Name: 3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学习利用3D生物打印技术将霍乱弧菌和大肠杆菌菌落植入颗粒水凝胶基质，研究其在复杂三维多孔环境中的运动与生长特性。该方法揭示了孔径大小对细菌扩散行为的影响规律。

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R.K.B. 感谢美国总统博士后研究基金项目的支持。本研究还得到美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目资助 DGE-2039656（授予 A.M.H.）。A.S.D.-M. 和 H.N.L. 感谢普林斯顿大学 Lidow 独立研究/毕业论文基金的支持。我们还感谢 Bonnie Bassler 实验室提供霍乱弧菌（V. cholerae）菌株。S.S.D. 感谢美国国家科学基金会资助 CBET-1941716、DMR-2011750 和 EF-2124863，以及 Eric 和 Wendy Schmidt 变革性技术基金、新泽西健康基金会、佩尔生物医学学者项目和卡米尔·德雷福斯教师-学者项目的支持。

本方法旨在通过Tashman等人先前建立的方案34，将商用3D熔融沉积成型打印机改装为3D生物打印机。简而言之，Tashman等人用一个自制的注射泵挤出装置替代了商用挤出头。该挤出装置可通过G代码编程语言控制挤出体积和三维位置，从而实现高浓度细菌细胞液悬液的三维打印。挤出体积由软件中的挤出机步进（E步）设定，并在下文进一步描述中进行额外校准。这些细菌悬液被直接打印到颗粒状水凝胶基质中，该基质为细胞提供三维支撑。下文的方案还描述了如何制备不同聚合物浓度的基质，表征孔径和流变学性质的相应变化，并通过直接成像表征细菌的运动性和生长情况。
1. 将商用3D打印机改装为3D生物打印机
<ol>
	<li>从商用3D打印机上拆下挤出机和加热器（参见材料表）。</li>
	<li>按照先前的方案制备注射泵式挤出机34，并进行额外修改以适配一次性鲁尔锁式注射器。将注射泵式挤出机安装到打印机上。 
	注意：用于修改塑料注射器用注射泵挤出机的CAD文件见&#160;补充文件1-3。</li>
	<li>在计算机上安装并打开3D打印机软件（参见材料表），并将3D打印机连接至计算机。</li>
	<li>将装有合适尺寸针头的1 mL一次性注射器装入3D打印的夹具中，通过对接机构的上下两部分进行对齐（图1）。使用三根M8内六角螺栓和薄型钢制六角螺母（参见材料表）将夹具固定在注射器周围。注射器推杆与注射泵挤出机中的丝杠相连。通过手动旋转丝杠，将推杆向上提升，在注射器内形成0.5 mL的空气间隙。</li>
	<li>若实验对污染有顾虑，应将注射器-夹具组件转移至生物安全柜内，并在进入时用70%乙醇喷雾消毒，然后再完成后续步骤。</li>
</ol>
2. 细菌悬液的制备
<ol>
	<li>对于 霍乱弧菌和大肠杆菌， 培养&#160;在2% Lennox LB（Luria肉汤，参见 材料表) 琼脂平板于 37 °C 培养。
	<ol>
		<li>对于 霍乱弧菌， 将细胞接种于含有10颗无菌玻璃珠的3 mL液体LB培养基中，在37 °C摇床培养箱中培养5-6小时，直至对数中期，光密度（OD）600达到约0.9。</li>
		<li>对于 大肠杆菌， 将细胞接种至3 mL液体LB培养基中，于37 °C摇床培养过夜。取200 µL过夜培养物接种于新鲜LB培养基中，培养3 h至OD达到0.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养物转移至10 mL离心管中，在5,000 x g条件下离心5 min g 在室温下离心形成沉淀。移除上清液。加入约10 µL液体LB培养基，重悬菌体，使细胞密度达到约9 × 1010 每毫升细胞数</li>
</ol>
3. 将细菌悬液装入注射器
注意：提供了两种将细菌装入注射器的方法（步骤 3.1 和步骤 3.2）。步骤 3.1 适用于装载小体积的细菌悬液，&#60;200 µL；步骤 3.2 适用于装载较大体积的细菌悬液，&#62;200 µL。本文所示的代表性结果采用的是步骤 3.1。
<ol>
	<li>将一个空的 1 mL 塑料鲁尔锁式注射器装入 3D 生物打印机中。将注射器推杆与丝杠连接。手动回抽注射器，加入 0.2 mL 的空气间隙，以提供推杆在注射器内移动的空间，因为在每批实验中使用的细胞体积较小，约为 20–50 µL。
	<ol>
		<li>在注射器尖端安装一根钝针，针头尺寸应根据所需打印特征的大小选择。此处使用的是 2 英寸 20 G 针头。</li>
		<li>通过将装有细菌接种物的 10 mL 离心管置于针头下方，将细菌悬液装入注射器。手动旋转丝杠以回抽注射器推杆，将细胞吸入注射器。由于细菌细胞体积非常小，通常仅能将细胞吸入针头部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从注射器-夹具组件中取出推杆，并使用另一支注射器和针头小心地将所需的细菌悬液装入该组件中，注意避免混入气泡。应将注射器-夹具组件略微装满至溢出，然后将其转移至生物打印机。
	<ol>
		<li>小心地将不含推杆的注射器-夹具组件插入生物打印机挤出装置主轴上的对应插槽中。</li>
		<li>确保打印机滑架位于丝杠约中间位置，并在已装载的注射器下方放置收集皿。然后，小心地将推杆穿过滑架和注射器-夹具组件，直至其卡入滑架。缓慢下压推杆进入细菌悬液中，以避免在注射器内混入气泡。</li>
		<li>将适配器夹具滑动到滑架上，覆盖在推杆后部，以固定其位置，确保在挤出和回缩操作过程中保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 挤出机步进与沉积体积的校准
<ol>
	<li>为校准挤出机步数（E-step）与沉积体积的关系，首先使用实验中将要使用的精确规格的注射器、注射针头和细菌悬浮液设置生物打印机。此处使用1 mL鲁尔锁式注射器。</li>
	<li>通过挤出一个任意的E-step数值（约200），并根据注射器上的体积刻度观察活塞的体积变化，初步确定用于校准的E-step范围。</li>
	<li>利用该粗略的E-step与体积比值，确定进行校准扫描时所用的E-step设置范围。例如，若目测发现200的E-step大约挤出20 µL，而目标沉积体积为10–200 µL，则可测试100–2000之间的E-step值。</li>
	<li>进行线性校准扫描时，首先在灵敏度为0.1 mg的分析天平上称量并标记20个1.5 mL样品管的干重。</li>
	<li>将细菌悬浮液挤出至已预先称重的1.5 mL样品管中。每个E-step至少进行2次重复。在整个线性范围内重复所有E-step测试，必要时更换新的细菌悬浮液。若实验对污染敏感，则每次取样后应用浸透70%乙醇的无尘布擦拭注射针头外部。</li>
	<li>使用同一台分析天平测量所有含液体的1.5 mL样品管的质量。用第二次测得的质量减去初始干重，得到沉积细菌悬浮液的净质量。</li>
	<li>根据材料密度将细菌悬浮液的质量转换为体积。对于主要成分为水的多数细菌悬浮液，可采用1 g/mL作为合理的密度近似值。</li>
	<li>对E-step与挤出体积之间进行线性拟合，完成校准过程。</li>
</ol>
5. 颗粒状水凝胶基质的制备
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将交联丙烯酸/烷基丙烯酸酯共聚物的干燥颗粒（参见材料表）加入400 mL的2% Lennox Luria-Bertani（LB）培养基中，以保持基质无菌；但也可使用其他液体细胞培养基来溶胀水凝胶基质。 
	注意：加入LB中的颗粒质量百分比取决于目标孔径大小。在本研究中，制备0.9%颗粒状水凝胶基质时，向LB中加入3.6 g干燥颗粒；制备1.2%颗粒状水凝胶基质时，则加入4.8 g干燥颗粒。通过搅拌器混合2分钟，使水凝胶颗粒均匀分散。</li>
	<li>混合后，逐次加入20至500 µL的10 M氢氧化钠（NaOH），调节pH至7.4，以确保细胞存活率。每次加入NaOH后，将移液枪头浸入混合物中，然后将少量水凝胶基质涂抹于pH试纸上测定pH值。 
	注意：随着NaOH的加入，水凝胶颗粒开始溶胀，混合物的黏度会逐渐升高。溶胀后的水凝胶颗粒直径约为5 µm至10 µm，彼此紧密堆积形成水凝胶基质。颗粒内部网孔尺寸约为40 nm至100 nm，如先前研究所确定32。该网孔尺寸足以允许小分子（如氧气和营养物质）自由扩散，同时又能限制细菌在间隙孔隙之间移动。</li>
	<li>随后，使用50 mL无菌塑料注射器将颗粒状水凝胶基质转移至50 mL离心管中。在室温下以161 × g离心1分钟，以去除混合过程中产生的气泡。</li>
	<li>让水凝胶基质在室温下静置至少2天，以确保无污染发生。污染表现为悬浮于水凝胶基质中的微菌落。两天后，再次以161 × g离心1分钟，去除期间可能新形成的气泡。 
	注意：此步骤可暂停，将水凝胶基质在室温下储存最多一周。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用30 mL无菌塑料注射器，将所需量的水凝胶基质转移至打印容器中（本实验中，约20 mL用于20 mL组织培养瓶，或1 mL用于1 mL塑料微量比色皿）。</li>
</ol>
6. 颗粒状水凝胶基质流变特性的表征
<ol>
	<li>将约 3 mL 水凝胶基质装入剪切流变仪（参见材料表），使用直径为 50 mm 的粗糙平行板，板间间隙为 1 mm，以测量其流变性能。</li>
	<li>在剪切流变仪上通过单向剪切测量，量化屈服行为：测量剪切应力随剪切速率对数扫描（从 10-4 s-1 到 102 s-1）的变化关系（例如，图 2A）。 
	注意：在低剪切速率下，水凝胶基质的剪切应力保持恒定（即屈服应力），与剪切速率无关；在高剪切速率下，剪切应力随剪切速率呈幂律关系增加，表明水凝胶基质发生液化。这种屈服应力行为使得细菌可在颗粒状水凝胶基质中进行三维打印29。</li>
	<li>采用小振幅振荡流变测试，设定应变振幅为 1%，频率范围为 0.1 至 1 Hz，测量储能模量和损耗模量（分别为 G' 和 G''）随频率的变化关系（例如，图 2B）。 
	注意：理想的用于三维打印的颗粒状水凝胶基质应具有高于损耗模量的储能模量，表明该介质表现为一种堵塞的弹性固体29。</li>
</ol>
7. 颗粒状水凝胶基质孔隙尺寸的表征
<ol>
	<li>将100 nm羧基化荧光聚苯乙烯纳米颗粒（~3.6 × 1013 颗粒/mL，参见材料表）在其包装中进行超声处理15分钟，以重新悬浮并打破任何聚集或团块。取50 µL纳米颗粒转移至1.5 mL微量离心管中。
	<ol>
		<li>在室温下以9,500 × g离心10分钟，直至形成沉淀且上清液澄清。弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL用于制备颗粒状水凝胶基质的液体培养基（此处为LB）中。 
		注：可通过将重悬的纳米颗粒在4 °C保存最长3个月，在此暂停实验流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将重悬后的纳米颗粒超声处理30分钟。取1 mL颗粒状水凝胶基质转移至1.5 mL微量离心管中。向其中加入1 µL重悬的纳米颗粒，并用移液器吸头混匀。混合后，在室温下以161 × g离心30秒。</li>
	<li>将水凝胶基质与纳米颗粒的混合物转移至直径为35 mm、底部为0.1 mm厚玻璃的培养皿中。该培养皿的玻璃井直径为20 mm，深度为1 mm。在顶部放置盖玻片并轻压，以防止成像过程中的流动和蒸发。替代方法是在顶部加入1 mL石蜡油。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜配合40倍油镜，并在成像软件中额外放大8倍进行纳米颗粒成像（参见材料表）。 
	注：也可使用更高倍率的物镜，而非依赖软件中的数字放大。
	<ol>
		<li>在单个z平面内以无延迟方式采集时间序列图像（理想情况下约19帧/秒），持续2分钟，确保视野中至少包含四个纳米颗粒。在不同位置重复该过程15至20次，以收集足够的统计数据（100至200个纳米颗粒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用颗粒追踪软件分析颗粒的位移。此处采用基于经典Crocker-Grier算法的自编脚本来追踪纳米颗粒的质心35（参见补充文件7）。
	<ol>
		<li>根据颗粒追踪结果计算均方位移（MSD）。在短时间和短距离尺度下，MSD表现出孔隙空间内的自由扩散行为；而在较长的时间和距离尺度下，由于受限效应，将转变为亚扩散标度行为35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定发生向亚扩散标度转变的长度尺度，以估算局部孔径大小。通过将该长度尺度与纳米颗粒直径相加，计算孔径尺寸。对每个测量的纳米颗粒重复进行孔径分析。由此可获得孔径分布，并进一步计算平均孔径（例如，图3）。</li>
</ol>
8. 3D 打印过程
<ol>
	<li>使用3D打印技术为样品容器定制支架（CAD文件见补充文件4-6）。此处使用适用于组织培养瓶和微量比色皿的支架。这些支架可使打印机在单次打印过程中按程序打印多个样品。将装有水凝胶培养基的样品容器放入支架中，并置于构建平台上。</li>
	<li>打开3D打印软件，将预编程的g代码载入软件中。在代表性实验结果中，使用步骤3.1将细菌悬液加载至3D打印机。 
	注意：用于打印线性垂直结构的g代码示例如表1所示。</li>
	<li>通过3D打印软件移动x-y-z轴，使打印头在x-y平面上对准第一个容器，然后归零z轴。归零z轴将抬升打印头。手动缓慢旋转螺杆，推动注射器活塞，直至针尖处可见少量细菌悬液。
	<ol>
		<li>用无菌一次性擦拭纸轻轻擦去针尖多余的细菌悬液。根据样品支架、针头和注射器的高度，通过3D打印软件将打印头下降至选定样品容器中水凝胶培养基内的固定深度。点击“打印”按钮开始打印过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印完成后，关闭样品容器。使用70%乙醇清洁打印机表面。妥善处理使用过的注射器和针头。</li>
</ol>
9. 培养与成像 V. cholerae
<ol>
	<li>对于大视野成像，使用配备变焦镜头的相机结合光源箱对细胞生长进行成像。在室温下打印后立即对样品进行成像，随后将其转移至培养箱中。实验期间在成像间隔阶段，将样品置于37 °C的静止培养箱中维持培养。</li>
	<li>在所需的时间范围内连续采集图像，以观察细胞在颗粒状水凝胶基质中长期的生长行为。</li>
</ol>

Bioprinting Bacteria in Hydrogel Matrices for the Study of Motility and Growth

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</ol>

本出版物中用于3D打印和成像细菌群落的实验平台，已由普林斯顿大学代表Tapomoy Bhattacharjee和S.S.D.提交专利申请（PCT申请号PCT/US/2020/030213）。

实验方案中的关键步骤 
在制备每种水凝胶基质时，必须确保操作在无菌环境中进行。否则可能发生污染，表现为数天后基质中出现微生物微菌落（小型球状体）。在混合过程中，必须确保所有干燥的颗粒状水凝胶完全溶解。此外，在使用 NaOH 调节水凝胶基质的 pH 值时，颗粒会开始膨胀，导致水凝胶基质黏度升高，使混合变得更加困难。使用台式搅拌器有助于确保 NaOH 均匀混入水凝胶基质中。在加载每种细菌悬液时，针头内可能形成气泡。为避免此问题，应确保针尖始终浸没在离心管中的细菌悬液内，而不是位于管底或接近液面表面。另一种解决方法是培养大量细胞，从而获得更大体积的细菌悬液用于打印。
局限性 
目前，在打印过程中，细菌悬液的低黏度限制了可打印的结构几何形态，并且由于痕量细胞的存在，常常导致生物膜在水凝胶基质表面形成并生长。克服这一局限性的潜在方法有几种，包括提高细菌悬液的黏度或进一步优化3D打印机的参数设置。为提高细菌悬液的黏度，可将细菌悬液与另一种聚合物混合——例如海藻酸盐（alginate），此前已有研究将其用于细菌在平面基底上的3D打印38。此外，还可进一步优化打印机设置，使针头从颗粒状水凝胶基质中撤出时，注射器活塞能够回缩，从而有望避免在针头撤离过程中将细胞沉积到水凝胶基质中。
该方法相对于现有/替代方法的意义 
本文所述方法可实现将细菌菌落打印至颗粒状水凝胶基质中。颗粒状水凝胶基质可用于研究外部环境因素（例如孔径大小、基质可变形性）对细菌运动性和生长的影响。此外，尽管本研究中使用LB液体培养基来溶胀水凝胶基质，但该基质也可用其他液体培养基（包括含抗生素的培养基）进行溶胀。以往研究受限于实验时间长度、聚合物网络孔径以及周围水凝胶基质的刚度，难以在受限环境中开展细菌研究37,38。目前已存在多种利用不同聚合物制备颗粒状水凝胶基质的实验方案，因此该方法在研究不同环境条件对细菌运动性和生长影响方面具有广阔潜力。该方法使得在更接近细菌真实生存环境（如宿主黏液或土壤）的可控环境中研究细菌成为可能。许多其他方法的另一局限性在于周围基质的不透明性；而本方法采用光学透明材料，能够实现例如对细菌进行光遗传学控制及三维空间中的图案化研究。
除了研究运动性和生长特性外，本文所述的3D打印方法克服了其他许多生物打印技术的局限性——这些技术需要将生物墨水沉积在基底上，因此所制备的工程化活体材料的高度受到限制。未来，该生物打印方案可进一步拓展，通过将聚合物与成膜细胞混合，制备出生物杂化材料。颗粒状水凝胶基质为3D打印更厚、更大尺度的工程化活体材料以及更复杂的几何结构提供了支撑，优于当前大多数细菌生物打印方法。尽管本研究仅使用了V. cholerae和E. coli，但其他物种（如Pseudomonas aeruginosa）也已成功实现3D打印37。除了打印功能外，该打印机还可经改造用于在细菌生长后进行受控取样，以检测是否发生了任何遗传变化等。

细菌通常栖息于多种复杂的三维多孔环境中，从肠道和肺部的黏膜凝胶到土壤均属此类。1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 
22,23,24,25在这些环境中，细菌通过运动或生长在周围障碍物（如聚合物网络或固体矿物颗粒的堆积）中的移动可能受到阻碍，从而影响细胞在环境中的扩散能力。26，获取营养物质，定殖新环境，并形成具有保护作用的生物膜群落27然而，传统的实验室研究通常采用高度简化的几何结构，主要关注液体培养物中的细胞或生长在平坦表面的细胞。尽管这些方法为微生物学提供了关键见解，但它们无法完全重现自然生境的复杂性，导致与真实环境中的测量结果相比，细菌的生长速率和运动行为存在显著差异。因此，迫切需要一种能够定义细菌菌落并研究其在更接近自然生境的三维多孔环境中运动与生长的方法。
将细胞接种到琼脂凝胶中，随后通过肉眼或相机观察其宏观扩散情况，这是一种实现该目标的直接方法，最早由 Tittsler 和 Sandholzer 于 1936 年提出28。然而，该方法存在若干关键技术难题：（1）尽管原则上可通过改变琼脂糖浓度来调节孔径大小，但此类凝胶的孔结构定义不明确；（2）由于光散射，这些凝胶呈现浑浊状态，难以在个体尺度上以高分辨率和高保真度观察细胞，尤其是在大样本中；（3）当琼脂浓度过高时，细胞迁移被限制在凝胶的顶部平面表面；（4）此类凝胶复杂的流变学特性使得难以引入具有明确几何形状的接种物。
为解决这些局限性，在先前的研究中，Datta 实验室开发了一种替代方法，使用颗粒状水凝胶基质——由在液体细菌培养基中溶胀的、处于阻塞状态的生物相容性水凝胶颗粒组成——作为&#34;多孔培养皿&#34;，以实现细胞在三维空间中的限域。这些基质是柔软、可自愈且具有屈服应力的固体；因此，与在其他生物打印过程中使用的交联凝胶不同，注射微喷嘴可在基质内部沿任意预设的三维路径自由移动，通过局部重排水凝胶颗粒实现穿行29。这些颗粒随后迅速重新致密化，并在注入的细菌周围实现自愈合，从而在无需任何额外有害处理的情况下将细胞稳定固定。因此，该过程是一种三维打印形式，能够在具有可调理化性质的多孔基质内，按照所需的三维结构和确定的群落组成来排列细菌细胞。此外，该水凝胶基质完全透明，可利用成像技术对细胞进行直接观察。
该方法的实用性此前已通过两种方式得到验证。在一组研究中，将稀释的细胞分散于水凝胶基质中，从而实现了对单个细菌运动性的研究30,31。在另一组研究中，利用安装在可编程显微镜载物台上的注射喷嘴，将多细胞群体在厘米尺度的凝胶中进行三维打印，从而实现了对细菌群体在周围环境中扩散行为的研究32,33。在这两种情况下，这些研究均揭示了细菌在多孔环境中扩散特性与在液体培养或平面表面条件下存在的此前未知的差异。然而，由于这些研究均依赖于显微镜载物台，因此仅限于小样本体积（约1 mL），实验时间尺度较短。此外，在以高空间分辨率定义接种体几何形态方面也存在局限性。
本文介绍了一种克服上述两项局限性的下一代实验平台。具体提供了相关方案，可用于改造配备注射器挤出装置的3D打印机，以实现对细菌菌落的大规模3D打印与成像。此外，代表性数据表明，该方法可用于研究细菌的运动性与生长特性，文中以形成生物膜的Vibrio cholerae和浮游生长的Escherichia coli为例进行了说明。该方法能够长期维持细菌菌落，并利用多种成像技术进行观察。因此，该方法在研究三维多孔环境中细菌群落方面具有巨大的科研与应用潜力，可影响对肠道、皮肤、肺部及土壤中微生物的研究与治疗。此外，未来该方法还可用于将基于细菌的工程化活体材料3D打印成更复杂的自支撑结构。

<table><tbody><tr><td>1 mL 比色皿</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BH Supplies</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>100 nm 羧基化荧光聚苯乙烯纳米颗粒（FluoSpheres）&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)</td><td>&lt;br/&gt; F8803</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-237</td><td></td></tr><tr><td>20 G 钝头针</td><td>McMaster Carr</td><td>75165A252</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 组织培养瓶</td><td>VWR</td><td>10861-566</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印机</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot Mini 2</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印软件</td><td>Cura</td><td>Cura-Lulzbot</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-239</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>卡波姆颗粒水凝胶</td><td>Lubrizol&amp;nbsp;</td><td>Carbopol 980NF</td><td>交联丙烯酸/烷基丙烯酸酯共聚物的干颗粒</td></tr><tr><td>离心机（2 mL 管容量）</td><td>VWR</td><td>2405-37</td><td></td></tr><tr><td>离心机（50 mL 管容量）</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75007200</td><td>Sorvall（品牌）ST 8（型号）</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1R+ 倒置激光扫描&lt;br/&gt; 共聚焦显微镜</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB（Lubria 肉汤）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>M8 &amp;times; 1.25 mm，150 mm 长，全螺纹内六角盖帽</td><td>McMaster Carr</td><td>91290A478</td><td></td></tr><tr><td>M8 &amp;times; 1.25 mm，黄铜薄六角螺母</td><td>McMaster Carr</td><td>93187A300</td><td></td></tr><tr><td>开源注射泵</td><td>定制</td><td>Replistruder 4</td><td>https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm 圆形）</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>剪切流变仪</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 501</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr></tbody></table>

利用3d打印细菌研究其在复杂三维多孔介质中的运动性与生长

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

细菌广泛存在于复杂的三维（3D）多孔环境中，例如生物组织和凝胶，以及地下土壤和沉积物中。然而，以往的大多数研究集中于在体相液体或平坦表面中的细胞行为，这些条件无法充分再现许多天然细菌栖息地的复杂性。本文通过描述一种将细菌密集菌落3D打印至堵塞颗粒水凝胶基质中的方法，填补了这一知识空白。这些基质具有可调节的孔径大小和力学特性，能够对细胞产生物理限制，从而在三维空间中提供支撑。它们具备光学透明性，可通过成像技术直接观察细菌在其周围环境中的扩散行为。作为该原理的验证，本文展示了利用该方案在具有不同间隙孔径的堵塞颗粒水凝胶基质中，对非运动型和运动型Vibrio cholerae以及非运动型Escherichia coli进行3D打印和成像的能力。

本方案描述了一种用于三维（3D）打印细菌菌落的方法，以研究其在复杂三维多孔水凝胶基质中的运动性和生长特性；相较于传统的液体培养或培养皿，该基质更接近于细菌的自然生存环境。

利用3D打印细菌研究其在复杂三维多孔介质中的运动性与生长

细菌普遍存在于复杂的三维（3D）多孔环境中，例如生物组织和凝胶，以及地下土壤和沉积物中。

细菌广泛存在于复杂的三维多孔环境中，例如生物组织、凝胶以及地下土壤和沉积物。本文中，我们开发了一种方法，将细菌密集菌落3D打印至堵塞的颗粒水凝胶基质中，以研究其在复杂环境中的生长与运动特性。研究揭示了细菌在多孔环境中扩散特性的未知差异，与在平面液体培养中的情况相比表现出显著不同。开发了一种使用颗粒状水凝胶基质的方法，该基质由在液体细菌培养液中溶胀的可生物相容性水凝胶微粒紧密堆积而成，作为多孔培养皿以在三维空间中限制细胞。以往的研究局限于约一毫升的小样本体积，因而实验时间较短，且在高空间分辨率下定义特定几何结构方面能力有限。我们已证实，细菌的细胞扩散特性取决于孔隙大小和细胞的运动能力。首先，将3D打印机连接到计算机。将带针头的一毫升一次性注射器装入3D打印的夹具中。使用两个M8内六角螺栓将夹具固定在注射器周围。旋转丝杠以手动提升柱塞，在注射器中形成一个两毫升的空气间隙。为制备霍乱弧菌培养物，将细胞接种至含有10颗无菌玻璃珠的3毫升LB液体培养基中。在37摄氏度的振荡培养箱中培养细胞5至6小时。同样，将大肠杆菌接种至3 mL液体LB培养基中。在37°C过夜培养后，取200 µL菌液接种至新鲜LB培养基中，培养3小时。将菌液转移至10 mL离心管中。然后在室温下以644 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于10 µL液体LB培养基中。接下来，将一个空的3 mL塑料鲁尔锁扣注射器装入3D生物打印机中。将注射器推杆与丝杠连接。手动回拉注射器，使空气间隙转移，以利于推杆更顺畅地移动。在注射器尖端安装合适尺寸的钝头针头。手动旋转螺钉以回拉注射器活塞，并将细菌悬液吸入注射器中。为制备颗粒状水凝胶混合物，将交联丙烯酸的干燥颗粒与400毫升2% Lennox Luria Bertani肉汤混合。用10摩尔氢氧化钠溶液每次添加500微升调节pH至7.4，并用pH试纸检测pH值。使用一个50毫升无菌塑料注射器将水凝胶混合物转移至一个50毫升离心管中。在室温下以161 ×g离心1分钟。接着，使用一个30毫升注射器将所需体积的基质转移至进行打印的容器中。然后将含有水凝胶基质的样品容器放置到打印机构建平台上的支架中。启动3D打印软件，点击“文件”，然后按“打开文件”，将预编程的gcode文件加载到软件中。输入移动距离，然后移动 X、Y、Z 轴，使打印头在 X/Y 平面上居中。点击首页图标以重新调整 Z 轴。手动缓慢旋转螺钉，压下注射器活塞，直至针尖处出现少量细菌悬液。用无菌一次性擦拭纸擦去多余的悬液。然后将打印头以固定距离下降至任意样品容器的水凝胶培养基中。单击“打印”以开始打印。打印完成后，关闭样本容器，妥善处理注射器和针头，用70%乙醇擦拭打印机。对于大视野成像，请使用配备变焦镜头的相机。在室温下打印后立即对细胞进行成像，然后将样品转移至37摄氏度的培养箱中。基质孔径大小的差异似乎不影响非运动性细胞的铺展。然而，与小孔径基质相比，运动性细胞在大孔径基质中的铺展速度更快。在具有较大孔隙的水凝胶基质中，霍乱弧菌菌落以平滑的弥散状羽流形式扩散。非运动性细胞中未出现弥散状羽流。无论是运动性还是非运动性细胞，在具有较小孔隙的水凝胶基质中，菌落仅以粗糙的、类似分形的羽流形式扩散。两种细胞在前150小时内均表现出相似的铺展速率。然而，在更长时间的观察中，部分样品显示出更快的铺展速率。实验后，水凝胶的屈服应力、储能模量和损耗模量均有所降低。

3d-printing-bacteria-to-study-motility-growth-complex-3d-porous

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp.

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