荡以去除血液。每洗一次更换HBSS和培养皿，共重复此步骤三次。</li>
	<li>将组织样本转移至预先加入少量HBSS润湿的100 mm培养皿中，用交叉手术刀将其切碎成约2 mm的立方体。</li>
	<li>取四小块心肌组织置于35 mm培养皿中，使其位置大致对应于22 mm × 22 mm盖玻片的四个角，并将无菌盖玻片覆盖在组织块上，轻压固定，然后加入1.5 mL DMEM培养基。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养约15天，或直至细胞达到85%融合度；每天在倒置相差显微镜下观察细胞的迁移生长情况，并每3天更换一次培养液。</li>
</ol>
3. 通过温热胰蛋白酶消化法传代培养人源心肌成纤维细胞
注意事项：以下步骤必须在无菌条件下进行。由于成纤维细胞可从外植组织迁移至盖玻片和培养皿表面，建议在首次传代时对二者同时进行处理。
<ol>
	<li>用精细的无菌镊子提起盖玻片，将其倒置放入新的35 mm培养皿中，并用无菌PBS冲洗。</li>
	<li>去除心肌组织碎片，弃去，并用无菌PBS冲洗含有贴壁细胞的35 mm培养皿。</li>
	<li>弃去PBS，向每个培养皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。在显微镜下确认细胞脱落情况。细胞应完全变圆并脱落，形成小团块。</li>
	<li>通过向每个35 mm培养皿中加入2 mL TSS终止消化反应，将细胞悬液收集至无菌15 mL离心管中，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>用5 mL移液管吸除上清液，将沉淀重悬于3 mL DMEM培养基中，并将细胞悬液转移至60 mm培养皿中。</li>
	<li>将获得的细胞在3 mL DMEM培养基中进行第一代（或传代1）培养，置于37 °C、5% CO2培养箱中，每三天更换一次培养基，直至细胞达到75%融合度。</li>
	<li>对达到75%融合度的成纤维细胞进行传代，重复温热胰蛋白酶消化处理，并以1:3比例将细胞分种至新的60 mm培养皿中，最多传代两次（第2代和第3代）。</li>
</ol>
4. 细胞外基质沉积
<ol>
	<li>通过向每个60 mm培养皿中加入3 mL无菌的0.2%明胶溶液，并在37 °C孵育2 h，制备明胶包被的培养皿；然后吸除溶液，每皿加入3 mL无菌PBS，待用。</li>
	<li>用预热的胰蛋白酶消化法分离心肌成纤维细胞，并以高密度（15 × 103 个细胞/cm2）接种于60 mm明胶包被的培养皿中进行传代培养。</li>
	<li>将成纤维细胞培养至融合状态，最长培养21天，以促进细胞外基质的合成与沉积。每3天更换50%新鲜培养基。</li>
</ol>
5. 细胞外基质去细胞化
注意：步骤 5.3-5.4 应在轻柔振荡条件下进行，仅使细胞脱离，而不使细胞外基质脱落。
<ol>
	<li>配制去细胞化溶液，其中包含 0.25% Triton X-100 和 10 mM NH4OH 的 PBS 溶液（根据每 60 mm 培养皿需 1 mL 的比例计算最终体积）。</li>
	<li>移除培养基，并用 PBS 清洗培养皿，弃去清洗液。</li>
	<li>加入 1 mL 去细胞化溶液，并在倒置相差显微镜下观察培养皿；1–2 分钟后，当细胞不再可见时，轻轻加入 4 mL PBS 以稀释去细胞化溶液。</li>
	<li>移除稀释后的溶液，并用 PBS 轻柔地清洗培养皿；弃去清洗液。</li>
	<li>加入 1 mL PBS，将带有细胞外基质（ECM）的培养皿置于 4 °C 保存，以备后续使用。</li>
</ol>

Generation of Myocardium-Mimicking Extra Cellular Matrix for Cell Culture

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从人心脏样本中分离的成纤维细胞培养21天至汇合，以合成并沉积细胞外基质，形成牢固附着于培养板表面的致密层。随后去除心脏成纤维细胞，同时保留沉积的心脏细胞外基质，从而制备出用于研究心肌特异性细胞外基质对心脏组织内其他细胞影响的基质材料。
利用天然且具有组织特异性的基质进行体外细胞培养的概念引起了生物学家的广泛关注，促使研究人员多次尝试使用从新生动物心脏中分离的成纤维细胞来开发此类基质。早在1996年，Vanwinkle 等人13 使用新生大鼠心肌成纤维细胞，通过EDTA（一种钙螯合剂）分离细胞，从而在玻璃盖玻片上制备细胞外基质包被。最近，EDTA已被与低浓度的Triton X-100碱性溶液联合使用。14钙离子介导细胞与细胞外基质之间以及不同细胞外基质分子之间的相互作用15然而，使用此类螯合剂可能导致基质蛋白 unfolding 以及其不同纤维和无定形组分间相互作用的丧失，不可避免地改变所获得的心脏 ECM 体外根据我们的经验，使用0.5 mM EDTA孵育需要较长时间，直到2小时后在倒置相差显微镜下才可观察到细胞脱落的初步迹象。
一种类似的方法用于 体外 脱细胞化由 Hellewell 等人发表。16 然而，在本方案中，使用了较低浓度的氢氧化铵（10 mM，而非20 mM），并添加Triton X-100作为脱细胞试剂。尽管上述方案的作者已在三种 commercially available 的细胞类型中测试了其应用，但未包括原始的心脏成纤维细胞。鉴于长期以来获取和培养成人人心肌细胞或心脏成纤维细胞存在困难 体外，此处的重点是心脏组织和细胞，这些是心血管研究团队和心血管再生医学领域主要关注的对象。该溶液也可能适用于其他类型的细胞。
虽然变性对于蛋白质溶解是必要的，但为了定量和定性地保存细胞外基质成分以用于后续的体外实验，使用非变性脱细胞试剂至关重要。因此，采用Triton X-100代替SDS去除成纤维细胞，从而在培养皿表面保留完整的 cardiac ECM 涂层。用Triton X-100的碱性溶液孵育可诱导细胞膜通透化和细胞裂解，进而实现成纤维细胞的去除。如果存在细胞核碎片问题（例如，后续实验需要进行细胞转染或核酸分子分析），可在将其他细胞接种到 cardiac ECM 上之前，使用DNase I降低DNA含量。
该方法最显著的优势在于能够获得与人类心脏结构和功能相关的不同状态下典型的心脏细胞外基质（ECM），因为这些变化条件会影响相同的成纤维细胞 体内 沉积细胞外基质 体外因此，培养皿中由成纤维细胞衍生的包被成分会根据 体内 心脏来源成纤维细胞的活性，从而允许在多种正常与病理条件下对细胞-基质功能相互作用进行后续研究17,18.
尽管刺激成纤维细胞活性可能具有吸引力 体外 通过添加已知可促进胶原蛋白和糖胺聚糖生成的抗坏血酸，这种选择性刺激应予避免，因为它可能改变所获得的心脏细胞外基质组成，使其趋向纤维化表型19相反，根据研究目的，可影响心脏细胞外基质（ECM）的组成 体外 通过添加血管紧张素肽或肾上腺素等因子20,21，已知在特定心血管疾病的发生机制和病理生理过程中发挥关键作用。
在细胞外基质沉积过程中的关键步骤是，在将成纤维细胞层从培养皿中去除后，仍需保持沉积在培养皿表面的成纤维细胞来源基质的黏附与完整性。与此前所述研究中仅培养数天的新生小鼠成纤维细胞不同，成人人心脏成纤维细胞在融合状态下体外培养可存活长达21天，并持续合成和分泌细胞外基质。必须使用明胶包被的培养皿，并在显微镜下观察成纤维细胞的脱落情况，将脱细胞溶液中的孵育时间缩短至必需的最低限度。
本方案中，提供了一种获取心脏细胞外基质的可行方法 体外 描述了二维单层系统反映了 体内 微环境，这得益于由负责细胞外基质合成与维持的相同细胞（即成纤维细胞）所产生的天然细胞外基质，其组分受到存在于微环境中的生物学信号的影响 体内其他仿生及三维细胞培养基质或系统，如水凝胶、球状体、类器官和三维生物打印方法，已作为模拟策略受到广泛关注 体内 条件，从而能够研究复杂的细胞间及细胞与细胞外基质间的空间相互作用22,23这些方法针对的是空间和生物力学信号 体外 细胞生长与分化24,25，但其在所生成基质的组成和特性方面存在显著局限性，难以模拟天然组织的特性。根据研究范围及其应用需求，可采用二维心脏细胞外基质或三维仿生支架，二者结合可作为一种互补方法，有助于增进对细胞生物学的现有认知，并提升组织再生能力。
局限性 
所述方法存在一定的局限性，特别是涉及旨在去除细胞成分的脱细胞过程。该过程可能会无意中破坏细胞外基质（ECM）的天然结构或组成。然而，来源于正常和病变心脏成纤维细胞的ECM对培养细胞的增殖、凋亡和迁移具有不同的影响11,18，表明该方法至少保留了这些生物学过程的主要决定因素。
类似地，即使主要心脏病理相同，从不同供体获得的心脏细胞外基质（ECM）也可能具有不同的组成。与所有人源样本一样，其变异性可能源于环境因素、遗传决定因素、药物或其他治疗等多种因素26。因此，通过所述方法获得的心脏ECM并不总是具有相同的组成和特性。如果定性可重复性至关重要，则可考虑将分离的成纤维细胞扩增至多两次（如本方案所述），在多个培养皿中制备ECM，或在同一培养皿中使用来自不同供体的成纤维细胞共同产生ECM。

所有细胞均位于 体内 在一种特殊的微环境中，细胞得以存活并执行其特定功能。在任何特定组织中，细胞均被细胞外基质所包围，该基质由纤维状和非纤维状蛋白质以及富含糖胺聚糖的基本物质组成1基质成分的定性与定量变化会影响细胞生物学，调控细胞增殖、凋亡、迁移和分化等过程。因此，研究人员致力于重建这一微环境 体外 不同组织来源细胞的研究2,3.
心肌由心肌细胞和数量更多的成纤维细胞组成，后者在心肌内细胞外基质的生成与维持中发挥关键作用4在人的一生中，细胞外基质的组成会因多种生理和病理因素而发生变化。这些细胞外基质组成的变化对心肌的结构和生物力学特性具有显著影响。5因此，若能重现不同年龄或病理条件下特有的微环境，将有助于理解人类心肌中的细胞-基质相互作用。 体外6,7.
本文所述方法旨在获取用于心肌细胞培养的基质 体外 （称为心肌ECM），模拟心肌细胞外基质 体内.
心血管研究面临特定的挑战，包括难以从活体供体或患者获取样本，以及培养人类心肌细胞的困难8该方法通过从小块人类心肌活检组织中获取心脏成纤维细胞，并培养分离的心脏细胞，解决了上述挑战 体外 在模拟人类心肌组织典型的天然细胞外基质上。
尽管目前的研究致力于开发能够模拟正常心肌生物力学特性的三维支架，所用材料包括人工合成或天然聚合物9，但这些研究往往忽略了在正常和病理条件下细胞与基质之间的相互作用及信号传导。由于心脏细胞外基质（ECM）由来源于人心脏的 cardiac fibroblasts 合成，其成分取决于这些细胞的活性，而细胞活性会随多种生理和病理条件发生变化，从而为研究心脏细胞外基质对心脏细胞生物学的特定影响提供了可能10。
本方案专为人类心脏组织设计，但其科学原理也适用于其他器官，特别是那些再生能力较低、纤维化严重且瘢痕影响整体结构与功能，同时样本数量和尺寸有限的器官。

<table><tbody><tr><td>1 L 实验室瓶&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>无菌，&amp;nbsp;聚苯乙烯</td></tr><tr><td>100 mm 玻璃板&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>经表面处理的无菌细胞培养皿</td></tr><tr><td>15 mL 无菌离心管</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>可离心的无菌离心管，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>22 mm × 22 mm 盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>无菌，&amp;nbsp;聚苯乙烯</td></tr><tr><td>250 mL 实验室瓶&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>经表面处理的无菌细胞培养皿</td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td>无菌，聚苯乙烯</td></tr><tr><td>50 mL 无菌离心管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>可离心的无菌离心管，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>500 mL 实验室瓶</td><td>VWR</td><td>215-1594</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>经表面处理的无菌细胞培养皿</td></tr><tr><td>氢氧化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td>液体</td></tr><tr><td>一次性手术刀片</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>无菌且一次性使用</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>储存于 2–8 &amp;deg;C；避免光照</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。应分装为较小的工作体积</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>VWR</td><td>232-1317</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>商用粉末</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>粉末</td></tr><tr><td>大型手术剪</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>显微解剖剪&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>使用前清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>储存于 -20&amp;deg;C。溶液&amp;nbsp;应分装为较小的工作体积</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>粉末</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5665</td><td>粉末</td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>粉末</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94046</td><td>粉末</td></tr><tr><td>Stericup 滤器</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>无菌且一次性使用的 0.22 mm 滤膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>液体</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。应分装为较小的工作体积</td></tr></tbody></table>

利用成人人类成纤维细胞制备心脏细胞外基质用于培养皿包被

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

心肌由心肌细胞和数量更多的成纤维细胞组成，后者负责细胞外基质的生成。从心脏发育早期直至整个生命周期，在生理和病理条件下，细胞外基质的组成均会发生变化，并影响心肌的结构与功能。本方法的目的是获取用于心脏细胞培养的基质材料 体外 （称为心肌ECM），模拟心肌细胞外基质 体内为此，将从成人人心脏分离的成纤维细胞在明胶包被的培养皿中培养至汇合，以生成心肌特异性的细胞外基质。随后去除心脏成纤维细胞，同时保留沉积的心脏细胞外基质（ECM），从而获得用于研究心肌特异性细胞外基质对其他细胞影响的基质材料。重要的是，成纤维细胞衍生的培养皿包被层的组成会根据 体内 心脏来源成纤维细胞的活性，从而允许在不同正常与病理条件下对细胞-基质相互作用进行后续研究。

将原代心肌组织的小片段置于培养中，3-5天内可观察到成纤维细胞从组织块中生长出来（图1）。
在随后的几天中，成纤维细胞数量持续增加，这可能是由于心脏组织样本中细胞持续迁移生长，以及已迁移的成纤维细胞在培养皿表面增殖所致。不应期望通过手术刀机械解离获得的所有心肌组织碎片在相同时间内产生相同数量的成纤维细胞，因为所得组织碎片的体积和细胞存活率可能存在轻微差异。值得注意的是，已确认具有迁移生长活性的心肌组织碎片可被保留并重新接种，从而可至少用于两次成纤维细胞的分离。
成纤维细胞可进行多次传代培养，以增加可用于后续实验的细胞数量。然而，一旦达到汇合状态，成纤维细胞即停止增殖。 体外 并假设具有合成和分泌活性，沉积细胞外基质。随后的脱细胞处理使培养板表面覆盖一层心脏ECM网状结构。图2在去除成纤维细胞的过程中，必须通过肉眼观察以及使用倒置相差显微镜对培养皿进行视觉监测，以将脱细胞溶液中的孵育时间控制在必要且充分的最短范围内。孵育期间若出现漂浮的膜状物，表明成纤维细胞单层已发生通透化和脱落，此时应立即稀释并移除脱细胞溶液。
成纤维细胞来源的心脏细胞外基质（ECM）的组成取决于成纤维细胞的来源。在我们的实验中，由正常人心脏分离的成纤维细胞与由缺血性心肌病患者心脏分离的成纤维细胞所产生的心脏ECM具有不同的蛋白质含量，并对原始心脏细胞的增殖、凋亡和迁移产生不同的影响11,12尽管在脱细胞过程中细胞外基质蛋白的损失不可避免，但本方案所采用的方法保留了细胞外基质的成分与结构 体外 在很大程度上产生了心脏细胞外基质（ECM）图3).
本方案中使用心房组织，是因为它可以从正常（供体）和病变（受体）心脏中获取。虽然整个病变（受体）心脏可在符合《赫尔辛基宣言》原则并获得当地伦理委员会批准的前提下进行切片并用于研究，但在心脏移植过程中无法从供体心脏获取心室组织样本。因此，如果研究目的是探讨正常与病变状态下心肌组织之间的差异，最佳的样本来源是心房壁。根据其他可用的活性心肌组织来源情况，可采用相同的方案，利用正常或病变心脏的心房或心室壁组织进行心脏细胞外基质（ECM）培养皿包被。
<img alt="显微镜下的细胞培养生长阶段；200 μm 比例尺；显微分析；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：心肌成纤维细胞的分离。 心肌组织碎片在培养4天（A）、8天（B）和12天（C）后成纤维细胞的迁移生长情况。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态变化、显微镜图像、培养研究、200μm比例尺、实验分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：细胞外基质的脱细胞处理。 成纤维细胞在脱细胞溶液中孵育约10秒（A）、20秒（B）、30秒（C）、40秒（D）、50秒（E）和60秒（F）后的形态变化。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肌动蛋白纤维的细胞结构荧光显微镜图像；红色和蓝色染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3脱细胞前后细胞外基质的组成 代表性心脏细胞外基质蛋白的间接免疫荧光染色，包括III型（A，E）和 IV 型（B，F）胶原蛋白，层粘连蛋白（C,G），以及纤连蛋白（fibronectin）D,H)，之前（A-D）以及之后（E-H）成纤维细胞去除。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺：（A-C，E-G) 50 µm; (D,H) 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td colspan="2">溶液组成</td>
			<td>终体积</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td>
			<td colspan="2">市售盐粉 + 双蒸无菌水 + 0.35 g 碳酸氢钠</td>
			<td>1 L</td>
			<td>过滤除菌，4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脱细胞溶液</td>
			<td colspan="2">0.25% Triton X-100 + 10 mM NH4OH + PBS</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>过滤除菌，4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td>
			<td colspan="2">223.75 mL DMEM + 25 mL 胎牛血清 + 1.25 mL 青霉素/链霉素溶液</td>
			<td>250 mL</td>
			<td>4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>明胶溶液</td>
			<td colspan="2">0.2 g 明胶粉末 + 100 mL 磷酸盐缓冲液</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>过滤除菌，4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸盐缓冲液 (1x PBS)</td>
			<td colspan="2">0.1 g 磷酸二氢钾 + 0.1 g 氯化钾 + 4.0 g 氯化钠 + 0.575 g 磷酸氢二钠 + 双蒸无菌水</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>过滤除菌，4 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白酶终止液 (TSS)</td>
			<td colspan="2">5 mL 胎牛血清 + 45 mL Hank's 平衡盐溶液</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>4 °C 保存</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的每种溶液的组分及其相应浓度。

从成人人心脏中分离的成纤维细胞在明胶包被的培养皿上培养至融合，以生成心肌特异性细胞外基质。去细胞化后，该基质可用于其他心肌细胞的培养及细胞-基质相互作用的研究。

心肌由心肌细胞和数量更多的成纤维细胞组成，后者负责细胞外基质的生成。

在本实验方案中，我们描述了一种可行的方法，用于在体外获取心脏细胞外基质，作为研究相同基质相互作用以及心肌特异性细胞外基质对心肌细胞影响的基底材料。目前的研究重点集中在开发由仿生材料制成的生物工程三维支架，这类材料可用于接种细胞。此类材料似乎可为细胞提供生物力学和空间信号提示。细胞外基质的组成通过双向信号连接对细胞产生深远影响，导致基质组成和细胞行为持续发生改变。目前尚缺乏能够模拟生理或病理条件下典型心脏微环境的体外模型。若能在体外重现这些细胞-基质相互作用，将有助于更深入地理解其机制，从而显著改进用于组织工程与再生的仿生支架的设计。首先，将新鲜的人心耳样本置于含有无菌 HBSS 的 100 毫米玻璃培养皿中进行清洗。轻轻晃动培养皿中的样本，以去除残留的血液。将样本转移至另一个已加入少量 HBSS 润湿的 100 毫米培养皿中。用交叉的手术刀将样品切成约两毫米见方的小块。随后，将四个小的心肌碎片转移至35毫米培养皿中。在碎片上放置一片无菌盖玻片，并施加轻柔压力。用移液器将1.5毫升DMEM加入培养板中。然后将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。当细胞培养达到85%融合度时，从孵育箱中取出培养板，使用无菌镊子提起盖玻片。然后将其倒置放入一个新的35毫米培养皿中，加入无菌PBS冲洗。现在去除心肌组织碎片，再用移液器将DMEM从培养皿中吸出。使用无菌 PBS 清洗含有长满细胞的培养皿。弃去清洗液后，向每块培养皿中加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 5 分钟。孵育结束后，将培养皿从孵育箱中取出，用显微镜观察以确认细胞是否已脱落。接下来，向每个培养板中加入两毫升胰蛋白酶终止液（TSS），以阻断胰蛋白酶消化作用。将细胞悬液转移至无菌的15毫升离心管中，在4摄氏度下以400 × g离心5分钟。使用5 mL血清移液管吸除上清液。然后向沉淀中加入3 mL DMEM并重悬。将细胞悬液接种至60 mm培养皿中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。随后，用移液器向每个60毫米培养皿中加入三毫升无菌的0.2%明胶溶液。孵育后，吸除溶液，并加入三毫升无菌PBS，待后续使用。将含有心肌成纤维细胞的培养板从培养箱中取出。移除培养板中的DMEM，用无菌PBS洗涤。弃去洗涤液后，向每块培养板中加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。使用显微镜确认细胞脱落。随后，向每块培养板中加入 2 毫升 TSS 以终止胰蛋白酶消化，将细胞悬液转移至无菌的 15 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 400 ×g 离心 5 分钟。使用5 mL血清移液管吸除上清液。然后向沉淀中加入3 mL DMEM并重悬细胞。从60 mm明胶包被的培养皿中移除PBS，将细胞悬液加入该培养皿中。将成纤维细胞以汇合状态培养至多21天。培养21天后，吸除培养基，然后用3毫升PBS洗涤培养板。吸除 PBS 后，加入一毫升脱细胞溶液，然后在倒置相差显微镜下观察培养板。两分钟后，轻轻加入四毫升 PBS 以稀释培养板中的脱细胞溶液。吸除稀释后的溶液，再用 PBS 轻柔地冲洗培养板。最后，向培养板中加入一毫升 PBS。将包被有细胞外基质的培养板于 4°C 保存，直至后续使用。将原代心肌组织的小片段置于培养中后，可在 3 至 5 天内观察到成纤维细胞从组织块中生长出。脱细胞处理导致血小板表面形成细胞外基质涂层。由于脱细胞作用，体外生成的心脏细胞外基质的组成和结构得以保留。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。...

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