Name: 精液中过氧化物酶阳性白细胞的检查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 了解精液中过氧化物酶阳性白细胞的经济高效检测方案，结合手动与自动测量方法计算白细胞浓度。该方案利用CASA系统提升男科实验室分析效率，60分钟内完成检测并降低成本。

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作者感谢中山大学附属第三医院生殖医学中心男科实验室为本研究提供了实验设施。本文撰写过程中未涉及任何资助。

本研究已通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会的审查与批准。
1. 工作溶液的配制
<ol>
	<li>准备以下试剂以配制工作液：邻甲苯胺底物溶液、饱和氯化铵（NH4Cl）溶液、148 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA）溶液和 6%（v/v）过氧化氢溶液。将这些试剂与所需工具（如移液器（1000 µL、200 µL、10 µL）和试管架）一同放置于室温（RT）实验台上。 
	注意：操作上述试剂前，请阅读安全数据表（SDS）。</li>
	<li>准备一个不透光的棕色试剂瓶，用于储存配制好的工作液，并避免其暴露于光照下。</li>
	<li>按照以下指定比例，将试剂转移至不透光的棕色试剂瓶中：
	<ol>
		<li>使用 200 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 100 µL，然后将 100 µL 的 NH4Cl 溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中。</li>
		<li>更换移液器吸头，使用上述 200 µL 移液器将 100 µL 的 148 mmol/L Na2EDTA 溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中，随后轻轻吹打混匀，并充分均质化溶液。</li>
		<li>使用 1000 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 900 µL，然后将 900 µL 的邻甲苯胺底物溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中，轻轻吹打混匀，并充分均质化溶液。</li>
		<li>使用 10 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 5 µL，然后将 5 µL 的 6%（v/v）过氧化氢溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 1000 µL。更换移液器吸头，轻轻吹打混匀，并充分均质化不透光棕色试剂瓶中的溶液。</li>
	<li>将配制完成的工作液储存于不透光的棕色试剂瓶中，在室温下避光保存。该工作液在 24 小时内具有反应活性。</li>
	<li>每个精液样本需使用 900 µL 工作液。确保每日配制的工作液量与当日检测样本数量相匹配。</li>
</ol>
2. 精液样本的制备
<ol>
	<li>在采集精液样本前，应确保患者按照世界卫生组织（WHO）《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）8的要求，禁欲2至7天。推荐采用手淫方式获取精液样本。为提高检查的准确性，应指导患者收集全部射出的精液。</li>
	<li>提前打开恒温台并预热至37 °C，以确保后续精液样本的液化过程顺利进行。</li>
	<li>收到患者的精液样本后，应仔细记录详细信息，包括识别编号、采集时间、禁欲时长及其他相关信息，标注在聚合物材质容器的外壁上。</li>
	<li>将盛有精液样本的聚合物容器置于已预热至37 °C的恒温台上，有助于精液的液化。</li>
	<li>用聚合物材质的移液管吸取精液样本，每隔5分钟观察一次液化状态，直至精液完全液化。</li>
	<li>若精液样本在30分钟内未完全液化，暂不进行检查；继续等待30分钟。若60分钟后仍未完全液化，可加入等体积的磷酸盐缓冲液进行1:1稀释，并轻轻振荡以促进液化。</li>
	<li>充分振荡并均匀混匀后，保留已完全液化的精液样本，用于后续检查步骤。</li>
</ol>
3. 过氧化物酶阳性白细胞的染色及原始精液样本的分析
<ol>
	<li>采样前，使用聚合物材质的移液器反复吹打，充分混匀待检测的精液样本。</li>
	<li>使用200 µL移液器，通过旋转调节旋钮将量程设为100 µL。更换移液器吸头，然后将100 µL精液样本转移至离心管中。</li>
	<li>使用1000 µL移液器，通过旋转调节旋钮将量程设为900 µL。更换移液器吸头，然后将900 µL上述工作液转移至离心管中。</li>
	<li>使用1000 µL移液器反复吹打，充分混匀由精液样本与工作液组成的反应液。</li>
	<li>将离心管放入试管架中，置于二维摇床上，在室温下以200 rpm持续振荡30分钟。</li>
	<li>在等待染色反应的同时，使用CASA系统分析精液样本，测定聚合物容器中原始精液样本的精子浓度。
	<ol>
		<li>打开CASA系统的电源开关，双击SCA SCOPE图标以启动应用程序软件。</li>
		<li>采样前，再次使用聚合物材质的移液器反复吹打，充分混匀原始精液样本。</li>
		<li>使用10 µL移液器，通过旋转调节旋钮将量程设为10 µL。更换移液器吸头，吸取10 µL原始精液样本，加入SCA计数板中。静置60秒，待精液样本停止漂移。</li>
		<li>将SCA计数板放置于CASA系统的样本载架上，在应用程序软件的对话框中输入患者信息，准备正式检测。</li>
		<li>点击开始按钮，使用CASA系统检测SCA计数板中的原始精液样本，并记录必要的数据，如精子浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 过氧化物酶阳性白细胞与精子的观察
<ol>
	<li>使用 1000 µL 移液器，通过旋转刻度调节至 1000 µL。更换移液器吸头，反复吹打并充分混匀反应物，该反应物为 30 分钟反应过程结束时离心管中的精液样本与工作液的混合物。</li>
	<li>使用 10 µL 移液器，通过旋转刻度调节至 10 µL。更换移液器吸头，吸取上述反应物 10 µL，转移至精子计数室中。最后，用专用盖玻片覆盖精子计数室。</li>
	<li>将精子计数室置于显微镜载物台上，打开配备两个 10x 目镜的光学显微镜电源开关。随后等待 60 秒，使反应样本停止漂移。</li>
	<li>在等待期间，将显微镜转换器切换至 10x 物镜。然后依次调节粗调旋钮和微调旋钮。最后在 10×10 倍放大倍数下观察精子和圆形细胞。</li>
	<li>确定待分析视野后，将显微镜转换器切换至 40x 物镜，在 10 × 40 倍放大倍数下观察精子和呈棕色的过氧化物酶阳性白细胞。</li>
	<li>使用电子计数系统，在相应视野内至少计数 200 个精子以及棕色过氧化物酶阳性白细胞的数量。</li>
</ol>
5. 过氧化物酶阳性白细胞浓度的计算
<ol>
	<li>通过使用以下公式计算过氧化物酶阳性白细胞的浓度： 
	<img alt="白细胞-精子比例公式，方程，浓度分析，教学示意图" src="/files/ftp_upload/66211/66211eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></li>
</ol>

Analysis of Semen for Peroxidase-Positive Leukocyte Cells

<ol><li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reprod Biol Endocrinol. 13, 37(2015).</li>
<li>Sharlip, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+policies+for+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Best practice policies for male infertility.</a> Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).</li>
<li>Choy, J. T., Eisenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+infertility+as+a+window+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Male infertility as a window to health.</a> Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).</li>
<li>Pellati, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genital+tract+infections+and+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Genital tract infections and infertility.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).</li>
<li>Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+management+of+male+genital+tract+infections+in+the+setting+of+male+infertility%3A+an+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Urol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review.</a> Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).</li>
<li>Long, S., Kenworthy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+cells+in+diagnostic+semen+analysis%3A+A+guide+for+laboratories+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians.</a> Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).</li>
<li>Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%27round+cells%27+in+semen+analysis%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study.</a> Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Laboratory+Manual+for+the+Examination+and+Processing+of+Human+Semen.+5th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn.</a> World Health Organization. , (2010).</li>
<li>Domes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+and+effect+of+bacteriospermia+and+elevated+seminal+leukocytes+on+semen+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters.</a> Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).</li>
<li>Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+associations+between+specific+sperm+morphological+defects+and+leukocytospermia%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia.</a> Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).</li>
<li>Alahmar, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+oxidative+stress+in+male+infertility%3A+An+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of oxidative stress in male infertility: An updated review.</a> J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).</li>
<li>Schlegel, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+infertility+in+men%3A+AUA%2FASRM+guideline+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I.</a> J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).</li>
<li>Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+detection+in+human+semen+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Leukocyte detection in human semen using flow cytometry.</a> Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).</li>
<li>Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+guidelines+for+the+evaluation+and+treatment+of+leukocytospermia+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Mens+Health%22%5BJournal%5D)">Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility.</a> World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).</li>
<li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function%3A+from+mechanisms+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).</li>
<li>Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+as+an+active+disease+biomarker%3A+recent+biochemical+and+pathological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives.</a> Med Sci (Basel). 6 (2), 33(2018).</li>
<li>Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+pathological+studies+on+peroxidases+-an+updated+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Glob+J+Health+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review).</a> Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).</li>
<li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-derived+hypochlorous+acid+promotes+ox-LDL-induced+senescence+of+endothelial+cells+through+a+mechanism+involving+beta-catenin+signaling+in+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia.</a> Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).</li>
<li>Nicholls, S. J., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase and cardiovascular disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).</li>
<li>Wolff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biologic+significance+of+white+blood+cells+in+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The biologic significance of white blood cells in semen.</a> Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).</li>
<li>Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertonic+saline+enhances+neutrophil+elastase+release+through+activation+of+P2+and+A3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

邻甲苯胺和过氧化氢具有光敏性，暴露在光线下可能发生分解。为确保检测试剂的有效性，建议将配制好的工作液保存在避光处。
精液样本通常表现出异质性特征。在精液样本制备过程中，正确判断精液的液化状态，并在每次取样前充分均质化精液样本，对于提高检测结果的可靠性至关重要。精液样本通常在15分钟内完全液化。若超过60分钟仍未完全液化，应考虑采用机械均质或酶消化处理。在液化过程中，使用二维摇床持续轻轻振荡样本容器，可获得更均匀的精液样本8。
本文介绍的检测方法具有操作简便、快速且成本低廉的优点。然而，在某些情况下该方法可能存在局限性：过氧化物酶储存在嗜天青颗粒中，当细胞活化时，会通过脱颗粒或胞吐作用将酶释放到细胞外间隙21,22。因此，中性粒细胞可能无法被染色，从而难以识别。在此类情况下，需重复染色过程，甚至要求患者重新提供精液样本进行复检。为尽量减少此类情况的发生，建议尽可能使用新鲜的精液样本，并尽量缩短放置时间，同时采用轻柔的均质化处理。该方法仅能识别活动性病变或感染，无法检测疾病后期阶段的病变，例如慢性感染16。此外，其他过氧化物酶含量较低的白细胞类型，如淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞，使用该方法染色较为困难；因此，可通过白细胞抗原（如 CD45）免疫组织化学染色来获得可靠的结果。
根据世界卫生组织（WHO）第5版手册的要求，传统的髓过氧化物酶阳性染色（Endtz试验）需要在血细胞计数板中通过显微镜计数至少200个过氧化物酶阳性的白细胞，以计算其浓度8。与传统的手工Endtz试验相比，本方案结合了计算机辅助精子分析（CASA）检测获得的精子浓度数据，实现了手工与自动方法的结合。为计算过氧化物酶阳性白细胞的浓度，需在显微镜下对相应视野中至少200个精子和白细胞进行计数。由于精液中精子的浓度远高于白细胞，因此计数200个精子所需的时间比计数200个过氧化物酶阳性白细胞更短。
严重少精症、隐匿精子症和无精子症患者在计数足够数量的精子时常面临困难。在此类情况下，可使用血细胞计数板，按照计数板说明书中的方法直接计算过氧化物酶阳性白细胞的浓度。此外，对于无需使用计算机辅助精液分析（CASA）或缺乏CASA设备的实验室，也可利用血细胞计数板测定过氧化物酶阳性白细胞的浓度。

不孕症已成为影响约15%育龄夫妇的全球性公共卫生问题。男性因素约占所有生育力低下病例的50%，其中近20%至30%的病例可完全归因于男性因素1,2,3。男性生殖道感染（MGTIs）是导致男性不育的重要原因之一，约占病例总数的15%4,5。
大多数个体的精液中存在白细胞，占非精子细胞的13%，其中中性粒细胞占12%，巨噬细胞占0.9%，淋巴细胞占0.1%6,7。根据世界卫生组织（WHO）《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版），白细胞精子症通常定义为精液中白细胞浓度超过&#62;1 × 106 个/mL8。该病症可由多种因素引起，如环境毒素、药物滥用、精索静脉曲张、男性生殖道感染（MGTIs）等，这些因素均可能导致精液中白细胞浓度异常升高9。白细胞可提高精液中活性氧（ROS）水平，引发脂质过氧化以及对蛋白质和DNA的氧化损伤，从而导致精子活力下降、精子形态异常增加、精子DNA碎片化指数升高、精子顶体功能受损，甚至对胚胎发育产生负面影响10,11。
目前，男科医生在识别生殖道炎症时，通常选择检查精液中的圆细胞或精浆中的弹性蛋白酶。然而，脱落的生精细胞与生殖道上皮细胞往往难以区分，这不利于减少抗生素的滥用和不必要的使用6。后一种检测方法相对复杂且耗时较长，报告结果缓慢，不利于男性生殖道感染（MGTIs）等疾病的早期诊断与治疗。美国泌尿协会（AUA）建议，当精液分析中圆细胞浓度超过 1 × 106 个/mL 时，应进一步区分白细胞与生殖道脱落细胞12。一些男科实验室采用流式细胞术13 或白细胞抗原（如 CD45）免疫细胞化学染色14 来检测白细胞。尽管这些方法较为精确，但成本高且耗时，难以在临床上大规模推广，尤其是在发展中国家。
过氧化物酶广泛分布于多种类型的细胞中，在抵抗氧化应激损伤中发挥关键作用。髓过氧化物酶（MPO）是过氧化物酶亚家族的成员，通常在免疫细胞中表达，其中在中性粒细胞的嗜天青颗粒中表达水平最高15,16，也在淋巴细胞17,18、单核细胞和巨噬细胞19中表达。通过检测精液中过氧化物酶阳性的圆形细胞，可获得白细胞（尤其是中性粒细胞）的浓度7,20。为了使精液中白细胞的检测过程更经济、便捷和高效，我们对检测方法进行了改进。借助计算机辅助精液分析（CASA）系统，可在60分钟内获得白细胞浓度。该新方法降低了患者的检测成本和等待结果的时间，减轻了实验室技术人员的工作负担，并缩短了医生诊断和治疗的等待周期。

<table><tbody><tr><td>148 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA) 溶液</td><td>深圳华康生物医学工程有限公司</td><td>20230301</td><td>试剂 B</td></tr><tr><td>6% (v/v) 过氧化氢溶液</td><td>深圳华康生物医学工程有限公司</td><td>20230301</td><td>试剂 D</td></tr><tr><td>自动精子分析仪 &amp;ndash; SCA SCOPE&amp;nbsp;</td><td>Microptic S.L.</td><td>1222996；型号：SCA-SCOPE-H</td><td>计算机辅助精液分析 (CASA) 设备</td></tr><tr><td>一次性离心管 (1.5 mL)</td><td>浙江拱东医疗器械有限公司</td><td>2210009</td><td>染色过程用离心管</td></tr><tr><td>一次性移液管 (3 mL)</td><td>江苏康健医疗用品有限公司</td><td>20221101</td><td>聚合物材质移液管</td></tr><tr><td>电子计数器</td><td>无</td><td>无</td><td>多通道计数器</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海良平仪器仪表有限公司</td><td>D9008084</td><td>最大称量 = 100 g，e = 10 d，d = 0.01 g</td></tr><tr><td>Makler 计数板</td><td>Makler</td><td>MQ30004</td><td>0.01 平方毫米，深度 10 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>3G41067201307</td><td>CX31，10&amp;times;40</td></tr><tr><td>邻甲苯胺底物溶液</td><td>深圳华康生物医学工程有限公司</td><td>20230301</td><td>试剂 C</td></tr><tr><td>移液器吸头 (1 mL)</td><td>康宁生命科学（吴江）有限公司</td><td>02923205</td><td>每单位 1000 个吸头，每箱 5 单位</td></tr><tr><td>移液器吸头 (10 &amp;micro;L)</td><td>康宁生命科学（吴江）有限公司</td><td>00323961</td><td>每单位 1000 个吸头，每箱 20 单位</td></tr><tr><td>移液器吸头 (200 &amp;micro;L)</td><td>康宁生命科学（吴江）有限公司</td><td>32822810</td><td>每单位 1000 个吸头，每箱 20 单位</td></tr><tr><td>饱和氯化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl) 溶液</td><td>深圳华康生物医学工程有限公司</td><td>20230301</td><td>试剂 A</td></tr><tr><td>SCA 计数板</td><td>Microptic S.L.</td><td>102230608</td><td>厚度 10 &amp;micro;m，双腔</td></tr><tr><td>精液样本容器</td><td>江苏康健医疗用品有限公司</td><td>20230701</td><td>用于精液样本的聚合物材质容器</td></tr><tr><td>恒温台</td><td>深圳市妙泉仪器有限公司</td><td>MQ30004</td><td>MQ-300</td></tr><tr><td>移液管 (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendoff</td><td>3121000.015</td><td></td></tr><tr><td>移液管 (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendoff</td><td>3121000.12</td><td></td></tr><tr><td>移液管 (200 &amp;micro;L)</td><td>Eppendoff</td><td>3121000.082</td><td></td></tr><tr><td>二维摇床</td><td>DragonLab</td><td>822000010000</td><td>VC5A002205</td></tr></tbody></table>

精液中过氧化物酶阳性白细胞的检测

The Examination of Peroxidase-Positive Leukocytes in Semen

白细胞精子症可导致精子运动能力下降、精子形态异常率升高、精子DNA碎片化指数增加、精子顶体功能受损，甚至影响胚胎发育。该病症在临床实践中是一种常见的男性生殖系统疾病，也是男性不育的重要病因之一。在判断是否存在男性生殖道炎症时，男科医生常选择检测精液中的圆细胞或精浆弹性蛋白酶作为临床诊断依据。然而，圆细胞检测易受到脱落的生精细胞及生殖道上皮细胞的干扰，无法有效减少抗生素的滥用和不必要的使用。同时，弹性蛋白酶的检测过程相对复杂、耗时较长、报告结果较慢，不利于男性生殖道感染（MGTIs）等疾病的早期诊断与治疗。我们创新性地将计算机辅助精液分析（CASA）系统辅助检测精液中过氧化物酶阳性白细胞的方法应用于白细胞精子症的诊断标准，成功解决了上述问题。该检测仅需将由四种试剂组成的操作液加入标本中，在室温下总反应时间可控制在20至30分钟内。随后进行涂片和显微镜检查，可在总计60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，用于判断是否存在男性生殖道炎症。

实施上述操作后，离心管中的反应物通常呈现半透明、乳光状外观（图1）。若观察到明显的棕色，则提示白细胞可能发生脱颗粒，可能导致液体着色。因此，染色过程可能失败，需重新染色或采集新的精液样本重新检测21。
过氧化物酶阳性的白细胞呈棕色，与未染色的普通圆形细胞形成对比（图2，普通载玻片）。随后，在转换至一个全新的视野进行连续观察和计数之前，需对当前显微镜视野下的每个精子和棕色白细胞进行计数。为确保最佳准确性，必须计数至少200个精子以及相应视野中存在的白细胞。
<img alt="戴手套的手持 PCR 管；分子生物学中 DNA 扩增实验的装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66211/66211fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：反应液。 完成反应过程的反应物为一种半透明乳光液体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66211/66211fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="精子分析，邻甲苯胺染色，显微镜图像，突出显示过氧化物酶活性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66211/66211fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：光学显微镜下观察（普通载玻片）。 (A) 过氧化物酶阳性的白细胞和(B) 在10 × 40倍放大光学显微镜下观察到的普通圆形细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66211/66211fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种经济高效的检测精液中过氧化物酶阳性白细胞的实验方案。借助计算机辅助精液分析（CASA）系统，可在总计60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，有效提高了男科实验室及男科医生的工作效率。

白细胞精症可导致精子运动能力下降、精子形态异常率升高、精子DNA碎片率增加……

男性生殖医学是我的主要研究方向，本方案主要解决了精液中过氧化物酶阳性白细胞分析的速度和成本问题。精液本身具有高度异质性，这会显著影响精液分析结果的稳定性。因此，在检测前必须确保精液完全液化并充分混匀。本方案结合手动与自动方法，利用精子浓度计算白细胞浓度，与传统的白细胞分级计数法相比，节省时间且更具成本效益。首先，准备配制工作液所需的试剂，并将其置于室温下。同时，准备一个不透光的瓶子用于储存工作液，避免光照。然后使用200微升移液器将100微升氯化铵溶液转移至不透光试剂瓶中。同时将100微升EDTA钠溶液转移至该试剂瓶中，并通过移液操作混匀。接着，加入900微升邻甲苯胺底物溶液至不透光试剂瓶中，并轻轻吹打混匀。然后将5 µL过氧化氢溶液转移至试剂瓶中。使用1000 µL移液器，通过反复吹打轻轻混匀溶液。为制备精液样本，打开恒温台并加热至37 °C。同时，将聚合物材质的容器放在电子天平上归零去皮。收到精液样本后，称量样本重量，并在容器外壁记录详细信息，如识别编号、采集时间、禁欲时长。随后，将精液样本置于恒温架上，使其液化。将精液样本吸入基于聚合物的移液管中，并在30分钟内每5分钟检查一次液化情况，直至精液样本完全液化。首先，使采集的人类精液样本液化，并使用巴斯德移液管充分混匀。然后将100 µL精液样本转移至离心管中。向该离心管中加入 900 微升染色液。通过反复移液混合，充分均质化反应物。将离心管置于二维摇床，在室温下以 200 转/分钟持续振荡 30 分钟。在等待静置反应的同时，使用CASA系统进行精子浓度分析。开启系统后，双击SCA显微镜图标以打开应用程序软件。然后通过移液充分混匀精液样本，并将最多10微升样本转移至SCA计数池中。等待60秒，直至精液样本停止流动。接着，将SCA计数板放置于CASA系统的样本架上。在应用程序软件中，于对话框内输入患者信息。点击开始按钮，记录精液中精子的浓度。30分钟染色反应完成后，停止摇床。分析前，用移液器吹打混匀离心管中的内容物。将最多10微升反应物转移至精子计数室，并用专用的玻璃盖玻片覆盖。将精子计数室放置在显微镜载物台上，打开光学显微镜。然后等待60秒，使反应物样本停止漂移。在10倍物镜下，调节粗调和微调旋钮以选择视野。然后切换至40倍物镜，观察精子和过氧化物酶阳性的白细胞。使用电子计数系统计数至少200个精子以及呈棕色的过氧化物酶阳性白细胞的数量。利用该技术，精液样本中的过氧化物酶阳性白细胞被染色。过氧化物酶阳性白细胞呈棕色，与未染色的普通圆形细胞形成对比。

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