Name: 实验性自身免疫性脑脊髓炎后小鼠自身反应性抗体的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 了解用于多发性硬化症小鼠模型的经济灵活ELISA方案，定量检测实验性自身免疫性脑脊髓炎后血清中的自身反应性抗体。该方法支持神经炎症与神经退行性病变研究。

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本研究由美国国立卫生研究院（R03NS131908）以及国防部多发性硬化症研究计划（资助号：W81XWH-22-1-0517）提供资助。观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定得到国防部的认可。本研究还得到了东卡罗来纳大学启动资金的支持。

所有涉及小鼠的操作均遵循东卡罗来纳大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的实验指南进行。本研究使用8至10周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠。实验动物购自商业来源（见 材料表）。EAE的诱导参照既往已发表的文献报道进行12,13,14.
1. 血清采集
<ol>
	<li>通过 CO 处死实验小鼠2 在诱导EAE后，在规定时间点（按照机构批准的方案）通过窒息或异氟烷过量处死动物 通过 MOG35-55 免疫 
	注意：小鼠总数及血清采集时间点可根据具体实验而调整。</li>
	<li>在通过脚趾或尾部夹捏确认无生命体征后，将小鼠置于解剖盘上呈仰卧位，并用图钉或胶带固定四肢。调整小鼠身体方向，使其朝向LED光源（参见 材料表用以照射动物的胸部。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠毛发，使用解剖剪从骨盆至剑突沿腹部中线做一3-4 cm的切口，注意避免损伤任何器官和主要血管（图1A- C）。为便于操作，使用镊子夹住剑突上方的皮肤。</li>
	<li>用弹簧剪刀横向剪开膈肌，然后沿两侧肋骨外侧缘向前剪开肋骨，至接近胸骨中线处停止，避免剪到胸骨图1D）。将所形成的肋间皮瓣折叠至小鼠头部上方，以暴露心脏（图1E). 
	注意：应避免切割胸骨，因为这会损伤紧邻骨骼的主要胸动脉，从而减少可采集的血量。</li>
	<li>将连接1 mL注射器的25 G针头插入左心室，通过轻柔回拉活塞收集血液（图1F）。为便于针头穿刺，可轻轻用镊子固定住心脏。 
	注意：如果血液未立即进入注射器，应缓慢旋转针头并尝试不同的角度。然而，应尽量在第一次穿刺时就准确定位针头，以避免在心脏上造成不必要的穿孔，防止血液由此渗漏。</li>
	<li>将血液转移至无菌的1.5 mL离心管中，在室温下静置30分钟使其凝固。在4 °C条件下以2000 × g离心20分钟，去除血凝块。收集上清液（即血清组分），分装成单次使用量于冻存管中，于-80 °C保存，以备后续检测。</li>
</ol>
2. ELISA 检测
<ol>
	<li>将冻干的MOG35-55多肽（参见材料表）用纯水重悬，配制成10 mg/mL的储存液。实验开始前，用包被缓冲液（参见材料表）将储存液稀释至10 μg/mL，并向96孔板中每孔加入100 μL终溶液。用封口膜密封板子以防止蒸发，并在4 °C下孵育过夜。 
	注意：每个样本至少应设置2个复孔，同时应额外设置2个空白对照孔。</li>
	<li>同时，用100 μL/孔、浓度为10 μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶于包被缓冲液中，对相同数量的孔进行包被。这些额外的孔将作为背景对照。 
	注意：建议使用BSA包被对照孔，因为包被缓冲液和封闭缓冲液的组成不同。请注意，其他脑炎致病性多肽（如PLP139-151或MBP84-104）可替代BSA作为无关抗原使用。</li>
	<li>次日，用含0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）以每孔200 μL洗板3次。随后，每孔加入100 μL由PBS（不含Tween 20）配制的3% BSA封闭液，将板子密封后置于杂交炉中，在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>用PBS-T以每孔200 μL洗板3次。将每份血清样本用封闭液按1:100稀释，分别向MOG35-55包被孔和BSA包被孔中每孔加入100 μL。向设定为空白对照的孔中加入等体积的封闭液。将板子密封后在室温下孵育2小时，并持续震荡（250 rpm）。</li>
	<li>用PBS-T以每孔200 μL洗板3次。将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:2000，参见材料表）用含0.2% BSA的PBS-T溶液稀释后，每孔加入100 μL。将板子密封后在室温下孵育1小时，并持续震荡（250 rpm）。</li>
	<li>用PBS-T以每孔200 μL洗板3次。向所有孔中每孔加入100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液（参见材料表），避光孵育1–5分钟，观察蓝色显色情况。
	<ol>
		<li>通过每孔加入100 µL终止液（参见材料表）终止反应，并使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）。 
		&#8203;注意：TMB底物在加入孔板前应于室温平衡30–60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>将从酶标板读取的OD值填入Excel电子表格中。对每个样本的复孔（包括MOG35-55包被孔和BSA包被孔）所获得的OD值取平均值。</li>
	<li>对每个样本，用MOG35-55包被孔的平均OD值减去BSA包被孔的平均OD值。所得背景校正值将与不同血清样本中抗MOG35-55抗体的浓度成正比。 
	注意：空白孔的校正后数值应接近于0。</li>
	<li>采用非参数统计检验方法（如Mann-Whitney U检验）比较两种实验条件之间的平均OD值。每种实验条件应至少包含3个独立样本。</li>
</ol>

Investigating Humoral Response in Autoimmune Demyelination

<ol><li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li>
<li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li>
<li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li>
<li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li>
<li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+sclerosis%3A+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li>
<li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li>
<li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li>
<li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li>
<li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).</li>
<li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文报道了一种简单且高效的基于ELISA的实验方案，用于在多发性硬化症（MS）病理相关的动物模型中准确量化体液免疫反应。该方法最近被用于描述ataxin-1蛋白在MOG35-55/C57BL6J EAE模型中调控血清自身抗体水平的新功能12。为此，为了通过该方法获得一致且具有生物学意义的结果，需考虑多种因素。
首先，必须采集高质量的血清样本并避免溶血。在严重溶血的样本中，红细胞释放的血红蛋白及其他细胞内成分可能干扰ELISA检测中的抗原-抗体反应及相对颜色测定。为防止溶血，在采血过程中应避免使用高负压注射器，因为这可能导致红细胞破裂。
其次，必须稀释血清样本，以获得处于吸光度曲线线性范围内的OD值。我们推荐的稀释倍数（1:100）是根据本实验所用小鼠品系中诱导的EAE病理程度进行校准的。考虑到该模型固有的异质性水平 体内 在使用该模型时，强烈建议进行初步的滴定实验，以确定针对所检测的特定EAE病理的最佳稀释倍数。同样，可根据情况调整TMB底物的孵育时间，以避免显...

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞局灶性浸润脑实质、包裹轴突的髓鞘破坏、胶质细胞活化以及神经元丢失1。除了致病性T细胞的明确作用外，大量证据还表明B细胞参与了针对中枢神经系统的自身免疫反应。B细胞在多发性硬化症患者脑内发生克隆扩增，且已在脱髓鞘病灶中检测到针对髓鞘成分的抗体2,3。近期研究记录了疾病起始阶段外周B细胞的选择性活化，提示该免疫细胞亚群在疾病启动中也可能发挥作用4。B细胞耗竭疗法（如抗CD20单克隆抗体）的临床成功进一步证实了B细胞功能异常与自身免疫性脱髓鞘之间的机制性关联5,6。从分子层面来看，B细胞可通过自身抗原呈递、促炎性细胞因子分泌以及自身反应性抗体的产生等方式促进疾病发展。
已开发出多种动物模型，以重现复杂多发性硬化症（MS）表型的特定特征。其中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是最广泛使用的体内研究范式，该模型依赖于使用源自髓鞘蛋白（如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）和髓鞘碱性蛋白（MBP））的短肽对实验动物进行免疫7。经EAE免疫的动物会产生脱髓鞘病理变化，该变化在多个方面与MS相似，包括对致脑炎肽产生强烈的体液免疫反应8。因此，EAE研究在解析B细胞和自身抗体在疾病背景下的功能方面发挥了关键作用。例如，已有研究表明，从MS患者体内分离出的MOG特异性抗体可在EAE模型中加重临床病程9。值得注意的是，人MOG第42位的脯氨酸残基被证实对决定自身抗体致病性具有关键作用10。最近的研究进一步发现，MOG特异性自身抗体不仅可通过介导髓鞘丢失促进疾病进展，还可通过增强中枢神经系统（CNS）内自身反应性T细胞的再活化而发挥作用11。
考虑到抗体反应在中枢神经系统自身免疫中的重要性，本文介绍了一种基于ELISA的实验方案，用于高效检测经MOG35-55肽免疫的C57BL/6J小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中血清内自身反应性抗体的水平。在该方案的第一部分，介绍了血清采集的方法 通过 将描述心脏内穿刺操作。随后，详细说明建立ELISA检测方法及获取数据的步骤。最后，讨论数据分析与结果解读。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物</td><td>Thermo Fisher</td><td>N301</td><td>在 4 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>粘性封口膜</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>在 4 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>C57BL/6J 雌性小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>用于 EAE 实验的小鼠应为 8–10 周龄</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Fisher</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>解剖托盘</td><td>Fisher</td><td>S111022</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 包被缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>421701</td><td>在 4&amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>Microsoft</td><td></td><td>分析用电子表格</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG，人吸附-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1030-05</td><td>在 4 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>Fisher</td><td>AMPSILED21</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Fisher</td><td>14-377-575&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 MOG35-55 肽</td><td>EZBiolab</td><td>cp7203</td><td>在 -80 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Axygen</td><td>AP-12-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Noyes 弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96 孔板</td><td>BioLegend</td><td>423501</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Fisher</td><td>88-861-023</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>VWR</td><td>445-0024</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>制冷台式离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>终止液</td><td>Thermo Fisher</td><td>N600</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr></tbody></table>

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种在组织病理学和分子水平上模拟自身免疫性疾病多发性硬化症（MS）的疾病模型。EAE通过免疫实验动物诱导产生 通过 皮下注射短髓鞘肽并联合特定佐剂以增强免疫反应。与人类疾病相似，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠会出现脱髓鞘病变、免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）、胶质细胞活化以及神经元损伤。大量证据亦支持B细胞功能障碍在多发性硬化（MS）和EAE发病机制中的重要作用。B细胞可作为抗原呈递细胞，同时也是促炎性细胞因子和自身抗体的主要来源。在EAE模型中，机体可产生针对诱导疾病所用髓鞘肽的抗体。这些自身抗体已被证实可介导髓鞘丢失或致病性T细胞向中枢神经系统的再激活。本文介绍一种基于ELISA的高效方法，用于定量检测经髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55（MOG35-55）肽免疫的C57BL/6J小鼠血清中的自身抗体。该方法可作为研究自身免疫性脱髓鞘背景下异常体液免疫反应特异性与强度的有力工具。

为了验证本ELISA检测方法的稳健性，采用经验证的EAE诱导方案12,13,14，对一组C57BL/6J雌性小鼠在免疫后20天（dpi）采集的血清样本进行了检测，免疫时使用100 μg MOG35-55肽段与完全弗氏佐剂（CFA）联合注射。动物在第0天和第2天还接受了400 ng百日咳毒素。未使用肽段、其余处理相同的模拟免疫动物的血清样本作为阴性对照。所有EAE小鼠在免疫后11–14天出现疾病首发症状，并在20 dpi时达到平均2.6 ± 0.6（标准误差，SE）的临床评分（评分标准为0–6分：0分，无症状；1分，尾张力降低；2分，轻度单侧轻瘫或双侧轻瘫；3分，重度双侧轻瘫；4分，截瘫；5分，四肢轻瘫；6分，濒死或死亡）12。与对照样本相比，EAE样本的吸光度（OD）值显著升高，结果符合预期（图2）。这些数据证实...

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种疾病模型，可在组织病理学层面重现自身免疫性疾病多发性硬化症（MS）的特征……

因此，我们实验室的研究重点是理解多发性硬化症的分子基础。多发性硬化症是一种以脱髓鞘、神经炎症和轴突损伤为特征的中枢神经系统免疫性疾病。本实验方案为商业试剂盒提供了一种经济且灵活的替代方法。我们的X射线系统可轻松调整，用于检测B细胞针对不同EAE肽段的抗体反应。我的实验室致力于深入研究慢性神经系统疾病（如多发性硬化症）中神经炎症与神经退行性变之间的关联。首先，取一只已处死的小鼠，通过脚趾或尾部夹捏确认生命体征消失。用70%乙醇喷洒小鼠毛发。然后将小鼠背侧朝下置于解剖托盘上，用图钉或胶带固定四肢。调整小鼠身体方向，使其朝向LED光源，以确保解剖过程中胸腔得到充分照明。使用解剖剪沿腹部正中线从骨盆至剑突处做一长度为3至4厘米的切口。接下来，使用弹簧剪从侧面剪开膈肌。然后从两侧边缘向前剪开肋骨，至中线胸骨前停止。将剪开的肋骨瓣翻折至小鼠头部上方，以暴露心脏。然后，用镊子轻轻固定心脏，将连接1毫升注射器的25号针头插入左心室。轻轻回抽活塞以采集血液。将采集的血液转移至无菌的1.5毫升离心管中，在室温下静置30分钟使其凝固。为去除已形成的凝块，将试管在4摄氏度下以2,000 G离心20分钟。收集上清液，即血清组分，并小心地将单次使用量分装至冻存管中，于-80摄氏度保存。首先，将冻干的MOG 35-55肽用纯水重悬。实验前，用包被缓冲液将肽段储备液稀释至每毫升含10微克。然后，将100微升终溶液加入96孔板的孔中。同时，用100微升溶解于包被缓冲液中的牛血清白蛋白（BSA）包被相同数量的孔。用封板膜密封培养板以防止蒸发，并在4°C下孵育过夜。次日，使用含0.5%吐温20的200 µL PBS对培养板进行三次洗涤。随后，每孔加入100 µL封闭液，该封闭液由PBS中含3% BSA组成。将密封的酶标板置于杂交炉中，在 37 摄氏度孵育 1 小时。孵育结束后，用 PBST 溶液每孔 200 微升洗涤酶标板 3 次。用封闭液稀释从小鼠免疫后血液中获得的每份血清样品。向 MOG 35-55 和 BSA 包被的孔中每孔加入 100 µL，并向指定的空白孔中加入相同体积的封闭液。将密封的酶标板在室温下持续振荡孵育两小时。孵育结束后，从孵育箱中取出酶标板，用 PBST 每孔 200 微升洗板三次。将 HRP 标记的二抗用含 0.2% BSA 的 PBST 溶液稀释后，每孔加入 100 微升。将密封的酶标板在室温下孵育 1 小时，并保持持续振荡。用 PBST 每孔 200 微升洗涤平板三次。每孔加入 100 微升 3'，5'-四乙基联苯胺底物。避光孵育 1 至 5 分钟，监测蓝色的显色情况。向每个孔中加入100 µL终止液。然后使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度。EAE样本的光密度值显著高于对照样本，表明对MOG肽产生了强烈的免疫球蛋白G反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

实验性自身免疫性脑脊髓炎后小鼠自身反应性抗体的定量

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。...

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。...

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。...

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。...

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

了解用于多发性硬化症小鼠模型的经济灵活ELISA方案，定量检测实验性自身免疫性脑脊髓炎后血清中的自身反应性抗体。该方法支持神经炎症与神经退行性病变研究。

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

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