加味生姜散对糖尿病肾病大鼠模型的拮抗作用：与EGFR/MAPK3/1信号通路相关
2024年5月10日
本文介绍了一种利用网络药理学和分子对接技术探讨加味生姜散（JWSJS）治疗糖尿病肾病作用机制的实验方案。
我们正在探索传统中药或传统疗法如何应对糖尿病候选疾病。为解答这些问题，我们研究候选细胞中的细胞取样及细胞本身。传统草药有助于管理糖尿病候选病症，但其作用机制尚不明确。
我们探讨网络药理学及分子技术在加味生姜散作用机制研究中的应用。我们的方法类似于JPS，用于发现有效成分。在中药复方研究中，可快速预测加味生姜散的活性成分及其作用靶点，并构建药物-成分-靶点网络，相比传统的试错方法，该方法更高效且能提供更清晰的作用机制图景。
首先打开传统中药系统药理学数据库与分析平台。输入加味生姜散（Jiawei Shengjiang San）或 JWSJS 的药物成分，并应用筛选条件。然后利用该数据库，检索与这些成分对应的作用靶点。
从中药和化学成分数据库中获取活性成分。选择具有化学文摘服务号（CAS号）的化合物后，从 PubChem 下载活性成分的二维结构图。使用 Swiss ADME 进行分析。
筛选出胃肠吸收性高且至少有两项为“是”的药物相似性组分。将这些组分导入数据库，用于靶蛋白预测，在 UniProt 中设置状态为“reviewed”，物种为人，并对靶点进行标准化。通过多个数据库检索糖尿病肾病或 DN，获取相关靶点。
使用 4.2.0 版软件合并并去重后，筛选出 JWSJS 与 DN 的共同靶点以绘制维恩图。将 JWSJS 的活性成分及潜在靶点导入 Cytoscape 3.8.0 软件，构建药物-成分-靶点网络图，以可视化展示药物、成分、靶点与疾病之间的关联。在 STRING 平台中分析交集基因时，设定物种为智人（Homo sapiens），最低相互作用评分要求大于 0.9，用于构建网络。
使用 Cytoscape 3.8.0 的多蛋白分析模式对网络进行拓扑学分析，并计算每个节点的介数中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）、度中心性（degree centrality）、iGen、向量中心性（vector centrality）、基于局部平均连通性的方法以及网络中心性值。然后利用 clusterProfiler 的 org.Hs.eg.db 包获取交集靶点的 ID。
使用 db enrich plot 和 GG plot 两个软件包进行功能基因本体富集分析，筛选生物学前 10 个显著富集结果中校正 P 值小于 0.05 的条目，并选择京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析中富集程度最高的前 30 条通路。在 PubChem 数据库中检索，利用 ChemBio 3D Ultra 14.0 软件获取 JWSJS 核心成分的二维结构 SDF 文件，生成并优化其三维结构。
以 mold two 格式保存，用作配体文件。从结构生物信息学研究协作蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）中查找并下载核心靶点三维结构的 PDB 格式文件。使用 PIMOL 2.4.0 软件。
从蛋白质结构中移除水分子和配体，并将其保存为PDB受体文件。将受体蛋白文件导入AUTODOC Tools 1.5.7软件中进行加氢处理，并将受体蛋白和小分子配体均转换为PDBQT格式。设置受体蛋白的活性口袋，间距系数设为1。
使用 autodoc vena 1.2.0 进行分子对接，计算结合能，并利用 PIMOL 2.3.0 和 lid plot Plot 2.2.5 软件可视化对接结果。对三组最具潜力的衍生配体复合物进行分子动力学（MD）研究，采用含 0.15 摩尔氯化钠的 A SPC 水环境。使用 Desmond 默认参数进行 100 皮秒的能量最小化阶段。
通过鼻式胡佛链（Hoover chain）和Martina Tobias Klein方法，确保所有生产系统中的温度和压力稳定在26.85摄氏度和1.01325巴。执行100纳秒的分子动力学（MD）模拟，时间步长为2飞秒，每100皮秒记录一次原子坐标。打开模拟相互作用图（SID）模块，并将模拟结果数据文件加载其中。
分析完成后，在 SID 模块界面中查看并解读结果。通过腹腔注射向模型组动物注射链脲佐菌素。72 小时后，通过尾静脉采血检测血糖水平。
观察大鼠肾脏的组织病理学变化，以确认糖尿病肾病模型建立成功。随后通过灌胃法每日给予大鼠适当的药物，并从麻醉大鼠的腹主动脉采集血样。
最后，在处死大鼠后，采集肾脏用于生化和显微分析。过碘酸-雪夫染色显示，模型组与正常组相比，肾小球体积增大，基底膜增厚，系膜基质增多。各给药组的上述病理表现均显著减轻。透射电子显微镜结果显示，模型组肾小球基底膜较正常组增厚。
与模型组相比，各给药组大鼠的显微病变均有不同程度的缓解。与模型组相比，各给药组大鼠肾组织中 PEGFR、PMAPK 31 和 Bax 的表达显著降低，同时 BCL2 的表达不同程度地上调。
概述
本文介绍了一种利用网络药理学和分子对接技术研究加味生姜散（JWSJS）治疗糖尿病肾病作用机制的实验方案。该研究旨在阐明传统草药制剂调控糖尿病病理过程的机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 药理学
- 糖尿病学
背景
- 糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症。
- 传统草药已被用于糖尿病的管理，但其作用机制往往尚不明确。
- 加味生姜散是一种正在研究中的传统疗法。
- 网络药理学为探索草药作用机制提供了系统性方法。
研究目的
- 探讨加味生姜散的活性成分。
- 构建加味生姜散的药物成分-靶点网络。
- 为糖尿病肾病的治疗提供理论依据。
使用的方法
- 网络药理学技术。
- 分子对接方法。
- 候选细胞的细胞取样。
- 活性成分及其靶点的分析。
主要结果
- 确定 JWSJS 中的关键活性成分。
- 构建全面的药物成分-靶点网络。
- 深入解析 JWSJS 的作用机制。
- 相较于传统方法，更快速地预测疗效。
结论
- 网络药理学在探索草药疗法方面具有有效性。
- 加味生姜散在治疗糖尿病肾病方面显示出潜力。
- 需要进一步的研究来验证这些发现。
常见问题
执行行业相关性
网络药理学与分子对接可实现对疾病相关模型中草药化合物作用机制的系统性风险评估，有助于提高早期靶点验证的预测可信度。该方法阐明了加味生姜散（JWSJS）在糖尿病肾病中的多靶点作用，为项目筛选和转化研究的连续性提供依据。整合计算分析与体内验证可加速对复杂治疗候选物的作用机制认知。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过构建化合物-靶点-疾病网络，实现对治疗假设的系统性验证。
- 通过识别交叉靶点和通路，支持生物学层面的风险评估。
- 通过将活性中药成分与已验证的疾病机制相关联，提升预测的可信度。
- 优先筛选EGFR、MAPK1和MAPK3等靶点，用于后续机制研究。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的化合物-靶点网络。
- 利用定量网络拓扑和富集分析标准化靶点筛选。
- 支持对化合物评估进行可重复的分子对接和动力学模拟。
- 支持在疾病模型中对多组分中药混合物进行可扩展的评估。
转化与临床前研究
- 将疾病相关通路（例如 EGFR/MAPK3/1）与转化生物标志物策略相对应。
- 从计算预测到临床前模型中的体内验证，提供研究连续性。
- 通过关联分子效应与表型结果，为风险调整的推进决策提供依据。
- 通过明确的作用机制降低复杂天然产物开发过程中的风险。
流程与工作流整合
该工作流程整合了计算靶点预测、网络分析和体内验证，贯穿从早期发现到临床前研究的全过程。
- Discovery Biology：通过网络药理学和富集分析，支持假设验证和通路解析。
- Screening：提供可用于化合物评价的即用型靶点列表和定量分子对接结果。
- Analytics：提供用于比较化合物-靶点相互作用的统计学和拓扑学指标。
- Translational Research：将分子机制与临床前疗效及生物标志物调控相联系。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的计算-实验一体化流程，用于多组分治疗药物的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化多步骤工作流程，增强不同团队间的可重复性。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持经风险调整后的复杂治疗候选物的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备网络药理学、分子对接和体内疾病建模方面的专业知识。
- 需要具备化学信息学、生物信息学和分子模拟基础设施的使用条件。
- 需要跨团队统一数据格式和分析流程的标准。
- 针对不同化合物类别或疾病模型可能需要进行方法调整。
- 对多靶点效应的解读必须基于可靠的统计学和生物学验证。
