Name: 监测胞浆内单精子注射后小鼠后代的血糖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 了解胞浆内单精子注射技术对小鼠后代血糖代谢的长期影响。本研究建立ICSI-ET小鼠模型，监测年龄相关的葡萄糖代谢变化，为评估辅助生殖技术的安全性提供重要基础。

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本工作由上海张江国家自主创新示范区专项发展资金重大项目计划（ZJ2022-ZD-006）、上海市科学技术委员会定向资助项目（22DX1900400）、上海市卫生健康委员会青年项目（20204Y0276）以及国家自然科学基金（32070849）资助。

下述ICSI-ET方案遵循上海计划生育科学研究所动物伦理审查委员会的指导原则，并已获得批准。安全操作规程：在处理化学品或生物材料时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用通风橱：所有涉及挥发性化学品或气溶胶产生的操作均须在经认证的通风橱或生物安全柜内进行。超数排卵实验使用6至8周龄的B6D2F1品系雌性小鼠。
1. 小鼠的卵胞浆内单精子注射（ICSI）
<ol>
	<li>小鼠超数排卵
	<ol>
		<li>在第一天约20:00，按每只小鼠7.5 IU的剂量，进行孕马血清促性腺激素（PMSG）腹腔注射。</li>
		<li>在第三天约20:00（PMSG注射后48小时），按每只小鼠7.5 IU的剂量，进行人绒毛膜促性腺激素（HCG）腹腔注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在雌鼠注射HCG的同一天，将HTF培养基分装为每份1 mL，敞口置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜平衡。</li>
	<li>ICSI受精液滴的制备
	<ol>
		<li>在雌鼠注射HCG的同一天，将一个50 × 9 mm细胞培养皿盖分为上下两部分。上半部分用10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制备4–6个、每个5 µL的液滴，用于放置精子；下半部分用M2培养基制备8–10个、每个5 µL的液滴，用于ICSI操作。</li>
		<li>用约3 mL矿物油覆盖PVP和M2培养基液滴（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养皿的制备
	<ol>
		<li>在雌鼠注射HCG的同一天，将KSOM培养基（MR-020P-D）均匀分装12滴，每滴20 µL，置于35 × 10 mm细胞培养皿中，并用约3 mL矿物油覆盖液滴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>精子采集：
	<ol>
		<li>在第四天约上午9:00（HCG注射后13小时），通过颈椎脱臼法处死雄性小鼠。</li>
		<li>分离附睾尾部，并用无菌纱布轻轻擦拭，去除脂肪组织和血液残留，再用预热的HTF培养基冲洗干净。</li>
		<li>剪开附睾尾部，使精子自由游出至HTF培养基中。用镊子轻轻挤压附睾尾部以释放精子，收集至预先平衡的HTF试管中，敞口置于37 °C、5% CO2培养箱中进行精子获能，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵母细胞采集
	<ol>
		<li>在第四天约上午9:30，对用于卵母细胞采集的雌鼠实施颈椎脱臼法处死。沿腹部皮肤和肌肉层中线小心切开，暴露腹腔。</li>
		<li>用精细镊子轻轻分离两侧输卵管组织，特别是膨大的壶腹部，将其转移至无菌培养皿中的M2培养基内。重复此操作，直至收集完所有指定小鼠的输卵管。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用1 mL注射器针头轻轻穿刺输卵管膨大壶腹部的透明区域，促使卵丘-卵母细胞复合体（COCs）释放至培养基中。</li>
		<li>使用同一注射器小心吸取并转移COCs至含有100 µL新鲜M2培养基的新培养皿中。重复此步骤，直至所有COCs均从原始输卵管段中成功转移。</li>
		<li>擦除血液和组织液，在解剖显微镜下使用25 G针头撕开输卵管壶腹部，使大量COCs释放出来。</li>
		<li>移除输卵管及组织碎片，将COCs转移至含透明质酸酶（HY）的M2培养基液滴中，并预热至37 °C。</li>
		<li>孵育约5分钟后，进行轻柔吹打，以促进卵丘细胞与卵母细胞的分离。将处于第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞从含HY的溶液转移至新鲜M2培养基中，随后依次转移至多个M2培养基液滴中。</li>
		<li>经过2–3轮洗涤后，将卵母细胞转移至KSOM培养基液滴中，并置于37 °C、5% CO2培养箱中备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第四天约上午10:00，对100 µL已获能的精子（见步骤1.5.2）进行超声处理5秒，频率为46 kHz，功率设为50瓦，以分离精子头与尾部。 
	注意：超声处理以截断精子尾部时，需严格控制时间，不得超过5秒。超声数秒后可在倒置显微镜下观察精子状态，当约一半精子出现尾部截断时即停止超声。</li>
	<li>ICSI操作
	<ol>
		<li>使用市售的平头显微操作针，内径为6 µm，安装角度为25°，用于注射。将操作液注入针内，使液柱在针内长度达0.5 cm，确保液面高度约为0.5 cm。 
		注意：注射过程中应保持室温在19 °C，避免高温降低受精卵的存活率。精确控制液面高度至0.5 cm，对维持注射过程的完整性及卵母细胞的存活至关重要。</li>
		<li>将注射针安装在显微操作仪的右臂上，并通过拧紧固定帽牢固固定。在显微操作仪左臂安装市售的平头显微操作固定吸管（专用于小鼠卵母细胞），并将注射针与固定吸管置于显微镜视野中。</li>
		<li>用移液器将1 µL超声处理后的精子加入PVP溶液液滴中。</li>
		<li>将20个MII期卵母细胞置于M2培养基液滴中。</li>
		<li>用注射针在PVP溶液中吸取10–20个精子头，然后将注射针移入含有卵母细胞的液滴中。</li>
		<li>在偏振显微镜下直接确定卵母细胞内中期纺锤体的位置，确保纺锤体不在注射侧，极体通常位于卵母细胞方向的12点或6点位置。</li>
		<li>使卵母细胞与培养皿底部接触。调节焦平面，使卵母细胞的透明带与注射针处于同一平面。</li>
		<li>当注射针接触透明带时，对注射针施加轻微负压，吸入部分透明带。</li>
		<li>同时启动压电脉冲，强度设为5，频率为1，有效在透明带上打孔，使注射针得以穿过。</li>
		<li>将注射针推进至卵周隙，将精子头推至针尖端，继续插入卵母细胞，直至抵达透明带对侧。</li>
		<li>使用压电脉冲（强度设为1，频率为1）在质膜上制造微小孔洞，确保将精子头注入卵细胞质中，同时尽量减少PVP进入，并最大程度保持卵母细胞的完整性。</li>
		<li>重复步骤1.8.11，直至完成全部20个卵母细胞的注射，随后在19 °C孵育15分钟。</li>
		<li>将存活的卵母细胞转移至KSOM培养基中并放入培养箱。观察2细胞期、4细胞期、桑葚胚及囊胚的形成率。 
		注意：胞浆内单精子注射（ICSI）的时间应严格控制，目标是在HCG注射后14–18小时内完成操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠囊胚的子宫移植
<ol>
	<li>结扎雄性小鼠的制备 
	注意：本研究使用6-8周龄的ICR雄性小鼠。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射1.25% 2,2,2-三溴乙醇进行麻醉，剂量为每10克体重0.2 mL。无痛反应表明麻醉成功。 
		注意：尽管当前方案未包括对麻醉动物眼部使用兽用眼膏，但建议作为最佳实践以防止眼睛干燥，并确保动物在操作过程中的健康与舒适。在整个手术及恢复过程中，所有手术器械在使用前均已灭菌，手术区域使用消毒液处理，以确保无菌的操作环境。</li>
		<li>为防止潜在的应激或损伤，术后初期应将小鼠单独饲养。</li>
		<li>给予布托啡诺，剂量为每千克体重0.05 mg，以确保充分镇痛。 
		注意：为保障小鼠福利，需在恢复期间密切监测小鼠状态，在其恢复至能够维持胸卧位意识水平前不得无人看护。</li>
		<li>准备位于睾丸上方的下腹部手术区域。去除毛发并用聚维酮碘消毒。使用无菌剪刀沿腹白线做1 cm纵向切口。用无菌无尘纸轻轻清除血液，沿腹白线钝性分离腹肌，进入腹腔。</li>
		<li>使用弯头镊子轻柔夹取并暴露左侧睾丸及其附带脂肪垫。识别输精管，并用尖头镊子小心分离，形成一段约10 mm的可操作段。</li>
		<li>将弯头镊子置于酒精灯外焰中数秒以灭菌。轻柔夹住输精管，使其因灼烧而变扁平且发白。在第一灼烧点远端3-5 mm处创建第二个灼烧点。使用无菌手术剪刀切除两个灼烧点之间的输精管段。</li>
		<li>仔细检查输精管灼烧后的断端，确保残留一段短小、扁平且发白的组织。用弯头镊子将睾丸及其附带脂肪垫轻柔复位至腹腔内。</li>
		<li>在对侧（右侧）重复步骤2.1.6所述操作。</li>
		<li>使用缝线关闭手术切口，通常在肌肉层缝合一针，皮肤缝合三针。确保手术切口对齐，并用聚维酮碘消毒。将动物转移至加热垫上观察，监测10-15分钟直至其恢复意识。恢复后，将动物放回饲养笼中。 
		注意：输精管结扎术后，小鼠需14天恢复期，随后进行为期1周的试交配实验。</li>
		<li>在此期间，持续将结扎雄鼠与雌鼠交配，并观察所有出现交配栓雌鼠的妊娠状态。成功交配的标志是雌性小鼠阴道口出现淡黄色、块状的阴道栓。
		<ol>
			<li>于第一天下午4:00至6:00将小鼠配对，第二天上午7:00至9:00检查阴道栓。将有阴道栓的雌鼠视为0.5天假孕状态，并用于后续胚胎移植实验。无阴道栓的雌鼠返回受体组。 
			注意：这些无阴道栓的雌鼠可继续用于交配以制备假孕雌鼠。必须确保所有带栓雌鼠均未真正怀孕，方可将结扎雄鼠用于正式实验。</li>
			<li>虽然结扎雄鼠可每日交配，但每次交配之间应给予1天休息时间。 
			注意：根据我们的经验，结扎雄鼠可在一年以上维持较高的阴道栓形成率。然而，若结扎雄鼠连续4-6次交配均未能在雌鼠中产生阴道栓，则应将其淘汰出实验。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>假孕雌鼠的制备
	<ol>
		<li>将7-10周龄、体重超过25 g的ICR雌性小鼠与3-6月龄的结扎雄性小鼠以1:1比例交配，以获得假孕雌性小鼠。 
		注意：使用结扎雄鼠刺激雌鼠子宫颈，从而激活黄体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊胚移植用移液管的准备
	<ol>
		<li>从培养箱中取出待移植的胚胎，转移至37 °C的M2培养基液滴中。</li>
		<li>使用移植移液管吸取少量液体，吸入一小段空气，再吸入6-10个胚胎。最后再吸入一小段空气以封闭移液管。 
		注意：移液管中液体长度不应超过0.5 cm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子宫内移植（囊胚）
	<ol>
		<li>称量假孕雌鼠（交配后2.5天），通过腹腔注射1.25% 2,2,2-三溴乙醇进行麻醉，剂量为每10克体重0.2 mL。用镊子轻压耳部确认麻醉深度。</li>
		<li>对小鼠麻醉并以酒精消毒确保无菌后，在腹中线做纵向切口。利用皮下组织较松的特点，根据移植需要将切口偏向左侧或右侧。使用小剪刀在腰椎旁约0.5 cm处钝性分离腹壁肌层，进入腹膜腔。</li>
		<li>使用无创伤镊子小心将卵巢、输卵管和子宫拉出体外。</li>
		<li>用注射针针尖在子宫输卵管连接处下方的子宫壁上做一个微小的、向上倾斜的切口，避开血管。此切口通向子宫腔；将输卵管轻轻插入小孔内2-3 mm。</li>
		<li>在缓慢注射胚胎的同时，仔细观察移液管，小心排出移液管末端的小气泡。当确认培养基中央部分已被推出后，停止操作并轻柔拔出移液管。</li>
		<li>将卵巢、输卵管和子宫复位至腹腔内。分别缝合肌层和皮肤。将小鼠置于加热垫上直至从麻醉中恢复。为保障小鼠福利，需在恢复期间密切监测，在其恢复至能够维持胸卧位意识水平前不得无人看护。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>妊娠观察
	<ol>
		<li>手术后观察小鼠18-21天，记录出生仔鼠数量。如遇难产（分娩困难），应实施剖宫产。新生小鼠可由同龄哺乳母鼠代养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 随机血糖、空腹血糖和葡萄糖耐量试验
<ol>
	<li>在小鼠生长期间监测随机血糖水平
	<ol>
		<li>从小鼠出生开始，每隔4周在上午9点（经过充分的夜间进食和活动后）监测一次随机血糖水平。
		<ol>
			<li>刺破小鼠尾尖以获取尾静脉血。</li>
			<li>由于组织液混入，第一滴血的血糖测量值较高，因此应用干净的吸水纸轻轻擦去第一滴血。</li>
			<li>使用便携式血糖仪测量尾静脉第二滴血（约4 µL）的血糖值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在小鼠发育过程中监测空腹血糖及葡萄糖耐量的变化 
	注意：考虑到首次采血时间点为15分钟，所有小鼠必须在15分钟内完成注射。由于每只小鼠注射耗时20-30秒，为确保在规定时间内完成注射，每次实验使用的小鼠数量不得超过30只。
	<ol>
		<li>在出生后每隔4周对经过过夜禁食的小鼠进行空腹血糖和葡萄糖耐量检测。
		<ol>
			<li>第一天，准备新鲜辐照过的垫料、清洁的笼子、笼盖和水瓶。将小鼠转移至无食物的新笼中，并在笼子上贴上“禁止喂食”标签。</li>
			<li>准备好足量的10%葡萄糖注射液（无菌且无热原）和1 mL注射器。</li>
			<li>确保每组小鼠禁食16小时（从第1天下午5:00至第2天上午9:00），但可自由饮水。使用血糖仪按照步骤3.1.1.1–3.1.1.3所述方法测量空腹血糖水平。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>称量小鼠体重并标记其尾部以便快速识别。根据小鼠体重准备每克注射10 µL葡萄糖的注射器。</li>
		<li>以30秒间隔向小鼠腹腔内注射每克体重10 µL的葡萄糖。 
		注意：此处需特别注意注射技术，以避免注射液体体积不准确。操作要点如下：
		<ol>
			<li>用一只手固定小鼠并控制其尾部，使其头部略低于臀部，从而使腹腔内器官移向头部，留出足够的注射空间。</li>
			<li>将针头置于中线与髋骨之间，以45度角刺穿皮肤，然后在保持针头与皮肤表面平行的情况下，轻柔地将针头进一步推进腹腔约0.5 cm。 
			注意：注射过程中应注意是否有阻力，以判断是否意外刺穿内脏器官。</li>
			<li>将注射器中的液体注入腹腔。</li>
			<li>记录注射开始时间，并使用计时器控制注射速度。对于三只小鼠，将计时器设定为90秒，以避免在操作计时器时浪费时间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在预定时间点（葡萄糖给药前0分钟，以及葡萄糖负荷后15、30、60、90和120分钟）从小鼠尾静脉采集血液测量血糖值。 
		注意：后续每次血糖检测也应控制在每只小鼠20-30秒内完成。</li>
		<li>实验结束后将小鼠放回配有食物和水的原笼中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

ICSI-ET Mouse Model to Study Long-Term Impacts on Glucose Metabolism

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究结合小鼠胞质内单精子注射（ICSI）和胚胎移植（ET）技术，全面模拟人类辅助生殖技术（ART），并考察ICSI联合ET对子代发育的影响。使用正常小鼠精子进行ICSI操作，获得了较高的受精率（86.76%）和2细胞胚胎率（88.48%）。经胚胎移植后，子代小鼠的出生率约为42.50%，表明该技术平台具有良好的稳定性。本研究最值得关注的发现是ICSI子代葡萄糖代谢水平呈现与年龄相关的波动，这可能与ICSI技术的应用有关6。
观察到的葡萄糖代谢水平波动是本研究中的一个显著发现。该发现暗示了ICSI技术对子代健康可能存在的长期影响，特别是在葡萄糖代谢方面。7为阐明这一现象背后的原因，我们对ICSI操作中包含的关键技术步骤进行了全面考察。我们发现，控制微注射温度（19 °C）、超声切割持续时间（不超过5 s）以及转移液体体积（&#60;0.5 cm）对于维持较高的胚胎存活率和着床率至关重要。控制移植移液管的虹吸效应已成为实现精确胚胎移植的关键步骤。在准备移植移液管时，确保管径均匀是减轻虹吸效应并更好控制管内液体流动的核心措施。该方法有助于提高胚胎移植的成功率与准确性。此外，应避免长时间 体外 胚胎培养及移植过程中的密度控制有助于提高胚胎发育潜能。采用优化后的实验方案，我们实现了86.76%的受精率和42.50%的出生率，表明ICSI操作本身并未对胚胎活力造成内在损害。因此，葡萄糖代谢的波动更可能与辅助生殖技术（ART）过程所引发的细微细胞内变化相关，而非明显的胚胎损伤所致。
尽管辅助生殖技术（ART）被普遍认为是安全的，但越来越多的证据表明，即使看似正常的ART子代，也可能由于配子和胚胎发育过程中存在的非自然生殖特征及关键干预时期，而在生命后期表现出多种健康风险5,8,9,10,11,12,13。我们的研究结果为ART潜在的代谢效应提供了新的见解，并强调了进一步研究ART对子代健康长期影响的必要性14。
必须指出，本研究采用了小鼠模型，因此研究结果可能无法直接外推至人类受试者。然而，鉴于小鼠与人类之间存在显著的生物学相似性，这些发现仍具有重要的参考意义15。此外，需要认识到，在临床实践中接受卵胞浆内单精子注射（ICSI）的患者往往存在精子异常。相反，本研究在ICSI操作中使用的是正常小鼠，因此缺乏来自精子异常小鼠的ICSI子代数据。不过，可以合理推测，精子异常会对ICSI技术的长期效应产生更显著的影响。因此，本研究的结果仍具有显著的参考价值。
本研究的另一个局限性在于小鼠模型与人类临床实践中精子制动方法的方法学差异。在ICSI的临床应用中，通常通过显微注射针物理破坏精子尾部来使人类精子失活。然而，在我们的小鼠模型实验中，采用的是超声尾部剪切法来制备精子，这种方法在小鼠胚胎操作中常规使用。我们认识到，该方法可能会无意中引入模型的变异性及潜在偏差，特别是考虑到超声可能对精子完整性和功能造成的损害。这种方法学上的差异可能限制我们研究结果的直接可转化性。在未来的工作中，我们计划探索使用显微注射针破坏小鼠精子尾部的方法。这一调整旨在尽量减少对精子的非预期影响，并更好地模拟人类ICSI操作中的条件与结果。我们致力于持续改进研究方法，以提高研究发现的临床相关性。
基于上述技术平台，在未来的研究中，我们将进一步探讨ICSI技术对子代健康的其他方面的影响，例如心血管健康和免疫系统。此外，开展更长期的随访研究对于全面了解ICSI的长期影响也至关重要。

生育问题已成为医学和社会学关注的主要焦点，尤其是在现代社会，生育率下降以及不孕症的流行程度和严重性日益加剧。辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology, ART）为应对这些挑战提供了多种可能，其中卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）常被用作一种治疗干预手段。
自Palermo于1992年报道通过卵胞质内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）实现首例成功妊娠以来，ICSI已成为辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technologies, ART）中的关键性技术1。然而，考虑到ICSI在临床应用中仅有约30年历史，相较于人类寿命而言时间较短，因此ICSI的长期影响，尤其是对子代发育的影响，尚未得到充分研究和阐明。目前，小鼠因其遗传背景均一且寿命较短，已成为医学研究中广泛使用的替代模型。此外，小鼠模型可在较短时间内重现人类的整个生命周期，其中小鼠的1年大约相当于人类的40年2。
在过去十年中，多项小规模研究报道，通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术受孕的个体在日后生活中可能出现血糖水平异常等代谢综合征的风险增加3,4。尽管现有证据尚不充分，但这一发现已在科学界引发了对ICSI技术长期健康影响的严重关切。这种情况凸显了对辅助生殖技术（ART）及其长期健康后果进行更严格评估的迫切需求。特别是在人类研究存在局限性和伦理考量的背景下，建立能够精确模拟ICSI后人类子代发育过程的动物模型变得愈发重要。在此背景下，小鼠ICSI-ET（卵胞浆内单精子注射-胚胎移植）模型因其能够模拟人类ICSI过程，并便于对子代健康结局进行长期监测，已成为评估ICSI技术对子代潜在健康风险的有效工具5。
本研究旨在通过随机血糖监测、空腹血糖检测和葡萄糖耐量试验评估小鼠的葡萄糖代谢状态，探讨ICSI-ET技术对一种常见代谢表型——子代葡萄糖代谢健康的影响。随机血糖监测用于捕捉正常生理活动过程中葡萄糖代谢的自然波动，而空腹血糖和葡萄糖耐量试验则用于评估潜在的糖尿病前期状态。

<table><tbody><tr><td>1.25% 戊巴比妥钠（2,2,2-三溴乙醇）</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2960</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>细菌培养皿，35 × 10 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌</td><td>BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养皿，50 × 9 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌</td><td>BD</td><td>351006</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>ESCO</td><td>class &lt;img alt=&quot;Equation 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/66212/66212eq01.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt; BSC</td><td>无菌操作、制备培养皿、试剂分装等</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>胚胎培养</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>用于小鼠胚胎移植</td></tr><tr><td>氟化液 Fluorinert Fc-770</td><td>SIGMA</td><td>F3556</td><td>Fluorinert FC-770 是一种热稳定性良好的全氟化液体，具有高介电强度和电阻率，用作操作液</td></tr><tr><td>手持式血糖仪</td><td>Roche</td><td>AccuChek performa</td><td>血糖测量</td></tr><tr><td>HTF</td><td>Merck</td><td>MR-070-D</td><td>EmbryoMax 人输卵管液（HTF）（1x），液体，专为小鼠体外受精设计，以 50 mL 规格提供，已优化并验证适用于胚胎培养</td></tr><tr><td>液压显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram 4r Oil, 5196000030</td><td>用于精子注射</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>TI2-U</td><td>显微操作观察平台</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>（1x），粉末，不含酚红，5 × 10 mL</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 培养基（1x），液体，含酚红</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>NARISHIGE</td><td>NTX-N4</td><td>显微操作臂</td></tr><tr><td>矿物油&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>矿物油适用于作为覆盖层，以控制各种分子生物学应用中的蒸发和交叉污染</td></tr><tr><td>玻璃针切割器</td><td>Nanjing Aibei</td><td>Sutter MF-800</td><td>用于制备显微操作针</td></tr><tr><td>玻璃针拉制仪</td><td>Nanjing Aibei</td><td>Sutter model p-100</td><td>用于制作显微操作针</td></tr><tr><td>Piezo Drill Trip 小鼠 ICSI 装置</td><td>Eppendorf</td><td>5195000.087</td><td>用于 ICSI 注射针的操作</td></tr><tr><td>压电式显微操作仪（膜破裂装置）</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf PiezoXpert</td><td>利用微脉冲击破卵母细胞的透明带和卵质膜</td></tr><tr><td>气动显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram 4r Air, 5196000013</td><td>用于固定卵母细胞</td></tr><tr><td>即用型人绒毛膜促性腺激素（Hcg）</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL</td></tr><tr><td>即用型孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>卵母细胞采集及胚胎发育观察</td></tr></tbody></table>

监测小鼠子代经胞浆内精子注射后的血糖水平

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

人类寿命相对较长，而小鼠模型能够在相对较短的时间内模拟整个人类寿命，小鼠一年寿命大约相当于人类40年。胞浆内单精子注射（ICSI）是临床实践中常用的一种辅助生殖技术。然而，由于该技术大约30年前才出现，其对人类发育的长期影响尚不明确。在本研究中，我们利用小鼠模型建立了ICSI联合胚胎移植（ET）的方法。结果表明，正常小鼠精子在经历 体外 培养后进行ICSI操作，受精率达到89.57%，双细胞率为87.38%。经胚胎移植（ET）后，子代出生率约为42.50%。此外，随着小鼠年龄增长，观察到葡萄糖代谢水平出现波动，这可能与ICSI技术的应用有关。这些结果表明，小鼠ICSI-ET技术为评估精子异常对胚胎发育的影响及其对子代健康的长期效应（特别是葡萄糖代谢方面）提供了一个有价值的平台。本研究为深入探讨ICSI技术对人类发育潜在影响的研究提供了重要启示，强调了进一步研究该技术长期影响的必要性。

在本实验室中，使用附睾尾部精子对小鼠进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）后，受精率达到89.57%，2细胞期胚胎形成率为87.38%。经胚胎移植（ET）后，子代出生率约为42.50%。值得注意的是，所有受精率、2细胞期率及子代出生率均与人类辅助生殖技术（ART）所达到的水平相当，从而实现了在小鼠模型中对人类ART技术各个阶段的全面模拟。更多详细信息见表1和表2。在生长发育过程中，自然出生小鼠与ICSI小鼠之间的随机血糖水平未见显著波动（图2）。然而，雄性ICSI小鼠在整个实验期间空腹血糖水平持续升高（图3），提示其空腹血糖稳态受损。有趣的是，雌性ICSI小鼠与对照组相比未见明显变化。在葡萄糖耐量试验（GTT）中，雄性ICSI小鼠与对照组之间的血糖水平存在显著差异（图4），而雌性小鼠则未观察到此类差异。这些结果表明，通过ICSI技术获得的子代可能出现糖尿病表型，且该表型具有性别相关性。尽管雌性小鼠未表现出糖尿病表型，但雄性和雌性ICSI小鼠均表现出一致的超重表型（图5）。
采用此处所述的胞浆内单精子注射（ICSI）方案，我们在小鼠中实现了较高的受精率和胚胎发育率。在一次代表性实验中，89.57%的卵母细胞在ICSI后完成受精，表现为形成两个原核。ICSI后24小时，87.38%的受精卵发育至2细胞胚胎阶段。将胚胎移植至受体雌鼠后，活产仔鼠的出生率为42.50%（结果为阳性）。利用此处描述的优化胞浆内单精子注射（ICSI）方案，我们高效地从小鼠卵母细胞和精子获得了后代。重要的是，对ICSI来源动物的全面表征显示，其在无明显发育缺陷的情况下存在代谢紊乱。
与自然繁殖的对照组相比，雄性而非雌性ICSI小鼠表现出葡萄糖稳态受损，表现为空腹血糖升高（图3)以及腹腔注射葡萄糖耐量试验中葡萄糖耐受性降低（图4这些改变可能源于ICSI介导的受精过程中重编程的缺陷，或精子操作过程中产生的细微遗传/表观遗传异常。
此外，雄性和雌性ICSI小鼠的体重均较对照组增加（图5），提示其具有肥胖倾向。尽管小鼠ICSI技术可稳定模拟人类ICSI的结果，但所观察到的代谢表型凸显了在解读ICSI动物模型结果时需保持谨慎。必须对生长、健康状况和行为进行综合评估，以确定ICSI小鼠是否适用于后续应用。
综上所述，这些数据说明了小鼠ICSI技术在高效产生后代用于研究方面的实用性，同时也强调了对ICSI来源动物的表型结果进行全面评估的重要性。本示例中观察到的性别特异性代谢异常凸显了在解释ICSI小鼠模型实验结果时需谨慎对待。
<img alt="静力平衡概念、受力平衡图、ΣFx=0、教育用物理示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠胞浆内单精子注射（ICSI）操作用培养皿制备示意图。 细胞培养皿的盖子被分为上半部和下半部。上半部分含有10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液的液滴，用于放置精子。下半部分含有M2培养基液滴，用于进行ICSI操作。所有液滴均覆盖矿物油以防止蒸发。该培养皿设置可实现精子和卵母细胞在PVP与M2液滴之间的顺序转移，从而完成ICSI过程。分隔的区域可防止操作过程中培养基混合。缩写：ICSI = 胞浆内单精子注射；PVP = 聚乙烯吡咯烷酮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="雄性和雌性小鼠的血糖水平图；自然交配组与卵胞浆内单精子注射组比较，统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：自然繁殖对照组（n = 5）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）组（n = 5）小鼠在出生后发育期间每周随机血糖水平。使用血糖仪每周检测一次对照组和ICSI小鼠尾静脉血的空腹血糖水平（过夜禁食后）。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）评估统计学显著性，ns，P &gt; 0.05。缩写：SEM = 标准误；ICSI = 卵胞浆内单精子注射；ns = 无显著性差异；NM = 自然交配。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="雄性和雌性小鼠在16周内自然交配组与ICSI组的空腹血糖图，统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：自然繁殖对照组（雄性n=7，雌性n=7）和ICSI处理小鼠（雄性n=7，雌性n=7）在出生后发育期间每周空腹血糖水平。 经过过夜禁食后，使用血糖仪每周从小鼠尾静脉采集样本测定空腹对照组和ICSI处理组的血糖水平。观察发现，与性别匹配的对照组相比，雄性ICSI处理小鼠从8周龄开始表现出显著升高的空腹血糖水平，而雌性小鼠未见此现象。数据以均值±标准误（SEM）表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）评估统计学显著性，ns表示无显著性差异（P > 0.05），***P < 0.001，****P < 0.0001。缩写：SEM = 标准误；ICSI = 卵胞浆内单精子注射；ns = 无显著性差异；NM = 自然交配。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="雄性与雌性血糖水平图表；自然交配与ICSI处理随时间变化（15-120分钟）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：16周龄自然繁殖对照组（n = 5）与ICSI处理雄性小鼠（n = 5）的腹腔葡萄糖耐量试验。经过一夜禁食后，小鼠接受腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）。随后在注射后0、30、60和120分钟测定血糖水平。与自然繁殖对照组相比，ICSI处理的雄性小鼠在IPGTT期间30、60和120分钟的血糖水平显著升高。数据以均值±标准误（SEM）表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析。ns，P > 0.05；*P < 0.05。缩写：IPGTT = 腹腔葡萄糖耐量试验；SEM = 均值标准误；ICSI = 卵胞浆内单精子注射；ns = 无显著性差异；NM = 自然交配。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="雄性和雌性小鼠在各周龄的体重增长曲线；自然繁殖与卵胞浆内单精子注射方法的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：自然繁殖对照组（n = 5只雄性，n = 5只雌性）与ICSI处理小鼠（n = 5只雄性，n = 5只雌性）从4周龄至20周龄的体重变化。 每周测量结果显示，自8周龄起，经ICSI处理的雄性和雌性小鼠体重均显著高于同性别对照组。数据以均值±标准误（SEM）表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析。***P &lt; 0.001。****P &lt; 0.0001。缩写：SEM = 标准误；ICSI = 卵胞浆内单精子注射；ns = 无显著性差异；NM = 自然交配。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">卵母细胞</td>
			<td style="min-width: 60px;">受精卵</td>
			<td style="min-width: 60px;">受精率 (%)</td>
			<td style="min-width: 60px;">2-细胞</td>
			<td style="min-width: 60px;">2-细胞率 (%)</td>
			<td style="min-width: 60px;">4-8-细胞</td>
			<td style="min-width: 60px;">4-8-细胞率 (%)</td>
			<td style="min-width: 60px;">桑葚胚</td>
			<td style="min-width: 60px;">桑葚胚率</td>
			<td style="min-width: 60px;">囊胚</td>
			<td style="min-width: 60px;">囊胚率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">尾部精子ICSI1</td>
			<td style="min-width: 60px;">90</td>
			<td style="min-width: 60px;">84</td>
			<td style="min-width: 60px;">93.33</td>
			<td style="min-width: 60px;">76</td>
			<td style="min-width: 60px;">90.48</td>
			<td style="min-width: 60px;">72</td>
			<td style="min-width: 60px;">85.71</td>
			<td style="min-width: 60px;">69</td>
			<td style="min-width: 60px;">82.14</td>
			<td style="min-width: 60px;">64</td>
			<td style="min-width: 60px;">76.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">尾部精子ICSI2</td>
			<td style="min-width: 60px;">80</td>
			<td style="min-width: 60px;">72</td>
			<td style="min-width: 60px;">90</td>
			<td style="min-width: 60px;">62</td>
			<td style="min-width: 60px;">86.11</td>
			<td style="min-width: 60px;">59</td>
			<td style="min-width: 60px;">81.94</td>
			<td style="min-width: 60px;">53</td>
			<td style="min-width: 60px;">73.61</td>
			<td style="min-width: 60px;">46</td>
			<td style="min-width: 60px;">63.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">尾部精子ICSI3</td>
			<td style="min-width: 60px;">60</td>
			<td style="min-width: 60px;">50</td>
			<td style="min-width: 60px;">83.33</td>
			<td style="min-width: 60px;">42</td>
			<td style="min-width: 60px;">84</td>
			<td style="min-width: 60px;">37</td>
			<td style="min-width: 60px;">74</td>
			<td style="min-width: 60px;">32</td>
			<td style="min-width: 60px;">64</td>
			<td style="min-width: 60px;">28</td>
			<td style="min-width: 60px;">56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">总计</td>
			<td style="min-width: 60px;">230</td>
			<td style="min-width: 60px;">206</td>
			<td style="min-width: 60px;">89.57</td>
			<td style="min-width: 60px;">180</td>
			<td style="min-width: 60px;">87.38</td>
			<td style="min-width: 60px;">168</td>
			<td style="min-width: 60px;">81.55</td>
			<td style="min-width: 60px;">154</td>
			<td style="min-width: 60px;">74.76</td>
			<td style="min-width: 60px;">138</td>
			<td style="min-width: 60px;">66.99</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：小鼠卵胞浆内单精子注射后的发育结果。 缩写：ICSI = 卵胞浆内单精子注射。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>编号</td>
			<td>移植胚胎数</td>
			<td>出生数（%）</td>
			<td>雄性</td>
			<td>雌性</td>
			<td>出生率（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>8</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>40</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>42.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：小鼠ICSI胚胎子宫移植后的出生结果。 缩写：ICSI = 卵胞浆内单精子注射。

本文介绍了一种建立卵胞浆内单精子注射（ICSI）-胚胎移植（ET）小鼠模型的方案，可用于观察与年龄相关的葡萄糖代谢变化，这些变化可能归因于ICSI技术，从而为该技术对人类发育潜在的长期影响提供见解。

人类寿命相对较长，而小鼠模型可在相对较短的时间内模拟整个人类寿命，小鼠生活一年……

我们正在研究ICSI技术的使用是否可能导致子代代谢紊乱。这项研究至关重要，因为它关系到辅助生殖技术的安全性和发展。我们的研究为未来的工作奠定了坚实基础，使研究人员能够探索精子对胚胎发育以及子代长期健康的影响。我们的团队将重点关注卵胞浆内单精子注射（ICSI）子代的心血管健康和免疫系统结局，旨在全面了解其长期健康状况。首先，将实验用雌性小鼠置于操作平台上，在第一天晚上8:00左右，经腹腔注射7.5国际单位的孕马血清促性腺激素。48小时后，腹腔注射7.5国际单位的人绒毛膜促性腺激素。将细胞培养皿的皿盖分为上、下两部分，在上半部分放置4至6滴聚乙烯吡咯烷酮（PVP），每滴5微升，用于放置精子。在ICSI操作的下半部分加入8到10滴M2培养液，每滴5微升。用约3毫升矿物油覆盖PVP和M2培养液滴。从安乐死的雄性小鼠中分离附睾尾后，用无菌纱布轻轻吸干。切开附睾尾，用镊子轻轻挤压以释放精子。将精子收集到预先平衡的人输卵管液试管中，用预热的人输卵管液培养基冲洗附睾尾。将试管置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，不加盖，进行精子获能。在第四天，注射人绒毛膜促性腺激素后，将已处死的雌性小鼠置于解剖显微镜下。使用25号针头撕开输卵管壶腹部，释放出大量卵丘-卵母细胞复合体。精子获能后，将100微升精子悬液超声处理5秒，以分离精子头部与尾部。用操作液充满显微操作针，确保针内充满液体的部分长度为0.5厘米。将针头安装到显微操作器的右臂上，并通过拧紧固定帽将其固定。然后将平头微操作持卵管安装到显微操作器的左臂上。调整注射针和持卵管的位置，使其位于显微镜的视野范围内。在偏振显微镜下，确定卵母细胞内中期纺锤体的位置，以确保纺锤体结构不在注射侧。当注射针接触透明带时，启动压电脉冲，强度设为五，频率设为一，从而在透明带上形成穿孔，使注射针得以穿过。使用强度为一、频率为一的压电脉冲，在细胞质膜上制造一个小孔，确保将精子头部注入卵母细胞质内。使用无创镊子，小心地将麻醉后的假孕雌性小鼠的卵巢、输卵管和子宫移出体外。用注射器针头的尖端在子宫壁上子宫输卵管交界处下方做一个小的向上倾斜的切口，避开血管。将输卵管轻轻插入小孔内两到三毫米。采用ICSI技术，小鼠的受精率达到89.57%，其中87.38%的受精卵在ICSI后24小时内发育至二细胞胚胎阶段。胚胎移植后，产下活仔的出生率为42.5%。自然出生小鼠与ICSI小鼠之间的随机血糖水平无显著波动。然而，雄性ICSI小鼠的空腹血糖水平持续升高，提示其葡萄糖稳态受损。在葡萄糖耐量试验中，雄性ICSI小鼠与对照组小鼠之间的血糖水平存在显著差异，而在雌性小鼠中未观察到差异。在体重监测中，雄性和雌性ICSI小鼠均表现出超重表型，与对照组相比差异明显。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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母体感染是神经发育障碍的一个风险因素。母体免疫激活（MIA）的小鼠模型有助于阐明感染对大脑发育和功能的影响。本文提供了通用指南和一项实验方案，用于稳定地产生对MIA具有抗性或易感性的子代小鼠。...

使用聚胞苷酸（Poly(I:C)）建立可重复的中期妊娠母体免疫激活模型以研究子代的易感性与韧性

本文介绍了一种提高小鼠脑脊液（CSF）中葡萄糖浓度的详细实验方案。该方法可用于研究高脑脊液葡萄糖水平对小鼠神经退行性病变、认知功能及外周葡萄糖代谢的影响。...

渗透压微型泵植入法用于提高小鼠脑脊液中的葡萄糖浓度

本文介绍了一种在小鼠中进行圆头精子细胞注射（ROSI）的方法，该技术具有潜在的临床应用价值，并可用于研究胚胎发育背后的机制。...

小鼠圆头精子细胞注射

本方案描述了在雌性小鼠妊娠前减少其叶酸或胆碱膳食摄入的方法，旨在研究母体饮食对子代健康结局的影响。...

通过调节母体膳食叶酸或胆碱水平研究其缺乏对子代健康结局的影响

本文提供了一种全面的方案，用于建立母体免疫激活（MIA）小鼠模型，以研究妊娠早期炎症对神经发育的影响，包括确保实验可靠性和可重复性的关键指标。...

建立早孕期母体免疫激活小鼠模型以评估产前炎症对神经发育的影响

了解胞浆内单精子注射技术对小鼠后代血糖代谢的长期影响。本研究建立ICSI-ET小鼠模型，监测年龄相关的葡萄糖代谢变化，为评估辅助生殖技术的安全性提供重要基础。

监测小鼠子代经胞浆内精子注射后的血糖水平

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