利用3D打印细菌研究其在复杂三维多孔介质中的运动性与生长

细菌广泛存在于复杂的三维多孔环境中，例如生物组织、凝胶以及地下土壤和沉积物。本文中，我们开发了一种方法，将细菌密集菌落3D打印至堵塞的颗粒水凝胶基质中，以研究其在复杂环境中的生长与运动特性。研究揭示了细菌在多孔环境中扩散特性的未知差异，与在平面液体培养中的情况相比表现出显著不同。

开发了一种使用颗粒状水凝胶基质的方法，该基质由在液体细菌培养液中溶胀的可生物相容性水凝胶微粒紧密堆积而成，作为多孔培养皿以在三维空间中限制细胞。以往的研究局限于约一毫升的小样本体积，因而实验时间较短，且在高空间分辨率下定义特定几何结构方面能力有限。我们已证实，细菌的细胞扩散特性取决于孔隙大小和细胞的运动能力。

首先，将3D打印机连接到计算机。将带针头的一毫升一次性注射器装入3D打印的夹具中。使用两个M8内六角螺栓将夹具固定在注射器周围。

旋转丝杠以手动提升柱塞，在注射器中形成一个两毫升的空气间隙。为制备霍乱弧菌培养物，将细胞接种至含有10颗无菌玻璃珠的3毫升LB液体培养基中。在37摄氏度的振荡培养箱中培养细胞5至6小时。

同样，将大肠杆菌接种至3 mL液体LB培养基中。在37°C过夜培养后，取200 µL菌液接种至新鲜LB培养基中，培养3小时。将菌液转移至10 mL离心管中。

然后在室温下以644 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于10 µL液体LB培养基中。接下来，将一个空的3 mL塑料鲁尔锁扣注射器装入3D生物打印机中。

将注射器推杆与丝杠连接。手动回拉注射器，使空气间隙转移，以利于推杆更顺畅地移动。在注射器尖端安装合适尺寸的钝头针头。

手动旋转螺钉以回拉注射器活塞，并将细菌悬液吸入注射器中。为制备颗粒状水凝胶混合物，将交联丙烯酸的干燥颗粒与400毫升2% Lennox Luria Bertani肉汤混合。用10摩尔氢氧化钠溶液每次添加500微升调节pH至7.4，并用pH试纸检测pH值。

使用一个50毫升无菌塑料注射器将水凝胶混合物转移至一个50毫升离心管中。在室温下以161 ×g离心1分钟。接着，使用一个30毫升注射器将所需体积的基质转移至进行打印的容器中。

然后将含有水凝胶基质的样品容器放置到打印机构建平台上的支架中。启动3D打印软件，点击“文件”，然后按“打开文件”，将预编程的gcode文件加载到软件中。

输入移动距离，然后移动 X、Y、Z 轴，使打印头在 X/Y 平面上居中。点击首页图标以重新调整 Z 轴。

手动缓慢旋转螺钉，压下注射器活塞，直至针尖处出现少量细菌悬液。用无菌一次性擦拭纸擦去多余的悬液。然后将打印头以固定距离下降至任意样品容器的水凝胶培养基中。

单击“打印”以开始打印。打印完成后，关闭样本容器，妥善处理注射器和针头，用70%乙醇擦拭打印机。对于大视野成像，请使用配备变焦镜头的相机。

在室温下打印后立即对细胞进行成像，然后将样品转移至37摄氏度的培养箱中。基质孔径大小的差异似乎不影响非运动性细胞的铺展。然而，与小孔径基质相比，运动性细胞在大孔径基质中的铺展速度更快。

在具有较大孔隙的水凝胶基质中，霍乱弧菌菌落以平滑的弥散状羽流形式扩散。非运动性细胞中未出现弥散状羽流。无论是运动性还是非运动性细胞，在具有较小孔隙的水凝胶基质中，菌落仅以粗糙的、类似分形的羽流形式扩散。

两种细胞在前150小时内均表现出相似的铺展速率。然而，在更长时间的观察中，部分样品显示出更快的铺展速率。实验后，水凝胶的屈服应力、储能模量和损耗模量均有所降低。