Name: 鹦鹉幼虫 Crepidula fornicata 幼虫的实验室和田间培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 了解滑履螺Crepidula fornicata幼虫的实验室与野外中宇宙培养技术，比较不同环境条件下幼虫生长速度与变态时间的差异，为海洋无脊椎动物发育生物学研究提供重要方法参考。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

低体积通气培养系统的初步开发部分得到了美国国家科学基金会（CRI-OA-1416690，资助对象：狄金森学院）的支持。劳伦·穆利尼尔博士慷慨提供了伍兹霍尔海洋研究所的实验室设施，本系统所展示的数据（图4）即在此采集。

1. 建立和维持C. fornicata幼体培养的常规操作
注意：本方法起始于一个装有海水的加仑（3.8 L）广口瓶，海水中含有刚释放出孵育的面盘幼虫的成体C. fornicata。成体可从野外采集，或从材料表中列出的供应商处获得。材料表中给出了相关供应商信息。这些成体为雄性先熟的雌雄同体，以交配堆叠的方式生活，堆叠底部为固着生活的孵育雌性个体。请勿打散成体的堆叠结构。繁殖的季节性特征以及非繁殖季节诱导成体产卵的预处理方法此前已有描述17。幼虫在释放后2–3小时内收集最佳，此时幼虫具有强烈的负趋地性，会聚集在广口瓶的水面附近。
<ol>
	<li>通过剪掉一个400 mL一次性塑料三角烧杯的底部，并在其上粘贴一块236 µm的尼龙筛网，制作一个筛子。为此目的，尤其是用于中型生态系统（mesocosm）的构建（见下文），应使用专为聚乙烯材料具有良好粘附性的热熔胶。</li>
	<li>停止成体培养罐中的通气，静置15–20分钟，使碎屑沉降，幼虫可轻松游至水面。</li>
	<li>将幼虫通过一段短玻璃管（直径5 mm，长15–20 cm）虹吸，该玻璃管固定在一段60–80&#160;cm长的软质塑料水族管末端，导入上述制备好的筛子中，筛子悬置于一个600 mL玻璃烧杯内，使过量海水从烧杯溢出，而幼虫被截留在筛网上。保持筛子底部浸没在水中，避免幼虫滞留干涸。</li>
	<li>短暂将筛子从烧杯中提起，使用装有滤过海水（FSW）的冲洗瓶，将幼虫冲洗至一个大小适中、便于在低倍解剖显微镜下操作的玻璃培养皿中的滤过海水中。 
	注：C. fornicata的幼虫在盐度约为30 ppt的滤过天然海水或配制成32 ppt盐度的Instant Ocean人工海水、温度20–25 °C条件下生长良好17,18。使用孔径&#60; 1 µm的过滤足以去除可能对实验室培养造成问题的污染性表生原生生物。</li>
	<li>使用巴斯德移液管手动将所需数量的幼虫转移至培养罐中，并进行计数。为获得最佳效果，C. fornicata的培养建议按每5 mL培养液体积接种1只幼虫。务必准确计数幼虫，避免估算数量。</li>
	<li>在开始培养时给予幼虫所需量的微藻饲料，并每隔一天在更换培养液时同步更换微藻。 
	注：以每毫升1 × 105个细胞的Isochrysis galbana（T-ISO品系）作为饲料，是一种良好的标准食谱，可获得接近最大值的实验室生长速率。T-ISO的饲喂量及培养方法详见先前发表的研究17。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养液，方法是将培养物倒入置于烧杯中的筛子内，操作同上文步骤1.3&#160;。取出筛子后，用装有滤过海水（FSW）的冲洗瓶将幼虫冲洗至含有新鲜FSW和新饲料的培养罐中。 
	&#8203;注：最佳操作是将用于幼虫培养的所有玻璃器皿单独存放，避免其接触固定剂、可溶性重金属盐或洗涤剂。常规清洗建议使用碳酸氢钠（NaHCO3）糊剂配合尼龙刷垫进行，而矿物沉积物可用白醋或稀盐酸进行轻度酸洗去除。</li>
</ol>
2. 构建C. fornicata幼虫的通气培养系统
注意：推荐使用的玻璃罐（材料表）配有聚丙烯盖，该材质对海水呈惰性，且厚度适宜，可牢固固定通气气体流的管路接头入口。
<ol>
	<li>在每个培养罐的盖子（包括盖子的内衬）上钻两个直径为5 mm的孔，每个孔距离边缘约1.5 cm，且两孔相对分布。（使用13/64英寸英制或#7 ASME标准机械钻头也可打出合适的通孔）。</li>
	<li>在每个孔中安装一个1/8英寸×10-32螺纹尼龙管接头，使用10-32尼龙螺母固定，使管接头的带倒刺端位于盖子外表面。</li>
	<li>在其中一个管接头螺纹内端的孔口处涂抹少量硅胶水族密封剂，从罐内侧将一段20 cm长、外径为2 mm的聚乙烯管穿过孔口，使其从管接头倒刺端外侧略微突出几毫米。</li>
	<li>此时聚乙烯管末端将带有少量水族密封剂形成的塞状物，但在倒刺端外侧仍可清晰看到透明管体。待密封剂固化后，修剪聚乙烯管的突出部分，使其末端与管接头倒刺端齐平。</li>
	<li>向培养罐中加入过滤海水（FSW），液面距罐顶肩部约1 cm，拧紧盖子，并将通气空气或实验气体混合物的供气管连接至装有聚乙烯通气管的管接头倒刺端。修剪通气管长度，使其末端恰好平齐地置于罐底。</li>
	<li>调节通气空气或气体混合物的流量，使产生缓慢的气泡流（图1）。可使用普通水族空气泵配合水族多路阀门提供环境空气通气，或使用质量流量控制器提供其他实验所需的气体混合物14。</li>
</ol>
3. 用于幼虫的可野外部署的中型生态系统培养装置的构建 C. fornicata
<ol>
	<li>在标准的7加仑聚乙烯桶的侧面切割4个等距分布的矩形开口，每个开口尺寸为25 cm × 14.5 cm。每个开口的底部距离桶内底部约3.5 cm图2A）。手持式电动马刀锯配细齿锯片最适合此用途。保留切下的废料部分，使用台式锯将其纵向切成宽2厘米的条状。</li>
	<li>剪下4块236 µm尼龙网片，每块至少30 cm × 20 cm，确保能够完全覆盖桶上切出的开口并留有至少2 cm的重叠余量。使用小型弹簧夹或衣夹将一块网片的一条长边临时固定在对应开口的一条长边上。</li>
	<li>使用适用于聚乙烯的热熔胶将网片边缘粘接到桶口。第一条边固定后，在保持张力的同时将其他边缘依次粘接，使网片表面绷紧。</li>
	<li>修剪3.1步骤中得到的桶体废料条，制成加固条，以整齐覆盖网格面板与桶口重叠处的粘合区域。使用足量的热熔胶将每条加固条压紧就位，操作需迅速，确保在胶水凝固前完成每条加固条的粘贴。</li>
	<li>用尼龙盲铆钉从桶的外侧固定每条加强条的末端。使用美工刀修剪加强条外边缘多余的胶水和网状材料。 
	注意：每个铆钉需要一个 15/64 英寸的导孔。铆钉的内部（盲端）部分在完成的中型生态系统装置内侧可见 图2B.</li>
	<li>将中宇宙系统部署在浮架上，使桶的顶部高出水面足够高度（图 2C所示的漂浮架由30 cm长的2英寸40号PVC管段构成，使用弯头和三通接头粘合连接，形成一个气密结构，可承载一排4个重复的中型生态系统（mesocosm）。</li>
	<li>根据当地条件，网箱面板可能在1至2天内出现污损，从而阻碍围隔内海水的交换。一旦发生此类情况，应将幼体转移至新的清洁围隔中，方法是将已污损的围隔拉出约三分之二rd 从水中取出，然后用2 L的水壶从其底部反复舀水倒入新的中宇宙装置中。</li>
	<li>进行20至25次操作以转移大部分幼体，或直至在污染的中型生态系统中不再观察到幼体为止。使用浸有碳酸氢钠（NaHCO₃）糊状物的软海绵轻轻擦洗网板，清洁污染的中型生态系统。3）并用自来水冲洗。</li>
</ol>

Culturing Larvae of Crepidula fornicata in Laboratory and Field Conditions

<ol><li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryology+of+Crepidula%3A+a+contribution+to+the+cell+lineage+and+early+development+of+some+marine+gastropods%5BTitle%5D)+AND+%22Gasteropods%22%5BJournal%5D)">The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods.</a> Gasteropods. , (1897).</li>
<li>Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slipper+snail%2C+Crepidula%3A+an+emerging+lophotrochozoan+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li>
<li>Lyons, D. C., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slipper+snail+tales%3A+how+Crepidula+fornicata+and+Crepidula+atrasolea+became+model+molluscs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs.</a> Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).</li>
<li>Blanchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata+%28L.+1758%29+in+Europe.+Current+state+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22ScientiaMarina%22%5BJournal%5D)">Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences.</a> ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).</li>
<li>Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+reproductive+dynamics+of+the+invasive+slipper+limpet%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Mar+Biol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).</li>
<li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+temperature%2C+growth+rate%2C+and+duration+of+planktonic+life+for+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+%28L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Mar+Biol+Ecol%22%5BJournal%5D)">The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).</li>
<li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+effects%3A+surprising+consequences+of+embryonic+and+larval+experience+on+life+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Ecol+Marine+Invertebrate+Larvae%22%5BJournal%5D)">Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis.</a> Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).</li>
<li>Pechenik, J. A., Gee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+metamorphic+competence+in+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+%28L.%29%2C+judged+by+a+natural+and+an+artificial+cue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Mar+Biol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).</li>
<li>Taris, M., Comtet, T., Viard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+function+of+nitric+oxide+on+the+onset+of+metamorphosis+in+competent+larvae+of+Crepidula+fornicata%3A+A+transcriptional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Genomics%22%5BJournal%5D)">Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective.</a> Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).</li>
<li>Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+settlement+in+veliger+larvae+of+the+gastropod%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata.</a> Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).</li>
<li>Meyer-Kaiser, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carryover+effects+of+brooding+conditions+on+larvae+in+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Ecol+Prog+Ser%22%5BJournal%5D)">Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata.</a> Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).</li>
<li>Noisette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+encapsulation+protect+embryos+from+the+effects+of+ocean+acidification%3F+The+example+of+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata.</a> PLoS One. 9 (3), e93021(2014).</li>
<li>Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resilience+of+Atlantic+slippersnail+Crepidula+fornicata+larvae+in+the+face+of+severe+coastal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Mar+Sci%22%5BJournal%5D)">Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification.</a> Front in Mar Sci. 5, 312(2018).</li>
<li>Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legacy+of+multiple+stressors%3A+Responses+of+gastropod+larvae+and+juveniles+to+ocean+acidification+and+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition.</a> Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).</li>
<li>Pechenik, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+ocean+acidification+on+growth%2C+onset+of+competence%2C+and+perception+of+cues+for+metamorphosis+in+larvae+of+the+slippershell+snail%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata.</a> Mar Biol. 166, 128(2019).</li>
<li>Reyes, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+gastropod+Crepidula+fornicata+remains+resilient+to+ocean+acidification+across+two+life+history+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages.</a> Front Physiol. 12, 702864(2021).</li>
<li>Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+seawater+culture+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+for+studies+of+larval+settlement+and+metamorphosis.+In%3A+Carroll%2C+D.%2C+Stricker%2C+S.+%28eds%29+Developmental+biology+of+the+sea+urchin+and+other+marine+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates.</a> Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).</li>
<li>Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interactive+influence+of+temperature+and+salinity+on+larval+and+juvenile+growth+in+the+gastropod+Crepidula+fornicata+%28L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Mar+Biol+Ecol%22%5BJournal%5D)">The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).</li>
<li>Strathmann, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrathmann%2C+MF+%22Reproduction+and+Development+of+Marine+Invertebrates+of+the+Northern+Pacific+Coast%3A+Data+and+Methods+for+the+Study+of+Eggs%2C+Embryos%2C+and+Larvae%22">Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae</a>. , University of Washington Press. (1987).</li>
<li>Clark, H. R., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+fluctuations+in+CO2+and+dissolved+oxygen+concentrations+do+not+provide+a+refuge+from+hypoxia+and+acidification+for+early-life-stage+bivalves%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Ecol+Prog+Ser%22%5BJournal%5D)">Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves.</a> Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114(2016).</li>
<li>Gobler, C. J., Baumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+acidification+in+ocean+ecosystems%3A+coupled+dynamics+and+effects+on+marine+life%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life.</a> Biol Lett. 12 (5), 20150976(2016).</li>
<li>Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+larval+and+juvenile+growth+rates+in+two+marine+gastropods%2C+Crepidula+plana+and+C%5BTitle%5D)+AND+%22fornicata.+Mar+Biol%22%5BJournal%5D)">Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C.</a> fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).</li>
<li>Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+food+on+metamorphic+competence+in+the+model+system+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata.</a> Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).</li>
<li>Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coastal+ocean+acidification%3A+the+other+eutrophication+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Estuarine%2C+Coast+Shelf+Sci%22%5BJournal%5D)">Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem.</a> Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).</li>
</ol>

无任何利益冲突需要报告。

尽管与其它浮游营养型海洋幼虫相比，C. fornicata 的幼虫相对容易培养，但仍必须严格遵守良好的培养操作基本规范17,19。健康的幼虫应在孵化后立即开始摄食。可通过解剖显微镜下透射光观察幼虫肠道是否充满藻类细胞，于孵化后第二天轻松验证其摄食情况。健康幼虫的壳应保持清洁、光亮，无固着纤毛原生动物或舟形硅藻等附着物，后者在高密度培养中会迅速扩散。壳体附着物会阻碍幼虫游动和摄食，导致死亡，通常表明培养物中幼虫密度过高。
在通气的实验室培养条件下记录的幼虫生长速率和获得变态能力的时间，与先前使用该方法早期版本在相似幼虫密度、pH、温度、盐度和食物供给条件下进行的实验室实验所发表的结果相似13,14,16。本文所述方法与上述研究中所用方法之间唯一的实质性差异在于，本实验中通过一根外径为2 mm的管道将通气气体从培养瓶底部引入，形成气泡流，而不是让气体通过培养瓶液面上方的顶空区域。这种由气泡流产生的水体循环和混合对幼虫生长及获得变态能力并无不利影响，并且可能有利于需要培养海水快速与变化的气体混合物达到平衡的实验，例如研究CO2和溶解O2分压昼夜循环效应的实验，这类情况常见于生产力较高的近岸海洋环境20,21。
中宇宙实验结果得到的幼虫生长速率超过了以往任何实验室研究报道的数值，且变态能力获得时间最短22,23。尽管本研究结果是在对幼虫生长和发育明显极为有利的野外条件下获得的，但该方法在探索自然环境中存在多种环境胁迫因子组合的野外位点的幼虫表现时应具有最高的信息价值，包括对管理和修复工作具有重要意义的濒危和退化生境24。

由于可作为发育生物学研究的模式生物，以及作为入侵物种对生态环境造成广泛影响，笠螺 Crepidula fornicata（腹足纲：Calyptraeidae）在当前及历史研究文献中均有充分记载。在实验胚胎学的经典时代，它曾是研究螺旋卵裂发育模式的基础性范例1，并随着现代成像技术和基因组学工具的应用，重新成为研究担轮动物（lophotrochozoan）早期发育机制的重要对象2,3。在其生活史的另一阶段，其他研究则聚焦于这种生态系统工程师在远离其原生分布区——北美东部的温带沿海海洋环境中，成体种群所造成的生态影响4,5。介于胚胎与成体之间，该物种的面盘幼虫（veliger larvae）已成为幼虫发育与生态学研究的常见对象，尤其涉及影响幼虫生长及变态能力获得的因素、调控幼虫附着的内外部信号，以及幼虫期经历对稚贝阶段表现的影响等课题6,7,8,9,10,11。近期研究表明，C. fornicata 的幼虫和稚贝对海洋酸化具有较强的耐受能力，这为该动物的进一步研究提供了又一富有前景的方向12,13,14,15,16。
研究海洋幼虫生物学时，C. fornicata 的一个优势在于，其在实验室中使用天然或人工海水，并以定鞭藻 Isochrysis galbana 作为单藻类食物进行培养相对容易。作者曾在早期以方法学为重点的印刷出版物中详细描述过相关培养方法17。本研究的贡献主要有两点：首先，建立和维护培养体系所涉及的常规操作步骤在概念上非常简单，但若无实际操作或视频演示，很难正确掌握；其次，本文介绍了对先前所述培养方法的两种改进，特别适用于针对海洋酸化、富营养化和缺氧等环境胁迫因素的实验室与野外研究。第一种为小体积（800 mL）培养系统，可通过小体积鼓泡气体精确调控海水的 pH 和溶解氧水平；第二种为较大体积（15 L）的中型模拟生态系统（mesocosm）系统，可置于野外环境中，并允许周围海水自由交换。

<table><tbody><tr><td>聚乙烯桶，7加仑</td><td>US Plastic</td><td>16916</td><td>用于中型生态系统（mesocosm）</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Crepidula fornicata&lt;/em&gt;</td><td>海洋生物实验室，海洋资源中心</td><td>760</td><td>成体亲本种群</td></tr><tr><td>热熔胶，Infinity Supertac 500</td><td>Hotmelt.com</td><td>INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB</td><td>适用于聚乙烯材料的粘接</td></tr><tr><td>玻璃罐，32盎司，带聚丙烯盖</td><td>Uline</td><td>S-19316P-W</td><td>用于800 mL通气培养</td></tr><tr><td>尼特克斯筛网，236 &amp;micro;m</td><td>Dynamic Aqua Supply Ltd.</td><td>NTX236-136</td><td>用于中型生态系统（mesocosm）</td></tr><tr><td>六角螺母，尼龙材质，10-32螺纹</td><td>Home Depot</td><td>1004554441</td><td>用于固定管接头</td></tr><tr><td>铆钉，尼龙材质，盲铆型，直径15/64&quot;，夹持范围5/32&quot;–5/16&quot;，每包8个</td><td>NAPA auto parts</td><td>BK 6652844</td><td>每个中型生态系统需4包</td></tr><tr><td>管接头，1/8&quot; × 10-32螺纹</td><td>US Plastic</td><td>65593</td><td>每个培养罐需2个</td></tr><tr><td>聚乙烯管，外径2.08 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11G</td><td>用于培养罐内通气气流</td></tr><tr><td>特龙管（Tygon），1/8&quot;×3/16&quot;×1/32&quot;</td><td>US Plastic</td><td>57810</td><td>适配管接头，用于培养通气</td></tr></tbody></table>

实验室与野外环境下鞋笠螺（crepidula fornicata）幼虫的培养

Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata

帽贝科腹足类软体动物Crepidula fornicata已被广泛用于幼虫发育生物学、生理学和生态学的研究。该物种的孵化期面盘幼虫通过成体自然释放后，用虹吸法收集到筛网上，以200/L的密度分配至培养体系中，并以等鞭金藻（T-ISO品系，Isochrysis galbana）为饵料，投喂浓度为1 × 105 个细胞/mL。通过在通风的800 mL培养体系中培育同胞幼虫，记录其壳体生长情况以及变态能力的获得过程，该培养体系设计用于与环境空气或特定大气气体混合物达到平衡。与上述实验室培养条件相对照，还在野外繁殖成体种群附近设置了一个15 L的流水式自然海水中型模拟生态系统（mesocosm），用于收集在该环境中培育幼虫的生长和变态能力数据。实验室培养条件下的幼虫生长速率和获得变态能力的时间与以往发表的研究结果相似；而在野外中型模拟生态系统中培育的幼虫生长显著更快，且比所有已报道的实验室研究中的幼虫更早达到变态阶段。综上，这些方法适用于在实验室预设的受控条件下以及在野外自然条件下开展幼虫发育的研究。

在4个同时进行的重复实验中，对800 mL通气培养体系中的幼虫生长及变态能力获得情况进行测定，每个培养体系含有160条幼虫，幼虫来源于同一卵块孵化的同胞批次，并进行投喂 Isochrysis galbana 密度为 1 x 105 细胞/mL。pH 为 7.9–8.0，温度为 20–21 °C，盐度为30–31 ppt。另取一批同源幼虫，在美国马萨诸塞州布兹德湾（Buzzards Bay, MA, USA）进行一次15 L中型生态系统实验，实验条件与实验室培养相似，pH、温度和盐度相同，但通过中型生态系统的网状面板流入周围海水，以天然浮游植物为饵料，共投放600条幼虫，用于测定其生长与变态情况。实测pH为7.8–8.3，温度为20–24 °C，盐度为26-28 ppt。生长情况通过壳长的变化来确定（图3）。幼虫在中型生态系统（mesocosm）中的生长速度更快（71 µm/day) 而实验室培养物中的含量则较低（54 µm/day孵化后的最初4-5天内（图4）。在 5th 和 6th 天后，中型实验系统中的幼虫开始自发变态，第6天仍留在中型实验系统中的幼虫平均为 181 µm 比第5天更大。由于大多数个体在第7天时已完成变态，因此未再对中型实验系统中的幼体进行后续测量。实验室培养中的幼体在第4天至第8天期间生长速度明显较慢41 µm/day）以及从第8天到第13天（31 µm/day）。这些幼虫在第8天开始获得变态能力，到第12天时几乎全部具备变态能力，通过用高浓度[K+]，在8实验室培养中自发变态的情况很少&lt;在实验终止的第13天，存活率为91%–100%（实验室培养物中）；由于难以检查和回收中型生态系统装置内所有个体，中型生态系统中的存活率未测定。
<img alt="厌氧消化实验；广口瓶中的生物甲烷产生，标注了气体分析的顺序。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66208/66208fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：通气培养装置。 该图显示了800 mL的通气培养体系，其中含有Crepidula fornicata的幼虫，培养密度为每5 mL 1条幼虫。注意可见细小的气泡流，尤其在2号和4号广口瓶中更为明显。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66208/66208fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于水生研究的采样过滤装置（带网桶）；俯视图及水下状态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66208/66208fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：可野外部署的中型生态系统培养装置。 该图显示了15 L的中型生态系统装置，（A）侧视图，（B）俯视图，以及（C）在浮架中部署的装置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66208/66208fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像：显示标记结构 s、v、f、o 的胚胎解剖图，用于发育研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66208/66208fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：Crepidula fornicata 孵化后第 4 天的面盘幼虫。 虚线表示壳长测量轴线。缩写：s = 壳；v = 面盘；f = 足；o = 操作器。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66208/66208fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="壳生长分析；线形图；壳长 vs. 孵化后天数；实验数据点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66208/66208fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：Crepidula fornicata 幼虫在实验室与野外培养条件下的生长情况。 800 mL 实验室培养（虚线，空心圆）与 15 L 野外中型生态系统（实线，实心方块）中幼虫的生长情况。每个数据点代表来自4个重复实验室培养中每个培养15只幼虫的平均值，或来自单个中型生态系统的25只幼虫的平均值。误差线表示 ± 1 SD。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66208/66208fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了在小体积实验室规模系统以及可在野外部署的常温海水模拟生态系统中培养腹足类动物Crepidula fornicata幼虫的方法。

实验室与野外环境下鞋笠螺（Crepidula fornicata）幼虫的培养

帽贝科腹足类软体动物 Crepidula fornicata 已被广泛用于幼虫发育生物学、生理学和生态学的研究。该物种行育幼……

我关注的是海洋幼虫的发育如何受到多种环境因素和应激因子的影响，以及幼虫神经系统如何整合来自环境的信息，以调控幼虫的附着、变态为底栖幼体，并最终补充到成体种群中。某些海洋物种的幼虫，例如勺形扁螺（Crepidula fornicata），对海洋酸化具有较强的耐受性，但酸化与其他因素（如营养状况和盐度）之间存在重要的相互作用。目前我们对幼虫在自然环境中的生长、发育和行为仍知之甚少。野外中型生态系统观测可填补其中部分空白，并为实验室操控实验提出待检验的假设。我们可初步探究，在易受人类活动影响的高产近海环境中，面对短时间尺度变化的胁迫因子，幼体在神经行为学、发育学及转录水平上如何应对。首先，停止对含有成体Crepidula fornicata的容器进行通气。将容器静置15至20分钟，使杂质沉淀。接着，将一段短的5毫米宽玻璃管固定在柔软的塑料水族箱管上。待幼虫上浮后，将筛网置于一个600毫升的玻璃烧杯上方。然后通过软管将幼虫虹吸至筛子中。将筛子短暂提起，倒置，并用过滤的海水冲洗筛子底部，将幼虫冲入盛有过滤海水的玻璃碗中。首先，在罐子的盖子上钻两个直径五毫米的孔。使用一个10-32尼龙螺母在每个孔中安装一个接头。在接头螺纹内侧开口处涂抹少量硅橡胶水族密封剂。将一段20厘米长、2毫米宽的聚乙烯管穿过开口。让管路末端的密封剂固化，然后修剪突出的部分，使其与管路接头末端齐平。首先，将盛有Crepidula fornicata幼虫的玻璃碗放置在解剖显微镜的载物台上。使用巴斯德移液管，将所需数量的幼虫手动转移至含有过滤海水的培养瓶中，并进行计数。用适量的微藻喂养幼虫。添加过滤海水，使培养液面升至距离瓶肩约1厘米处。拧紧培养罐的盖子，并将通气管路连接到通向罐底的鲁尔接头。使用普通水族箱空气泵和水族箱多路阀，以环境空气进行通风。然后调节气流，使气泡以稳定且缓慢的速度持续产生。更换培养水时，将烧杯中的内容物倒入置于烧杯上方的筛子中。将装有新鲜过滤海水的培养烧杯倒置于筛子上方。然后用装有过滤海水的冲洗瓶将幼虫冲洗入烧杯中。加入一些微藻作为幼虫的食物，并用过滤的海水加满至瓶肩下方1厘米处。与中型生态系统培养相比，实验室培养的皱纹盘螺（Crepidula fornicata）幼虫生长速度较慢。幼虫从第8天开始变态，到第12天全部具备变态能力。首先，使用手持式电动弓锯在标准七加仑聚乙烯桶的侧面切割出四个等距的矩形开口。使用台锯将切下的部件沿长度方向切成宽两厘米的条状。裁剪四块尼龙网，使其能够覆盖并重叠在桶的开口上。用小型弹簧夹将网片的一边临时固定在切口的长边上。然后使用热熔胶将网片边缘粘接到桶口上。第一条边固定后，在保持网片张力紧绷的情况下，继续将其他边缘依次粘接固定。接下来，修剪切割下来的部件末端，使其能够覆盖在面板的粘合区域上。使用足量的热熔胶将每条覆盖条压紧固定。最后，从桶外侧安装尼龙盲铆钉，将每条覆盖条的末端固定牢固。使用美工刀修剪加固条边缘多余的胶水和网状物。在中型生态系统中，东方扁玉螺（Crepidula fornicata）的幼虫生长速度似乎比实验室培养条件下更快。幼虫在第五至第六天之间自发发生变态。到第七天时，几乎所有幼虫都已完成变态。

laboratory-field-culture-larvae-slipper-limpet-crepidula

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

鹦鹉幼虫 Crepidula fornicata 幼虫的实验室和田间培养

最近，蜡螟 Galleria mellonella 的幼虫已被确立为研究 Legionella pneumophila 感染的 in vivo 模型。本文中，我们展示了利用该幼虫模型表征 Legionella...

使用Galleria mellonella作为模式生物研究Legionella pneumophila感染

本视频实验方案展示了一种利用雌雄同体的淡水螺 Lymnaea stagnalis...

雄性附属腺体产物对腹足类软体动物产卵的影响

本实验方案的目的是为用户提供一套高通量去壳方法 Lymnaea stagnalis 用于整体封片的胚胎和幼虫制备 原位...

整体封片 原位 腹足类软体动物杂交方法 Lymnaea stagnalis

脂肪酸13C同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

藤壶Balanus (Amphibalanus) improvisus是研究渗透压调节和防污性能的模式生物。然而，其自然的季节性繁殖导致藤壶幼虫（cyprid larvae）的供应不可预测。本文介绍了一种全年培养B.

藤壶 Balanus improvisus 作为海洋模式生物——培养与基因表达

用于播散性念珠菌病的 Galleria mellonella 蜡虫感染模型

本文介绍了两种实验方案：1）针对联邦濒危物种迈阿密蓝蝶（Cyclargus thomasi bethunebakeri）的实验室人工繁育，以及...

濒危蝴蝶人工繁育项目以增进生活史认知与有效异地保护技术

为了在组学研究中使用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans），需要一种能够培养大量线虫种群的方法，以便在同一份样品上进行多种平台的检测，实现比较分析。本文介绍了一种在大规模培养板（LSCPs）上培养C.

大规模混合阶段的培养与检测 秀丽隐杆线虫 种群

为了获得无菌昆虫，需对其卵表面进行消毒，孵化后的幼虫随后使用无菌叶片进行饲养。该方法为无菌昆虫的制备提供了一种高效途径，无需使用抗生素或开发人工饲料，也可应用于其他食叶昆虫。...

利用组织培养幼苗制备和饲养无菌昆虫以研究叶甲虫宿主-肠道微生物互作

本文概述了标准化可食用蟋蟀Gryllus...

维持实验室培养的双斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus），一种适用于昆虫养殖与无脊椎动物生理学研究的多功能直翅目模式生物

本文概述了低等双翅目蝇类Bradysia (Sciara)...

下双翅目蝇类 Bradysia (Sciara) coprophila 的实验室培养：一种新兴/传统的模式生物

了解滑履螺Crepidula fornicata幼虫的实验室与野外中宇宙培养技术，比较不同环境条件下幼虫生长速度与变态时间的差异，为海洋无脊椎动物发育生物学研究提供重要方法参考。

实验室与野外环境下鞋笠螺（Crepidula fornicata）幼虫的培养

探索更多视频