拟南芥和甘蓝型油菜中的毛状根转化与再生

本研究旨在建立一种高效的芸薹属（Brassica）植物转化方案。通过采用基于食物的转化方法，我们显著提高了甘蓝型油菜（brassica napus）的转化效率，这对我们的研究至关重要。我们还在模式物种拟南芥（Arabidopsis Thaliana）中测试了该方案。目前已针对甘蓝型油菜的春季品种DH 12075优化了该实验流程。

下一步的挑战是优化冬性油菜（Brassica Napus）以及芜菁（brassica napa）和甘蓝（brassica oleracea）的遗传转化与再生方案。毛状根易于繁殖，其快速生长使得在转化后能够迅速分析目的基因。因此，可以选择性地再生出表现出目标性状的特定毛状根系成为可能。

例如，通过CRISPR-Cas9技术引入的基因突变。首先，将甘蓝型油菜DH 12075的种子放入微量离心管中。为去除种子表面油脂，向微量离心管中加入水和0.1%洗涤剂，振荡60秒。

现在，先用清水冲洗种子60秒，随后用70%乙醇冲洗60秒。接着，将种子放入10%次氯酸钠溶液中，振荡处理20分钟。去除次氯酸钠溶液后，用无菌水洗涤种子四次，每次60秒。

将种子放置在含有种子萌发培养基的培养皿中。在将培养皿转移至培养室前，于4°C条件下低温层积处理过夜。五天后，将幼苗转移至含有植物生长培养基的植物培养盒中。

将携带毛根诱导质粒PRIA 4B的无Ti质粒农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）C58C1接种于5毫升LB培养基中。在28°C下培养过夜，直至其在600纳米处的光密度达到0.9至1.0。将菌液接种物转移至注射器中。

使用安装在注射器上的26号针头，在18天龄幼苗的下胚轴上距离培养基约1厘米处穿刺。将约50 µL的接种液注入伤口，并刮擦下胚轴表面的组织。

将植物放回 21 摄氏度的培养室中培养 2 至 4 周。随后，从下胚轴上切下已长出毛状根的愈伤组织。将带有毛状根的愈伤组织置于含有毛状根生长培养基和抗生素的培养皿中，以抑制农杆菌的生长。

用透气胶带密封培养皿，随后在24摄氏度下进行培养。培养完成后，从愈伤组织中分离毛状根，并将单根毛状根转移至毛状根生长培养基中。或者，为获得由野生型地上部分与转基因毛状根组成的复合植株，可去除植株原有的根系，然后将长出毛状根的植株转移至含有植物生长培养基和抗生素的培养盒中，以抑制农杆菌的生长。

在无菌条件下，使用镊子将五到十条甘蓝型油菜毛状根系转移至含有再生培养基的培养皿中。用透气胶带密封培养皿，并在21°C的长日照光周期条件下进行培养。每隔三到四周，将毛状根转移至含有新鲜再生培养基的培养皿中。

大约两周后观察愈伤组织的形成，再经过两周的愈伤组织培养后从愈伤组织上诱导出芽。将芽分离成单株，并转移到含有芽伸长培养基的植物培养盒中。两到三周后，切去芽上残留的愈伤组织，并将伸长后的芽转移到含有根诱导培养基的植物培养盒中。

现在，将生根的植株转移至土壤中，并首先在植物生长室中进行驯化。然后将植株移至温室中使其开花。为了加快T₁代植株的生产，从T₀代再生植株上采集含有成熟绿色种子的角果。

在无菌操作台中操作时，用70%乙醇对角果进行表面消毒。将角果放置在培养皿盖或载玻片上。使用安装在1毫升注射器上的24号针头，沿角果的果瓣边缘切开。

打开子房并将其放置一旁。收集未成熟的种子，并转移至含有种子萌发培养基的培养皿中。密封培养皿，并将其置于培养室中直至种子萌发。

与野生型相比，B. napus 的毛状根再生植株表现出矮化表型，具有密集的根系、皱缩的叶片以及改变的开花时间。首先，将表面灭菌的拟南芥（Arabidopsis thaliana）col-0 种子接种到含有种子萌发培养基的培养皿中。经过两天的低温层积处理后，将培养皿转移至培养室，设置温度为 21 摄氏度，光照周期为长日照，相对湿度为 50%。

将一周大的幼苗转移至含有植物培养基的植物培养盒中。在LB培养基中培养根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），直至其在600纳米处的光密度达到0.9至1.0。使用安装在胰岛素注射器上的针头，向一个月大的拟南芥（Arabidopsis）植株主花序茎基部注射约50微升（µL）的菌液。

用注射器在主茎表面轻轻划伤组织。两到四周后，切下长出的毛状根，并将其接种于添加了抗生素以抑制农杆菌生长的毛状根培养基的培养皿中进行培养。将毛状根置于24°C避光条件下培养。

培养一到两周后，使用毛状根生长培养基对平板上的毛状根进行单株分离，并每四到五周将筛选出的毛状根系转移至新鲜培养基中。将毛状根转移至含有再生培养基的平板中，诱导愈伤组织形成，并在21°C、长日照光周期条件下进行培养。当芽从愈伤组织中萌发后，切下芽并转移至芽伸长培养基中，培养两到三周以促进其生长和伸长。

然后将伸长的芽转移到生根诱导培养基中。最后将生根的植株转移至土壤中进行转基因筛选。在拟南芥（A.thaliana）中，所有测试的毛状根品系均在14天内诱导出黄色的子叶（Cali）。

转移至再生培养基后三周内，首批茎尖原基作为深绿色斑点出现。四周后，90%的品系中茎已覆盖毛状根，部分情况下可见不定根形成。然而，有一个品系即使在三个月后仍未发生再生。

与野生型相比，A.thaliana 的毛状根再生植株表现出矮小表型，具有致密的根系、皱缩的叶片以及改变的开花时间。