Name: 一套用于培养环境获得性厌氧微生物的 原位 信息模拟培养基格式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习使用改良匈牙利技术制备厌氧微生物培养基的方法，用于培养环境难养厌氧菌并探索微生物暗物质。本视频演示详细步骤，帮助研究人员快速掌握厌氧培养技术。

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作者谨此感谢多年来影响并推动这些技术发展与演进的知识传承与指导。Hamilton-Brehm 博士作为一名前研究生、博士后及现任教授，衷心感谢那些曾花费时间教授厌氧技术的学者：Mike Adams 博士、Gerti Schut 博士、Jim Elkins 博士、Mircea Podar 博士、Duane Moser 博士以及 Brian Hedlund 博士。本研究工作分别获得了大自然保护协会（The Nature Conservancy）和美国河流组织（American Rivers）通过资助项目 G21-026-CON-P 和 AR-CE21GOS373 的支持。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定代表大自然保护协会或美国河流组织的立场。本研究还得到了南伊利诺伊大学先进能源研究所（SIU Advanced Energy Institute）资助项目的支持，该研究所衷心感谢先进能源资源委员会（Advanced Energy Resource Board）提供的资金支持。NGS 测序由 LC Sciences 完成。

In Situ Simulated Anaerobic Method for Culturing Environmental Microbes

<ol><li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li>
<li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22MSystems%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055(2018).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+biological+%26%2334%3Bdark+matter%26%2334%3B+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Dissecting biological &#34;dark matter&#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li>
<li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the%27omics%27+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+unculturable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li>
<li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands%3A+Knowledge+gained+and+remaining+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184(2011).</li>
<li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%26%2334%3B+uncultivable%26%2334%3B+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolating&#34; uncultivable&#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li>
<li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012(2011).</li>
<li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li>
<li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogens%3A+Reevaluation+of+a+unique+biological+group%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li>
<li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).</li>
<li>Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013).</li>
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 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018).</li>
<li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a%7E+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535(2020).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.%2C+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224(2019).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.%2C+an+anaerobic%2C+extremely+thermophilic%2C+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.%2C+a+hyperthermophilic%2C+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li>
<li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本实验方案的培养基制备部分（第1节）在结构上借鉴了Miller和Wolin改良的Hungate技术17，自发表以来已被广泛使用。该扩展方案的实用性源于其描述性特点以及与之配套的 原位 微生物的获取。已使用含有环境信息指导配制的模拟培养基的培养瓶，成功培养出以下微生物 原位-获得的前任成员 &#34;微生物暗物质&#34;：厌氧地下细菌 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 菌株 DRI1318, Caldiatribacterium inferamans 菌株SIUC1（登录号MT023787；论文在准备中），以及 Anaerothermus hephaesti 菌株SIUC3（登录号MK618647；论文在准备中），以及未表征的地下厌氧细菌菌株DRI14（登录号KR708540）。
本方案的一个重点在于其高度可适应于各种地表和地下厌氧环境及微生物。首先，建议调整培养基...

大多数微生物尚未被培养成功，这一点可通过显微镜下观察到的细胞数量与使用琼脂平板成功培养的微生物数量之间存在的巨大差异得到证实。斯塔利（Staley）和科诺普卡（Konopka）将这一差异称为“&#34;大平板计数异常&#34;1”。宏基因组学和宏转录组学数据显示，在来自多种不同环境的等级丰度曲线中存在大量新颖的属，进一步支持了尚未被计入的微生物多样性。2 那些已被观测到（通常通过对微生物群落进行随机鸟枪法测序）但尚未被培养的微生物，被称为“&#34;微生物暗物质&#34;3,4”。
在组学时代，培养微生物对于全面评估基因组数据以及验证所含基因的功能/表型仍然至关重要。在宏基因组鸟枪法测序和环境样本中宏基因组组装基因组等技术尚未达到足够可靠的准确性之前，对培养获得的微生物进行测序仍是获得完整基因组的唯一可靠途径。5基因组评估与培养的微生物相结合，为理解提供了有力推断 &#34;微生物暗物质&#34; 许多属于该家族的成员 &#34;微生物暗物质&#34; 发挥关键功能，影响营养物质及其他元素的循环以及有价值天然产物的生成，支持生态系统并提供生态服务。从医学角度来看，目前上市药物中约有一半是细菌产生的化合物及其衍生物，而对未培养物种进行特征分析有望揭示未来的抗生素。为了获取这些尚未培养的微生物类群，必须改进多种培养方法6. 在该成员中 &#34;微生物暗物质，&#34; 厌氧寡营养微生物在很大程度上未被充分报道，可能具有生态学和工业上重要的生物化学途径7，使其成为培养的重要目标。然而，厌氧寡营养微生物比需氧和富营养微生物更难培养，通常需要更长的培养时间以及苛刻的培养条件（例如，特殊的非标准条件） 体外 温度）以及专用培养基配方的使用。
目前正在发展的培养拟杆菌门成员的技术 &#34;微生物暗物质，&#34; 包括新型厌氧寡营养微生物在内的研究极大地增进了我们对这些微生物的理解，并提高了它们在系统发育树中的代表性。目前利用理性设计培养基培养新型微生物的技术（即基于目标微生物相关知识设计的培养基）可分为三种 distinct 方法。第一种方法涉及直接从环境中移除一个独立的区段并转移至培养体系中 体外 已包含目标微生物的膜内生长室。离散区域（例如海水）的作用是为目标微生物提供其所需的地球化学生境 原位，而&#160;膜可阻止细胞的穿膜移动（目标细胞将保留在膜内，随组织片段带入的无关细胞则被阻隔在膜外）。通过添加目标微生物在自然生境中可获取的化合物，可实现对这类微生物的培养。8第二种方法利用宏转录组学或宏基因组学来阐明代谢潜能，为优化培养条件以设计靶向培养基提供线索。该方法可提供生态生理学特征，用于针对性地富集特定类型的微生物。培养基的成分根据已鉴定出的、被认为可支持靶向微生物生长的基因进行定制，从而降低富集过程中的多样性。9,10一个需要注意的问题是，基因组信息无法直接推断基因的表达情况，而转录组信息则可以。
第三种方法包括基于环境信息设计的模拟培养基，这与第一种方法不同，第一种方法不进行培养基的模拟，而是直接将环境本身作为培养基来源。第三种方法需要对含有目标微生物的野外地点的地球化学环境进行前期勘察。基于这些信息，确定主要成分和物理参数，以构建基于环境信息的模拟培养基。随后，将含有微生物的环境沉积物或液体直接注入该培养基中。当培养微生物的研究人员无法获得足量的原始环境样本（如第一种方法所需）或缺乏适当的宏转录组学或基因组学数据（如第二种方法所需）时，该方法尤为有价值。
以下方案是第三种方法的示例；该方法基于特定环境并旨在模拟感兴趣的环境条件。本方案中并列展示了三种针对从野外获得的不同厌氧微生物培养物的无菌培养基配方。所代表的三种培养物分别为来源于土壤的混合培养物（下文简称土壤混合培养物）、来源于钻孔内部的混合培养物（下文简称钻孔混合培养物），以及来源于钻孔内部的一种分离产甲烷菌（下文简称钻孔分离产甲烷菌）。此处提供的培养基配方中的化合物种类及用量仅作为初步参考指南；读者可根据自身研究的环境和目标微生物对其进行调整和优化。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;通用材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L 硼硅酸盐玻璃瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 带滑动接头的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 玻璃移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mm 手动压接钳</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 硼硅酸盐玻璃瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝制密封盖</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管，31.5 cm 长度</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管，6 cm 长度</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>取芯器</td><td>Giddings Machine Company&amp;nbsp;</td><td></td><td>由公司部件组装而成</td></tr><tr><td>气体歧管</td><td>Swagelok</td><td></td><td>由多个不同部件组装而成</td></tr><tr><td>打火机</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡胶塞（用于 GL45 瓶）</td><td>Glasgeratebau OCHS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡胶塞（用于培养瓶）</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌加热板</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>维生素</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生物反应器专用材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 橡胶塞</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#7 橡胶塞</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 带鲁尔锁接头的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; 软管接头球阀</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 带鲁尔锁接头的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 L 硼硅酸盐玻璃瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/16&quot; - 1/4&quot; 软管接头转换接头</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mL 带鲁尔锁接头的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 L 硼硅酸盐玻璃大瓶</td><td>Allen Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 开口顶盖用弯头软管连接器</td><td>Ace Glass</td><td>7623-20</td><td></td></tr><tr><td>气球</td><td>Party City</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃生物反应器</td><td>Allen Scientific Glass</td><td></td><td>按需定制</td></tr><tr><td>电钻</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁母接头耦合器</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 开口顶盖</td><td>Ace Glass</td><td>7621-04</td><td></td></tr><tr><td>GL18 开口顶盖</td><td>Ace Glass</td><td>7621-08</td><td></td></tr><tr><td>GL45 开口顶盖</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 开口顶盖用聚四氟乙烯包覆硅胶隔垫</td><td>Ace Glass</td><td>7625-06</td><td></td></tr><tr><td>GL18 开口顶盖用聚四氟乙烯包覆硅胶隔垫</td><td>Ace Glass</td><td>7625-07</td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铁架台链条夹</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铁架台夹</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶管；内径 1/4&quot;，外径 1/2&quot;</td><td>Grainger</td><td>55YG13</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管；内径 3/16&quot;，外径 3/8&quot;</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 开口顶盖用直型软管连接器</td><td>Ace Glass</td><td>7623-22</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二通旋塞阀</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超低流量可调微型泵</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白色橡胶隔垫（适用于外径 13–18 mm 的管）</td><td>Ace Glass</td><td>9096-49</td><td></td></tr><tr><td>金属丝</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扎带</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一套 原位 用于培养环境来源厌氧微生物的知情模拟培养基格式

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

厌氧微生物的依赖培养研究依赖于方法学上的专业能力。这些方法必须为厌氧微生物创造并维持适宜的生长条件（如pH值和碳源），同时允许在不破坏人工环境的前提下提取样品。为此，需采用基于并模拟自然环境的 原位 环境对于培养来自该环境的微生物具有重要帮助。在此，我们概述了一种 原位 一种改进的模拟厌氧方法，用于培养陆地表层及地下微生物，强调以最小扰动方式进行厌氧样品采集。本方案详细介绍了可定制厌氧液体培养基的制备方法以及环境条件的控制&#160;获取与 体外 厌氧微生物的生长。该方案还涵盖了用于模拟沉积物环境和获取环境来源的厌氧液体培养物的厌氧生物反应器的关键组成部分。我们提供了在生物反应器运行周期内维持的微生物组的初步高通量测序数据，其中活性培养物会动态调整以响应实验性碳源。

本文展示了利用钻孔混合培养基制备方法和所述生物反应器装置进行生物反应器研究的结果。钻孔混合培养基经改良后，以经氧化水热溶解（Oxidative Hydrothermal Dissolution, OHD）处理的玉米芯浆液作为碳源13,14。改良后的钻孔混合培养基以0.4 mL/min的流速持续泵入生物反应器，共运行44天。在第23天，接种物来自美国内华达州死亡谷地区的钻孔BLM-115。分别在第1、8、15、22、23（接种后）、30、37和44天从生物反应器中采集液体样品，收集至取样收集瓶中。
为了监测接种物培养物的总体状态（以及生物反应器沉积物中经高压灭菌后仍存活的微生物），通过直接细胞计数法观察生物反应器液体样品。样品液体的直接细胞计数使用Petroff-Hauser血细胞计数板完成。为了确定生物反应器中微生物成员的种类，从生物反应器液体样品中提取DNA，并通过高通量测序（NGS）分析16S rRNA基因。NGS...

本文的重点是详细介绍从环境中获得的难养厌氧微生物培养基制备的最佳实践。这些方法有助于厌氧菌培养的管理，并可用于支持难以培养的未培养微生物——即“微生物暗物质”的生长。

厌氧微生物的依赖培养研究依赖于方法学上的专业能力。这些方法必须能够创造并维持适宜的生长……

我们的研究聚焦于陆地表层和地下微生物，通过培养这些微生物并研究其基因组和表型特征。特别关注那些尚未被充分了解的微生物及其环境，例如深层地下环境和某些湿地中的微生物。我们培养的大多数微生物属于厌氧型，这意味着培养过程通常比常见的需氧微生物需要更长的时间和更细致的操作。我们希望厌氧培养基制备的视听演示能够帮助刚接触该技术的研究人员相对快速、轻松地学习这一方法。该培养基的制备基于经改良的匈牙利Miller和Roland技术。培养营养要求苛刻的微生物既繁琐又困难，因此科学界非常欢迎拥有更多可用于培养这些微生物的工具。未来的总体研究将类似于我们目前对未充分研究的陆地微生物的研究。仍有许多新的微生物有待发现和研究。首先，测量并将所需培养基组分加入一个一升的瓶子中。根据目标微生物培养物调整pH值，并通过轻轻旋转瓶身使各组分混合均匀。将液体在微波炉中加热至沸腾，持续5到6分钟，期间需频繁打开微波炉，并使用耐热手套轻轻旋转瓶身。随后，将一支无菌的10毫升玻璃移液管连接至已准备好的氮气气体歧管装置上。打开歧管以排出氧气，并使氮气流出。将移液管尖端插入液体中，调节气体流速，使气泡产生适度剧烈。用氮气吹扫液体，直至瓶体不再过热而无法触碰。在等待瓶子冷却的同时，准备好10个无菌的100毫升培养瓶。当培养基瓶冷却至可耐受的温度时，将移液器吸头提起至瓶内液面上方空间。加入0.125克碳酸氢钠和0.3克九水合硫化钠，等待刃天青变为无色。等待刃天青变色期间，将金属套管连接至气体分配装置。调节氮气流速至中等流速，并将套管尖端插入培养瓶中。待刃天青变为无色后，将50毫升液体分装至各培养瓶中。拔除套管后，立即用大小匹配的橡胶塞将每个瓶子封口，然后用铝制密封圈固定橡胶塞。将瓶子放入可高压灭菌的容器中，并向容器内加入自来水，直至容器内的水位与瓶内水位持平。在 121 摄氏度下对瓶子进行高压灭菌 30 分钟。准备大瓶装置时，打开直径为 6.4 厘米的软管接头球阀。将两段硅胶管分别连接到该软管接头球阀的两端。将一个 7.9 至 6.4 毫米的软管接头适配器安装到组件的一端。将组件的另一端连接至一个 8 升大口瓶的软管接头上。使用扎带固定大口瓶软管接头与管路之间的连接，以及软管接头适配器与管路之间的连接。量取并加入所需培养基成分至八升试剂瓶中。调节至所需pH值后，在加热板上搅拌使成分混合均匀，并使液体煮沸30分钟。随后，将一支无菌的10毫升玻璃移液管连接至氮气供气装置系统。打开多通阀以排出氧气，并使氮气流出。关闭加热后，将移液管尖端插入液体中，通入氮气冲洗30分钟，气流适中且充分，但不溢出。随后，将移液管尖端上移至容器顶部的气相空间中。加入两克碳酸氢钠和4.8克九水合硫化钠，等待刃天青变为无色。当刃天青变为无色后，移除玻璃移液管，并立即用一个10号塞子封闭烧瓶。将金属丝缠绕在塞子上，并围绕烧瓶颈部边缘缠紧，

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

一套用于培养环境获得性厌氧微生物的 原位 信息模拟培养基格式

来源：Ahmadi, S.，等。一种用于评估干预方案对人类粪便微生物群影响的体外批次培养模型。J. Vis. Exp.

体外 批式培养模型模拟人肠道菌群的结肠发酵

Clostridium difficile 是一种专性厌氧的致病菌，可引起抗生素相关性腹泻（AAD）。本文介绍了分离、培养和保藏 C. difficile 营养细胞及芽孢的方法。这些技术需要使用厌氧室，且需定期维护，以确保为 C. difficile...

在厌氧环境中培养与维持 Clostridium difficile

本方案描述了一种体外批次培养发酵系统，用于研究人类粪便微生物群。通过使用菊粉（一种广为人知的益生元，也是研究最广泛的微生物群调节剂之一），展示该系统在评估特定干预措施对粪便微生物群组成及代谢活性影响中的应用。...

一种体外批次培养模型用于评估干预方案对人类粪便菌群的影响

由于专性厌氧生物在接触氧气时无法生长，因此必须采用厌氧培养技术。本文展示了一种简单有效的方法，用于培养来自沼气厂的混合菌群，内容涵盖从培养基制备到气体和挥发性脂肪酸定量的全过程。...

严格厌氧/无氧条件下微生物培养的培养基制备

本方案总结了在洁净室环境中最大限度降低微生物负荷的最佳实践，包括环境监测、工艺监测和产品无菌检测等策略。该方案适用于需要符合现行良好组织操作规范和现行药品生产质量管理规范标准的生产和检测机构。...

洁净室环境与细胞治疗中的微生物控制与监测策略

该方案介绍了两种改进厌氧肠道细菌分离的方法。第一种方法侧重于利用不同的培养基分离多种多样的细菌。第二种方法则专注于特定微生物类群的培养步骤，该类群可能具有代谢肌醇的能力。-肌醇，以全面理解其生态学意义。...

提高从鸡胃肠道培养厌氧细菌的策略

本方案描述了一种分离芯片（iChip）的设计与使用方法，用于 原位 在其自然环境中培养顽固性土壤微生物。同时还描述了 原位 抗微生物物质产生菌的土壤细菌培养。该方案可经调整用于从不同生态位中分离具有其他理想特性的细菌。...

原位 分离与培养难培养土壤细菌的分离芯片（iChip）方法

本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。...

复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

捕捞活动对已开发的甲壳类渔业（如美洲龙虾渔业）造成的改变，可能会影​​响其繁殖动态，导致雌性龙虾交配成功率下降。本研究旨在建立一种非侵入性方法，用于确定在生理或功能上已成熟的雌性龙虾的交配成功率。...

一种非侵入性方法 原位 雌性美洲龙虾交配成功率的测定Homarus americanus)

本研究采用一种新型上流式厌氧固态（UASS）反应器，利用纤维类原料进行沼气生产。将UASS反应器的消化残余物在加压间歇式反应器中进行水热碳化，制备成HTC生物炭。通过将这两种生物能源技术进行耦合，旨在提高整体生物能源产量。...

评估厌氧消化与水热碳化耦合工艺在生物能源生产中的应用

学习使用改良匈牙利技术制备厌氧微生物培养基的方法，用于培养环境难养厌氧菌并探索微生物暗物质。本视频演示详细步骤，帮助研究人员快速掌握厌氧培养技术。

一套原位用于培养环境来源厌氧微生物的知情模拟培养基格式

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一套 原位 用于培养环境来源厌氧微生物的知情模拟培养基格式

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