诱导小鼠角膜神经营养性角膜炎及神经再生的三种策略

角膜是覆盖眼球的透明组织，需要一个平衡的微环境来维持其完整性。角膜密集的神经支配参与构成这一微环境。如果这种神经支配出现部分或完全丧失，则会引发一种特定疾病，称为神经营养性角膜炎。

为了找到针对该疾病的新疗法和高效疗法，我们需要建立特异性的模型。携带荧光报告基因的转基因动物应用范围的扩大以及显微技术的进步，为观察轴突再生过程开辟了新的可能性。活体成像技术现已变得更加普及，任何希望追踪神经再生过程的研究实验室均可实现。

导致神经营养性角膜炎的各种病因使得仅用一种模型来测试神经再生疗法存在困难。这三种模型可分别模拟临床上观察到的不同情况，共享这些方法将使其他实验室能够揭示角膜神经支配的新机制，从而设计出创新的治疗方法。开始进行角膜擦伤时，将麻醉后的小鼠放置于实验台面上。

在手术侧眼睛上滴一滴人工泪液。在对侧眼睛上滴一滴眼用凝胶。接着，将小鼠侧卧置于加热板上。

用棉签轻轻吸去人工泪液，并拂开小鼠的睫毛，避免接触眼睛。打开眼部钻头，用两根手指小心撑开小鼠的眼睑。同时遮挡触须，防止其缠入钻头中。

定位瞳孔或眼球中心，轻轻将眼科钻头以环形运动方式施加于眼球表面，直至上皮层被去除。或者，可在角膜上进行约20次环形操作。然后在受损的眼部滴加一滴荧光素染色液。

20秒后，用纸巾轻拭眼睛以吸收溶液，然后用一滴人工泪液冲洗。最后，用纸巾吸去人工泪液，并使用钴蓝灯照射眼睛。手术前，基底上皮完整，基底下神经丛中的神经纤维形成涡旋状结构。

钻头去除了角膜外层，保留了基质层和内皮层的完整性，在基底上皮层和基底下神经丛处可见明显间隙。术后约一周上皮层开始再生，但角膜中央区域的涡旋结构仍缺失。开始进行角膜神经轴切术时，将麻醉后的小鼠置于操作台上。

在手术眼上滴一滴人工泪液。在对侧眼上滴一滴眼用凝胶。将小鼠置于双目放大镜下，以观察手术眼。

将培养皿底部置于小鼠头部下方，以保持眼睛水平。用棉签小心吸去眼睛表面的人工泪液，并去除睫毛，注意不要触碰眼睛。将一对光滑的弯柱置于动物眼睛下方，轻柔地将眼球推出眼眶。

将活检打孔器垂直轻压于角膜表面，施加压力并旋转打孔器数次。随后移除活检打孔器，角膜表面应可见一圆形标记。在打孔器作用部位可见一薄层周边环形区域，提示基底上皮已受损。

周围神经似乎被切断，引发了华勒氏轴突变性。观察到严重的变性，导致角膜中心完全失去神经支配。这进而引起上皮层的解体，形成溃疡。

首先，将一只已麻醉的小鼠放置在桌面上。在小鼠双眼上各滴一滴眼用凝胶。将动物置于头部固定装置中，以固定其位置。

将动物旋转90度，使待手术的眼睛朝向天花板。固定动物的胡须以清理眼部周围的区域。固定动物的身体，以尽量减少因呼吸引起的头部移动。

将圆形盖玻片水平放置于眼表的ocular胶上。根据需要调整动物头部位置，以正确安放盖玻片。在盖玻片上滴加一滴PBS。

然后小心地将动物放置在显微镜载物台上。调整显微镜的物镜转盘至适合观察的距离。启动激光以诱导角膜神经消融。

神经消融完成后，将动物从头部固定装置中取出，并置于加热板上的笼子中。激光消融一周后，可见涡旋结构明显消失。观察到一群免疫细胞迁移至光照部位。

基质纤维束似乎变细了。