Name: 新型碱木质素微/亚微米颗粒的绿色合成、表征、封装和释放潜力的测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 了解利用绿色溶剂合成碱木质素微/亚微米颗粒的方法，并探索其在模拟胃肠道环境中封装和释放生物类黄酮的潜力。该方法简单快速，适用于生物医学和食品技术领域。

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本研究由保加利亚科学基金合同 № KΠ-06 H59/3 及特拉基亚大学科学项目 No. 07/2023 FVM 资助。

1. 木质素微粒的合成
<ol>
	<li>在磁力搅拌器上将 2.5 g 碱木质素溶解于 50 mL 超纯水中，配制 50 mg/mL 的碱木质素水溶液。</li>
	<li>将 1 mL Tween 80 溶解于 100 mL 超纯水中，配制 1% 的 Tween 80 溶液。</li>
	<li>取 6.65 mL 的 67% HNO3（密度 = 1.413 g/mL），用超纯水稀释至终体积为 50 mL，配制 2 M 的 HNO3 溶液。</li>
	<li>将 15 mL 的 1% Tween 80 溶液缓慢加入 50 mL 的 50 mg/mL 碱木质素溶液中。</li>
	<li>在磁力搅拌器上以 500 rpm 的转速搅拌混合物 10 分钟，使表面活性剂充分分散。</li>
	<li>用注射器以约 150 µL/s 的流速将 20 mL 的 2 M HNO3 逐滴加入上述混合物中。</li>
	<li>继续搅拌混合物 30 分钟，直至深棕色溶液转变为浅棕色的微粒悬浮液。</li>
	<li>将悬浮液转移至 1.5–2 mL 的离心管中，在 10 °C 条件下，以 15,000 × g 的离心力进行超速离心 30 分钟。</li>
	<li>收集上清液用于后续分析，并用超纯水洗涤沉淀的微粒。</li>
	<li>重复洗涤与超速离心操作 3 次。</li>
	<li>在进行超声均质前，将盛有微粒的容器浸入冰浴中冷却。</li>
	<li>在超声波均质器上以 93% 的强度对微粒进行 4 分钟的均质处理。</li>
	<li>将微粒在冻干机中于 -64 °C 下进行冷冻干燥，并储存于干燥器中以备后续使用。</li>
</ol>
2. 木质素亚微米颗粒的合成
<ol>
	<li>通过在磁力搅拌器上将125 mg碱木质素溶解于25 mL超纯水中，制备5 mg/mL的碱木质素水溶液。</li>
	<li>缓慢向碱木质素溶液中加入1 mL 96%的乙醇（EtOH）。</li>
	<li>在磁力搅拌器上以500 rpm的速度搅拌混合物3分钟。</li>
	<li>通过将0.5 g柠檬酸溶于超纯水并定容至50 mL，制备50 mL的1%柠檬酸溶液。</li>
	<li>使用注射器以约4 mL/min的流速向混合物中逐滴加入7 mL 1%柠檬酸溶液。</li>
	<li>继续搅拌混合物10分钟，此时棕黄色澄清溶液将转变为浑浊的浅棕色亚微米颗粒悬浮液。</li>
	<li>将悬浮液转移至离心管中，在超速离心机中于10 °C条件下以15,000 × g离心30分钟。</li>
	<li>收集上清液用于进一步分析，并用超纯水冲洗微粒。</li>
	<li>重复冲洗/超速离心步骤3次。</li>
	<li>在进行超声均质前，将盛有微粒的容器浸入冰浴中冷却。</li>
	<li>在超声均质器中以96%的强度进行两次超声处理，每次4分钟。</li>
	<li>第一次处理后冷却容器1分钟。</li>
	<li>在冷冻干燥机中于-64 °C条件下对微粒进行冻干，并将其储存于干燥器中以备后续使用。</li>
</ol>
3. 天然黄酮类化合物包封木质素微/亚微米颗粒的合成
<ol>
	<li>对微粒重复执行步骤 1.1–1.5。</li>
	<li>称取 0.08 g 槲皮素（morin），溶于 1 mL 乙醇（EtOH）中，并将该乙醇溶液加入混合物中。</li>
	<li>将混合物置于磁力搅拌器上，以 500 rpm 转速搅拌 20 分钟。</li>
	<li>用注射器以约 150 µL/s 的流速逐滴向混合物中加入 20 mL 2 N HNO3。</li>
	<li>继续搅拌混合物 60 分钟。</li>
	<li>重复步骤 1.8–1.13。</li>
	<li>对亚微米颗粒重复执行步骤 2.1。</li>
	<li>称取 0.04 g 槲皮素（quercetin），溶于 1 mL 乙醇（EtOH）中，并将该乙醇溶液加入碱木质素水溶液中。</li>
	<li>将混合物置于磁力搅拌器上，以 500 rpm 转速搅拌 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.4–2.13。</li>
</ol>
4. 木质素微/亚微颗粒包封效率的测定
<ol>
	<li>在合成两种类型的黄酮类化合物包埋木质素颗粒的过程中，计算所添加的生物活性物质的含量。
	<ol>
		<li>将步骤1.9和2.8中获得的上清液用96% EtOH稀释后，通过分光光度法测定黄酮类化合物在上清液中的吸光度。</li>
		<li>利用黄酮类化合物的标准曲线，计算未包埋的杨梅素/槲皮素的浓度。</li>
		<li>通过公式（1）计算木质素微粒对天然黄酮类化合物的包封效率（EE, %）： 
		<img alt="包封效率公式；科研、教学工具，EE计算方法" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">     (1) 
		其中 wo 为添加的生物活性物质总量（mg），wf 为未包埋的游离黄酮类化合物量（mg）。</li>
		<li>使用公式（2）计算载药量（DLC, %）——表示单位重量载体系统中颗粒所载药物量的重要参数： 
		<img alt="载药量公式，药物分析中DLC的计算方程。" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">     (2) 
		其中 wp 为冻干后获得的木质素微/亚微米颗粒的总产量（mg）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 木质素微米和亚微米颗粒的表征
<ol>
	<li>颗粒数量、粒径及粒径分布的测定
	<ol>
		<li>使用带有微珠计数功能的自动细胞计数器评估样品的粒径及粒径分布。用移液器吸取1 µL木质素/黄酮类微米/亚微米颗粒在超纯水中的悬浮液，加入计数板检测所需的小孔中。</li>
		<li>等待自动细胞计数器显示屏上显示每1 mL悬浮液中的颗粒数量及其按粒径分布的数据。 
		注意：仪器支持将数据存储至U盘。自动细胞计数器专用软件可用于对保存的数字文件和图像文件进行进一步处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过电位滴定法测定木质素颗粒表面酸性/碱性官能团含量
	<ol>
		<li>称取0.04 g未负载/黄酮类包埋的木质素颗粒。</li>
		<li>转移至锥形瓶中，加入10 mL 0.1 M HCl，并将锥形瓶置于磁力搅拌器上，以250 rpm搅拌。</li>
		<li>用0.1 M NaOH标准滴定液填充50 mL滴定管。</li>
		<li>滴定开始前，使用台式pH计测量锥形瓶中溶液的初始pH值。</li>
		<li>开始滴定，每加入0.5 mL滴定液后，测量一次被测溶液的pH值。</li>
		<li>将实验数据记录于表格中，表格内容包括所用滴定液体积及对应的pH值。</li>
		<li>当继续增加滴定液体积而pH值趋于恒定时，停止滴定。</li>
		<li>将实验数据绘制成零阶、一阶和二阶导数微分滴定曲线。</li>
		<li>确定滴定过程中的等当点及对应的等当体积。</li>
		<li>利用公式（3）和（4）计算未负载及负载黄酮类的木质素颗粒表面酸性Aa和Ab官能团的含量： 
		<img alt="静态平衡公式 Aa=Vequi×NT/m。物理计算用方程符号。" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3"> ，mgeq/g     (3) 
		<img alt="滴定方程，用于化学反应分析中计算A_b的公式。" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 4"> mgeq/g     (4) 
		其中Veqi为等当体积（mL）；NT为滴定液的当量浓度（mgeq/mL）；VT为测定过程中所用滴定液的体积（mL）；m为被测样品的质量（g）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过固体添加法测定木质素基颗粒的零电荷点pH（pHPZC）
	<ol>
		<li>配制60 mL 0.1 M NaCl水溶液。</li>
		<li>在五个带塞锥形瓶中各加入9 mL 0.1 M NaCl溶液，并分别通过加入0.1 M HCl或0.1 M NaOH将pH调节至pHi = 2、4、7、10和12（其中i = 1–5表示相应溶液的编号）。通过加入同浓度的NaCl溶液，将每个锥形瓶中溶液的总体积精确调整至10 mL。</li>
		<li>向每个锥形瓶中加入40 mg干燥的木质素颗粒（未负载、负载黄酮类的微米/亚微米颗粒），并严密封口。</li>
		<li>将锥形瓶垂直固定于轨道摇床上，持续振荡24 h。</li>
		<li>静置平衡30 min后，分别测定各锥形瓶中上清液的最终pH值（pHf）。</li>
		<li>以最终pH值（pHf）为纵坐标，初始pH值（pHi）为横坐标作图。</li>
		<li>零电荷点（pHPZC）定义为ΔpH与pHi关系曲线与坐标为（pHi; pHi）的直线相交时所对应的pH值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>木质素颗粒总酚含量（TPC）的测定 
	注意：微米/亚微米木质素颗粒的总酚含量（TPC）采用改进的福林-酚比色法进行测定。
	<ol>
		<li>将200 µL浓度为500 µg/mL的颗粒水悬浮液与600 µL超纯水及200 µL福林-酚试剂（1:1, v/v）混合。</li>
		<li>5 min后，向混合液中加入1.0 mL 8% Na2CO3和1.0 mL Milli-Q水，在40 °C水浴中避光孵育30 min，期间间歇振荡。</li>
		<li>将悬浮液在5,300 × g条件下离心2 min。</li>
		<li>制备不含颗粒的空白对照样。</li>
		<li>取3.5 mL上清液转移至10 mm石英比色皿中，以空白为参比，在可见光区760 nm波长下用紫外/可见分光光度计测定吸光度。</li>
		<li>按照步骤5.3.1–5.3.5制备标准没食子酸的校准曲线；仅将200 µL木质素颗粒悬浮液替换为初始浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150和200 µg/mL的没食子酸乙醇溶液。</li>
		<li>将微粒的实验数据表示为每克干样品中含有的没食子酸当量毫克数（mg GAE/g）。</li>
		<li>使用公式（5）计算TPC： 
		<img alt="总酚含量公式，TPC = CGA/CS×1000，化学分析方程。" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 5"> mg GAE/g     (5) 
		其中CGA为根据标准没食子酸校准曲线所得的样品浓度（µg GA/mL）；Cs为样品浓度，等于干样品质量除以溶剂体积（µg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 测定 体外 木质素颗粒的释放能力
<ol>
	<li>通过使用 0.1 M HCl 将标准 PBS 溶液的 pH 调节至 pH = 1.2，制备 250 mL 模拟无酶胃液介质。</li>
	<li>分别用 0.1 M NaOH/0.1 M HCl 调节标准 PBS 溶液的 pH 至 6.8 和 7.4，制备各 250 mL 的两种模拟肠液溶液。</li>
	<li>将25 mg黄酮类包埋的微/亚微米颗粒加入至装有机械搅拌器的玻璃间歇反应器中的50 mL模拟无酶胃液介质中，并将反应器置于恒温为T = 37 ± 0.2 ℃的恒温水浴中 oC.</li>
	<li>将搅拌器浸入液面下至液体体积的2/3深度，以确保固相和液相充分混合，并在无死区的情况下实现最大传质。</li>
	<li>每10分钟从反应器中取出1 mL样品，直至90分钟th 立即加入1 mL新鲜模拟体液溶液至反应器中，以防止总体积变化并确保汇条件。</li>
	<li>分别使用 pH = 6.8 和 pH = 7.4 的模拟肠液溶液，重复相同的实验步骤（包括步骤 6.3–6.6），持续 200 分钟。</li>
	<li>在三种模拟介质中使用未负载的木质素颗粒进行类似的实验，并将这些样品作为空白对照用于分光光度计的调零。</li>
	<li>过滤样品后，用96% EtOH稀释，并以第6.7步的空白样品为对照，通过分光光度法测定样品的吸光度；然后分别利用在pH = 1.2、6.8和7.4条件下获得的杨梅素标准曲线，计算相应的黄酮浓度。</li>
	<li>使用公式（计算生物类黄酮的累积释放量（CR）6在 µg/mL 累积释放百分比（CRP）通过公式（7): 
	<img alt="色谱法中化学浓度比的计算公式，CR=Ci+1+(Vs/V)·Ci。" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 6">    (6) 
	其中 Ci 和 Ci+1 i 中的桑色素/槲皮素浓度th 以及 (i+1)th 样本（µg/mL)；Vs 取自批式反应器的样品体积（mL）；V 为模拟培养基的总体积（mL）。 
	<img alt="科学背景下的CRP计算公式；百分比，浓度，方程。" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 7">    (7) 
	其中 C最大值 是载体中生物活性化合物的最大浓度（µg/mL).</li>
</ol>
7. 统计分析
<ol>
	<li>以三次独立测量的均值 ± 标准差（SD）表示实验数据。</li>
	<li>通过执行方差分析（ANOVA）作为事后检验，确定实验结果的统计学显著性。将 p 值小于 0.05 视为具有统计学意义。 &lt; 0.05 具有统计学显著性。</li>
</ol>

Lignin Micro-/Submicron Particle Synthesis for Bioflavonoid Release

<ol><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+nanoparticles+with+high+phenolic+content+as+efficient+antioxidant+and+sun-blocker+for+food+and+cosmetics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chem.+Eng%22%5BJournal%5D)">Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics.</a> ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).</li>
<li>Boarino, A., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+lignin+valorization+in+food+packaging%2C+antimicrobial%2C+and+agricultural+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications.</a> Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).</li>
<li>Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+Acacia+lignin-gelatin+film+for+its+possible+application+in+food+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Bioprocess%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging.</a> Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valorization+of+lignin+into+nanoparticles+and+nanogel%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol.+Reports%22%5BJournal%5D)">Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application.</a> Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041(2022).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

在基于生物聚合物的药物载体配方设计的现代合成方法学中，主要关键问题之一是使用有害的有机试剂——如四氢呋喃、丙酮、甲醇，甚至高浓度的二甲基亚砜（DMSO）等挥发性和易燃性溶剂——由于可能产生毒性效应，限制了其在生物医学、制药工业和食品技术中的应用20,21,22,23,24。另一个关键问题是合成过程中涉及复杂的化学反应（如酯化、聚合）或昂贵的仪器设备。本文所介绍的两种技术通过采用替代性溶剂（水）以及无毒化合物（如表面活性剂Tween 80和交联剂乙醇、柠檬酸），克服了上述局限性，因而被归类为&#34;绿色&#34;合成方法。此外，这些方法满足了迫切需要开发低成本、环境友好且可持续的木质素颗粒制备工艺的需求，为生理活性物质提供了可生物降解、具有生物活性且生物相容性的载体模板25。
为了获得所需尺寸的木质素颗粒，选择了两种制备条件：一种采用高浓度木质素（50 g/L）并以硝酸作为反溶剂；另一种采用较低木质素浓度（5 g/L），以乙醇作为反溶剂，同时柠檬酸兼具反溶剂和交联剂的双重作用，因为这两种变量是影响木质素颗粒尺寸的关键因素。两种制备过程中的流速均保持较低，以获得更小的颗粒并防止其聚集。在选择无机酸和有机酸用于合成方案时，需考虑一些关键因素。
选择硝酸是因为它是一种强无机酸，能够使碱木质素发生高度沉淀，并且通过控制其加入速率，可以获得所需粒径范围内的颗粒。此外，预计加入 HNO3 可能会引起杂聚物颗粒的改性，原因在于木质素结构可能发生以下化学变化：苯环上的氢原子被 -NO2 基团取代的硝化-取代反应；脂肪族 -OH 基团的酯化反应并形成酯官能团；和/或酚羟基及 -OCH3 基团的氧化反应，生成醌类结构。关于沉淀剂和木质素浓度对合成颗粒尺寸的影响，一方面，较高的初始木质素浓度结合强硝酸（pKa = -1.4）的加入，以及碱性杂聚物在无机酸中溶解度有限，导致生成微米级颗粒。另一方面，在较低浓度的碱木质素水溶液中加入乙醇，由于碱木质素在醇中具有部分溶解性，从而引发形成细小悬浮液。此外，随后加入柠檬酸后生成了纳米级颗粒，因为该有机酸的酸性弱于硝酸（pKa1 = 3.13），因而沉淀程度较低。
纳米级药物的一些基本特性包括药物在体内的循环、在特定部位从剂型中释放以及通过生物膜吸收。这些特性在很大程度上受到纳米载体的某些物理和化学特性以及所包封的药物分子的影响。
生物聚合物载体的理化特性，如表面活性酸性基团和碱性基团的浓度、零电荷点（pHPZC）、粒径、粒径分布，以及在负载生物活性物质前后颗粒的光谱特性，是评估颗粒官能团、反应性、稳定性和均一性时必须考虑的关键参数10。
粒径、粒径分布、电荷和形貌是影响这些评价的主要因素之一。粒径会影响纳米颗粒的稳定性、反应活性以及药物释放行为26。较小的颗粒具有更大的传质面积，从而导致更高的药物释放速率；相反，较大颗粒的传质表面积较小，导致药物在颗粒内部的扩散速率较低。
滴定分析方法作为测定固体表面酸性位点、碱性位点及官能团的基本技术，其应用范围正在不断扩大。电位滴定法的主要优点包括节省时间和人力、具有高精度，且无需参比标准物质和昂贵的仪器设备。本研究采用该方法，因其能够通过对负载与未负载生物聚合物载体表面活性位点的性质和数量进行定性与半定量测定，实现对生物聚合物颗粒的表征27。
生物和医学微/纳米载体的表面电荷在细胞摄取过程中起着重要作用28。pHPZC对应于零表面电荷密度，即由质子平衡产生的负电荷与正电荷数量相等的状态。测定这些值可提供有关吸附特异性的信息29。&#160;然而，等电点参数仅代表悬浮颗粒外部表面的电荷，而零电荷点则随颗粒总净表面电荷（包括外部和内部）的变化而变化。因此，在本研究中首次应用pHpzc方法，作为一种简单且有效的生物聚合物药物载体表征手段。根据pHpzc的概念，当pH高于pHpzc时，生物聚合物颗粒表面主要带负电；而当悬浮液的pH低于pHpzc时，则呈现净正电荷。由表1所示的实验数据可知，微米级和亚微米级、未载药及载黄酮类化合物的木质素颗粒均带负电，因其pH &#62; pHpzc。
黄酮类化合物的载药效率受包封率和载药量的影响。包封率（E，%）定义为掺入颗粒中的药物量与配方中药物总量之比。包封率受药物特性、溶剂和载体的影响30。
然而，生理活性物质的有效递送取决于其分子从载体基质中释放的方式和程度。因此，必须充分考虑药物的释放机制及释放速率。31,32,33通过阐明 体外 黄酮类化合物从其生物聚合物微/纳米载体中的释放机制，可模拟并预测黄酮类化合物及其载体在真实生理环境中的行为，进而优化药物制剂设计以提高生物利用度。该实验 体外 本研究获得的结果对临床实践具有重要意义，因其证明了木质素亚微米和微米颗粒在胃环境中对桑色素/槲皮素的释放程度较低，因此相较于直接口服生物活性物质，这种创新的生物聚合物颗粒因引起胃部刺激的风险更低，更适合用于口服给药。此外，由于亚微米颗粒粒径小且具有显著的释放潜力，可进一步开发为注射剂型。同时，新型木质素微米和亚微米载体为克服其他研究者所报道的某些黄酮类化合物高剂量口服给药受限问题提供了可能，这些问题源于此类化合物在肠道中易形成饱和溶液，从而阻碍其溶解过程及有效吸收。
该方法的主要优势在于合成简便、所得颗粒具有良好的生物相容性，以及当前实验方案具备可定制性。颗粒尺寸适宜于其预期应用，提供了足够的表面积用于负载治疗剂和靶向基团，从而无需增加颗粒用量即可达到目标剂量要求。以木质素作为合成新型颗粒的基础杂合聚合物基质，不仅提高了生物相容性，还提供了多种活性功能基团，为颗粒在不同应用中的定制化改造创造了条件。

如今，由于纤维素、壳聚糖、胶原蛋白、葡聚糖、明胶和木质素等生物聚合物在组织工程、3D生物打印以及生物医药、制药和食品技术领域的广泛应用，这些生物聚合物作为可定制尺寸、理化性质和生物功能的微米/亚微米载体设计前体的研究日益受到关注。 体外 疾病建模平台、包装工业、乳液制备、营养递送等1,2,3.
最新研究强调了木质素基水凝胶以及微米和纳米制剂4作为有利载体的应用前景，可用于食品包装材料5、能量储存6、化妆品7、热/光稳定剂、增强材料以及疏水性分子递送的药物载体基质8，在提升紫外线阻隔性能9、作为纳米复合材料中的增强剂，以及因近期一些安全性问题而作为无机纳米颗粒的替代品等方面展现出潜力10,11,12。 这一趋势的背后原因在于这种天然杂合生物聚合物具有良好的生物相容性、可生物降解性和无毒性，同时木质素已被证实具有抗氧化潜能和自由基清除能力、抗增殖作用以及抗菌活性等生物功能13,14,15,16,17。
科学文献报道了多种木质素基微/纳米制剂的合成方法（如自组装、反溶剂沉淀、酸沉淀和溶剂转移法）18及其表征手段，其中包括使用价格昂贵或有害的溶剂，如四氢呋喃（THF）、二甲基亚砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和丙酮，以及需要大量仪器和有毒物质的复杂、间接且繁琐的工艺过程12,19,20。
为克服上述缺点，以下方案提出了一种利用廉价且环境友好的溶剂合成木质素基微米/亚微米颗粒的新方法；该方法操作简便、直接、快速且灵敏，所需设备少，使用无毒物质，并具备简单的表征手段，可用于测定其对难溶于水的生物活性化合物的包封能力。 体外 木质素基质的释放潜力。所介绍的实验室规模制备方法有利于制备具有可调粒径、高包封容量和可持续性的功能化木质素载体 体外 利用简单的表征方法和环保型化学品研究释放行为，可在生物医学科学和食品技术等多个领域中应用。两种黄酮类化合物被用作目标分子，分别包封于木质素颗粒中：柚皮素包封于微米颗粒，槲皮素包封于亚微米颗粒。这两种黄酮类化合物的结构差异仅在于B芳香环上第二个-OH基团的位置不同：柚皮素的-OH基团位于2'位，而槲皮素位于3'位，因此这两种有机化合物为位置异构体。这一特性提示，这两种生物活性天然化合物在包封和/或释放过程中可能表现出相似的行为。

<table><tbody><tr><td>自动细胞计数器</td><td>EVE, NanoEnTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td>&amp;nbsp;ACS 级试剂，&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>数字水浴锅</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5–2 mL 离心管（Eppendorf 管）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>34852-M</td><td>无水乙醇，适用于 HPLC，&amp;ge;99.8%</td></tr><tr><td>福林-酚试剂（Folin&amp;ndash;Ciocalteu&amp;rsquo;s 酚试剂）</td><td>Sigma</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;冷冻干燥机</td><td>Biobase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>没食子酸</td><td>Sigma-</td><td>BCBW7577</td><td>一水合物</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>ACS 级试剂，37%</td></tr><tr><td>HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>438073</td><td>&amp;nbsp;ACS 级试剂，70%</td></tr><tr><td>碱性木质素</td><td>Sigma</td><td>370959</td><td></td></tr><tr><td>桑色素</td><td>Sigma</td><td>PHL82601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>ACS 级试剂，&amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>粉末，&amp;ge;99.5%，ACS 级试剂</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td>试剂级，97%，粉末</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>IKA</td><td>KS 130 basic</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Consort</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>RNBH7571</td><td></td></tr><tr><td>槲皮素水合物</td><td>Sigma</td><td>STBG3815V</td><td></td></tr><tr><td>Excel 统计分析软件</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>XLSTAT&amp;nbsp; 版本 2022.4.5</td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td>BioXtra，黏稠液体</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Hermle</td><td>Z 326 K</td><td></td></tr><tr><td>超纯水系统</td><td>Adrona</td><td>INTEGRITY+</td><td></td></tr><tr><td>超声波均质器</td><td>Bandelin Sonopuls</td><td>HD 2070</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Hach-Lange</td><td>DR 5000</td><td></td></tr></tbody></table>

新型碱木质素微/亚微米颗粒的绿色合成、表征、包封及其释放潜力测定

Green Synthesis, Characterization, Encapsulation, and Measurement of the Release Potential of Novel Alkali Lignin Micro-/Submicron Particles

生物聚合物微/纳米技术在人类医学、兽医学、制药及食品技术领域的应用正迅速扩展，这得益于基于生物聚合物的颗粒作为高效载体系统的巨大潜力。利用木质素作为设计创新性微米/亚微米制剂的基础杂聚物生物基质，可提高制剂的生物相容性，并提供多种活性功能基团，从而为调控制剂的理化性质和生物活性以适应不同应用需求创造了条件。本研究旨在建立一种简便且环境友好的木质素微米及亚微米颗粒合成方法；评估其理化、光谱及结构特性；并考察其对生物活性分子的包封能力及其应用潜力。 体外 在模拟胃肠道介质中生物类黄酮的释放。所提出的方法采用廉价且环保的溶剂，操作简便、直接、快速且灵敏，所需设备少，使用无毒物质，并通过简单的方法进行表征，测定对难溶于水的生物活性化合物杨梅素和槲皮素的包封能力，以及 体外 木质素基质的释放潜力

采用反溶剂沉淀法制备碱木质素微米/亚微米级颗粒。将稀释的无机酸（硝酸）/有机酸（柠檬酸）水溶液分散至含有环保型表面活性剂/乙醇的碱木质素水溶液中，导致生物聚合物溶质逐步沉淀；经超声处理后，最终形成致密的微米/亚微米级颗粒悬浮液（图1）。
<img alt="木质素微粒合成装置、分光光度计、颗粒比较试管、实验室实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：木质素颗粒的均质化。（A）合成的木质素亚微米颗粒的超声波均质化；（B）均质后的负载槲皮素与未负载槲皮素的木质素微粒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
未载药和载有杨梅素的木质素微载体的粒径、数量及粒径分布被测定（图2). 实验数据表明，较高浓度（1 × 107 颗粒/mL（2,037 颗粒/µL，以及更大的平均尺寸， 6.1 µm，载有生物类黄酮的微载体（图2B) 高于未负载的样品，其浓度为 7.4 × 106 颗粒/mL（1,474 颗粒/µL）和平均大小 5.7 µm (图2A）。两种颗粒在3-6 µm 未负载的微载体为75.2%，槲皮素包封的微载体为69.3%，在7-范围内分别为20.2%和25.2%10 µm反溶剂硝酸的用量、浓度和流速对于颗粒的大小至关重要。酸的浓度越高、用量越大，得到的颗粒越大；而流速越高则会引发悬浮液的聚集。
<img alt="使用自动细胞计数器进行细胞计数分析；显示细胞设门的图表和显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：粒径分布。（A）1 µL 悬液中未载药木质素微粒的实际粒径分布——基于粒子计数器软件分析结果；（B）1 µL 悬液中包载黄酮醇（morin）的碱木质素微粒的实际粒径分布——基于粒子计数器软件分析结果。（C）未载药木质素微粒分布的粒子计数器显微照片；（D）包载黄酮醇（morin）的碱木质素微粒分布的粒子计数器显微照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图3 展示了乙醇中黄酮醇（morin）溶液、碱木质素水溶液以及含有不同初始浓度黄酮醇和木质素的混合物的紫外/可见吸收光谱。显然，纯木质素与生物类黄酮的吸收峰并不重叠，且在将黄酮类化合物包封入聚合物微载体后，采用分光光度法测定液相中黄酮醇浓度的过程中，杂聚物不会对测定方法产生任何干扰 体外 释放实验。在二元混合物中，桑色素的最大吸收波长发生红移，从 λ最大值 = 359 nm 至 λ最大 = 395 nm，这是由于碱木质素的存在导致介质pH升高所致。后者在可见光区域吸收最大值的偏移促使必须针对不同pH值的介质设计莫林的校准曲线图 4A). 三条标准曲线均表现出极强的线性相关性，这通过回归系数（R）的高值得以证实2 &gt; 0.99）在杨梅素浓度范围 C 内o = 2.5-100 µg/mL同样，三种模拟生理区室中槲皮素的三条标准曲线，如图所示 图 4B在相同浓度范围内表现出良好的线性关系。
<img alt="显示杨梅素和木质素光谱的光谱吸收图，λmax 峰值位于 359 nm 和 395 nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：杨梅素乙醇溶液、碱木质素水溶液以及含不同初始浓度杨梅素和木质素混合物的紫外/可见吸收光谱比较。 纯木质素和杨梅素的光谱不重合，且杂聚物未产生任何干扰影响。将木质素加入杨梅素后，导致杨梅素最大吸收峰向更长波长方向移动，从 λmax = 359 nm 移至 λmax = 395 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="吸光度与浓度关系图、pH值对光谱分析的影响、数据拟合结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：乙醇中黄酮类化合物溶液的标准曲线。（A）杨梅素和（B）槲皮素在浓度范围 Co = 2.5–100 µg/mL 下，于 pH = 1.2（蓝色，模拟胃液）、pH = 6.8（红色，模拟小肠液）和 pH = 7.4（绿色，模拟结肠液）条件下的标准曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过电位滴定法测定未负载和负载碱木质素颗粒表面酸性和碱性活性位点/官能团的相对浓度。计算基于由二阶导数微分滴定曲线确定的等当量滴定剂体积（图5）。所测定的pKa值、酸性官能团（强酸性、弱酸性、总酸性）浓度以及微米和亚微米颗粒的pH和pHpzc列于表1中。
<img alt="木质素颗粒滴定曲线；ΔpH/ΔV² 与 NaOH 体积的关系；比较亚微米级和微米级颗粒。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：未载药与载药木质素微米/亚微米颗粒的二阶导数微分电位滴定曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>木质素微粒</td>
			<td>包载黄颜素的木质素微粒</td>
			<td>木质素亚微米颗粒</td>
			<td>包载槲皮素的木质素亚微米颗粒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veq., mL</td>
			<td>10.5</td>
			<td>2.75</td>
			<td>2.25 
			4.3</td>
			<td>2.75 
			3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKa</td>
			<td>11.1</td>
			<td>10.8</td>
			<td>3.0 
			8.0</td>
			<td>4.2 
			7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aa (强酸性), mgeq/g</td>
			<td>26.25</td>
			<td>6.88</td>
			<td>16.38</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aa (弱酸性), mgeq/g</td>
			<td>11.25</td>
			<td>13.13</td>
			<td>11.25</td>
			<td>13.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aa (总量), mgeq/g</td>
			<td>37.5</td>
			<td>20</td>
			<td>27.63</td>
			<td>29.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH (水悬浮液)</td>
			<td>4.45</td>
			<td>4.1</td>
			<td>4.54</td>
			<td>4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHpzc</td>
			<td>2.3</td>
			<td>2.0</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：滴定剂等效体积值（Veq)，即酸解离常数（pKa)，酸性（强、弱、总）官能团的浓度（Aa, 毫克/克）、pH值和零电荷点（pHpzc未负载和已负载木质素微米和亚微米颗粒的 未载药及载有黄酮类化合物的微米和亚微米木质素颗粒因处于其pH值条件下而带负电荷 &gt; pHpzc.
采用改进的福林-酚法测定总酚含量（TPC），以没食子酸当量计算，未载药木质素颗粒的总酚含量为78.2 mg GAE/g，而相同浓度下槲皮素包封微载体的TPC值高出2.3倍（183.43 mg GAE/g）。后者表明，由于黄酮类分子的引入，异源生物聚合物颗粒中额外富含酚羟基。黄酮类化合物的包封效率分别为：桑色素98.1%，槲皮素97.6%。药物包封能力分别为：桑色素载药微粒28.2%，槲皮素包封亚微米颗粒39.0%。
的 体外 在模拟的无酶胃肠道介质中研究了桑色素和槲皮素的累积释放：分别在pH = 1.2、6.8和7.4的胃液、小肠液和结肠液中进行图6）。在 pH = 6.8 条件下，经过 30–40 分钟，释放效率最高，约为 24%。根据实验结果，模拟小肠液中黄酮类物质的释放量是模拟结肠环境中释放量的两倍，是胃环境中测定释放效率的三倍。在 pH = 7.4 的 SIF 中，槲皮素释放程度最高，于第 70 分钟达到最大值th- 90th min 时为 34%，超过了在 SGF（pH = 1.2）和 SIF（pH = 6.8）中类黄酮的累积释放率，分别为 23.5% 和 18%。
<img alt="体外累积释放曲线，槲皮素，桑色素，pH 条件：SGF 1.2，SIF 6.8，7.4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：累积数据的比较分析 体外 模拟生理介质中从木质素微米和亚微米颗粒释放桑色素和槲皮素的效率 在模拟小肠液中，桑色素的释放程度最高。在模拟结肠液中，槲皮素的释放效率最高。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们描述了生物相容性木质素微米及亚微米颗粒合成与表征的新型简便方法。这些制剂为这种杂聚物的利用提供了便捷途径，同时也为设计具有生物医学、制药技术和食品工业潜在应用价值的多功能载体基质提供了替代方案。

生物聚合物微/纳米技术在人类医学、兽医学、制药及食品技术领域的应用正迅速扩大，这得益于……

本研究的目的是建立一种简单且环境友好的工艺，用于制备小型木质素颗粒。研究旨在分析这些颗粒的物理、化学和结构特性，并考察其在模拟胃肠道环境中包封和释放生物类黄酮的能力。我们的方法采用廉价且环保的溶剂合成基于木质素的颗粒。该过程简便快速，所需设备少，且使用无毒物质。同时，该方法可简单地对难溶于水的生物活性化合物进行表征、包封率测定以及体外释放潜力分析。这种创新的生物聚合物微粒由于引起胃部刺激的风险较低，适用于口服给药。由于亚微米颗粒粒径小且具有显著的释放潜力，可被用作注射剂型。首先，将125毫克碱木质素加入25毫升超纯水中，并使用磁力搅拌器溶解。随后，将1毫升96%乙醇缓慢加入碱木质素溶液中。将混合物置于磁力搅拌器上，以500转/分钟的速度搅拌3分钟。然后将0.5克柠檬酸溶于超纯水中，定容至50毫升，配制1%柠檬酸溶液。使用注射器向混合物中加入7毫升1%柠檬酸溶液。继续搅拌混合物10分钟，直至澄清的棕色溶液转变为浑浊的浅棕色悬浮液。随后，使用超声波均质器对微粒进行均质处理，共进行两个循环，每个循环持续4分钟，强度为96%。然后将微粒在冷冻干燥机中于-64 °C温度下进行冷冻干燥，并将其储存在干燥器中以供后续使用。为制备天然类黄酮包封的木质素微米或亚微米颗粒，称取0.04 g槲皮素。将产物溶于1毫升乙醇中，并将此乙醇溶液加入碱木质素水溶液中。首先，启动自动细胞计数器，以测定所制备样品的粒径及粒径分布。取1微升超纯水中的颗粒悬液，加入计数板的小孔中。检测悬浮液中每毫升的颗粒数量，以及颗粒的数量和粒径分布。称取0.04克未负载或包封黄酮类化合物的木质素颗粒。将称量好的颗粒转移至锥形瓶中。然后加入10毫升0.1摩尔的盐酸。将烧瓶置于设定为250转/分钟的磁力搅拌器上。接着，用0.1摩尔的氢氧化钠标准溶液填充50毫升滴定管。使用台式pH计，在开始滴定前测量锥形瓶中溶液的初始pH值。现在开始滴定过程，每加入0.5毫升滴定剂后，测量被分析溶液的pH值。将实验数据记录在表格中，注明所加入滴定剂的体积及对应的pH值。当观察到随着滴定剂溶液体积的增加，pH值趋于基本恒定时，停止滴定。以零阶、一阶和二阶导数微分滴定曲线的形式绘制实验数据。配制60毫升0.1摩尔的氯化钠水溶液。取五个带塞锥形瓶，向每个锥形瓶中加入九毫升 0.1 摩尔的氯化钠溶液。分别将 pH 值调节至初始值 2、4、7、10 和 12。然后加入额外的氯化钠溶液，将总体积精确调整至10毫升。现在，向每个烧瓶中加入40毫克干燥的木质素颗粒，并盖紧瓶盖。将烧瓶直立固定在轨道摇床中，振荡24小时。静置烧瓶使其平衡30分钟，然后测定每个烧瓶中上清液的最终pH值。将最终的 pH 值对相应的初始 pH 值作图。首先，在配备机械搅拌器的玻璃间歇反应器中加入 50 毫升模拟的无酶胃液介质，然后向其中加入 25 毫克黄酮类化合物包封的微粒或亚微米颗粒。将反应器置于设定为约 37 摄氏度恒温的水浴中。将搅拌器浸入液面下至液体体积的三分之二深度，以确保固相和液相充分混合。每 10 分钟从反应器中取出 1 毫升样品，直至第 90 分钟，并立即向反应器中加入 1 毫升新鲜的模拟流体溶液，以维持总体积并确保汇相条件。在无酶条件下，研究了桑色素（Morin）和槲皮素（Quercetin）在模拟胃液、小肠液和结肠液中的体外释放情况。小肠介质中黄酮类化合物的释放量是结肠的两倍，是胃部的三倍。槲皮素在pH 7.4的小肠液中释放量最高，于70至90分钟时达到34%，高于其在胃液以及pH 6.8小肠液中的释放量。

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