Name: 用于模拟肝脏器官发生、构建组合体和使用人类细胞系设计合成组织的体外培养技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解利用干细胞分化与微型化技术构建肝脏类器官的方法，研究肝脏器官发生过程中的形态发生与细胞迁移机制，为再生医学和组织工程提供重要的实验平台与理论依据。

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作者谨向Ogechi Ogoke和Osama Yousef致以诚挚的谢意，感谢他们为本文所用数据做出的宝贵贡献。NP获得了纽约州立大学布法罗分校化学与生物工程系（UB CBE）启动资金、Mark Diamond奖学金、纽约州干细胞科学项目（C024316）、布法罗大学再生医学干细胞研究中心（ScIRM）以及纽约州立大学布法罗分校细胞、基因与组织工程中心（CGTE）的资助。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。本文所用缩写定义见补充文件1。
1. 1%低电渗（EEO）琼脂糖溶液的制备
<ol>
	<li>称取2.5 g低EEO琼脂糖粉末，转移至烧杯中。 
	注意：烧杯的容积应至少为所需体积的两倍，以容纳溶液制备过程中产生的气泡。</li>
	<li>使用量筒量取250 mL蒸馏水，倒入烧杯中，最终浓度（w/v）为1%。</li>
	<li>用塑料封口膜覆盖烧杯口，并留出一个小孔用于通气。将烧杯放入微波炉中加热30秒。</li>
	<li>小心取出烧杯并轻轻旋转混匀内容物。每隔30秒重复此操作，直至琼脂糖完全溶解。 
	警告：操作经微波加热的玻璃器皿时应格外小心，需佩戴合适的手套。密切监控溶液状态，防止过热或沸腾溢出。</li>
	<li>当获得均一溶液后，将烧杯从微波炉中取出。在转移至预先灭菌的容器前，轻轻旋转混匀溶液。将溶液进行高压灭菌，并将琼脂糖溶液于室温（RT）保存，待用。</li>
</ol>
2. 包被96孔板
注意：384孔超低吸附球状微孔板可用于本实验及其他后续实验。
<ol>
	<li>松开装有无菌1%琼脂糖溶液的瓶子的瓶盖。将溶液放入微波炉中，每次加热30秒，直至完全转变为液态，然后拧紧瓶盖。 
	注意：使用合适的防护手套小心操作经微波加热的玻璃器皿。密切监控溶液，防止过热或沸腾溢出。 
	备注：以上步骤应在无菌的组织培养超净工作台内进行。</li>
	<li>每孔加入55–65 µL的1%琼脂糖溶液，以包被96孔组织培养板，并立即轻轻旋转平板。</li>
	<li>当1%琼脂糖溶液转移至所需数量的孔后，将平板置于4 °C冰箱中静置20–30分钟，使琼脂糖充分凝固。使用前将平板恢复至室温（图1A）。</li>
</ol>
3. HEP 类球体的制备
<ol>
	<li>使用完全培养基（cDMEM）在T-75培养瓶中培养HepG2-WT细胞，cDMEM成分为添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen-Strep）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。将细胞培养物维持在37 °C、5% CO2条件下，每天更换一次培养基。</li>
	<li>当细胞达到80%融合度时，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞并弃去冲洗液。向培养瓶中加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育5–10分钟。</li>
	<li>加入等体积的cDMEM终止消化，并将细胞从培养瓶表面冲洗下来。待细胞完全脱落之后，将细胞悬液转移至15 mL无菌锥形离心管中，在室温下以300 x g离心5分钟。 
	注：本实验方案中所有离心步骤均在室温（RT）下进行，但也可选择在低温条件下完成。</li>
	<li>用新鲜cDMEM重悬细胞沉淀，计数细胞以确定最终浓度（单位：个细胞/mL）（图1B）。</li>
	<li>细胞染料标记 
	注：此步骤为可选步骤。
	<ol>
		<li>将所需量的细胞悬液转移至15 mL无菌锥形离心管中，在300 x g条件下离心5分钟。</li>
		<li>用无血清培养基重悬细胞沉淀，使细胞终浓度为1.0 × 106 个细胞/mL。每毫升细胞悬液中加入5 µL荧光细胞标记溶液，在37 °C、5% CO2条件下旋转孵育20分钟。 
		注：无血清培养基为仅添加1%青霉素-链霉素的DMEM。根据细胞悬液密度调整孵育时间以确保染色均匀。</li>
		<li>孵育结束后，在450 x g条件下离心5分钟，弃上清后用新鲜cDMEM重悬细胞沉淀。重复洗涤两次（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>球状体形成
	<ol>
		<li>根据细胞计数结果，用新鲜cDMEM重悬细胞，使终浓度为5.0 × 104 个细胞/mL。充分混匀细胞悬液后，每孔加入100 µL至琼脂糖包被的96孔板中。 
		注：该细胞悬液密度可确保琼脂糖包被的96孔板每孔含有5,000个细胞。若使用384孔板，则细胞悬液终浓度应为2.0 × 105 个细胞/mL，每孔加入50 µL，使每孔细胞数达到10,000个。</li>
		<li>将培养板在340 x g条件下离心10分钟，随后置于37 °C、5% CO2环境中孵育5–9天（图1D）。 
		注：接种后每隔一天更换一次培养基，轻柔吸出50%的cDMEM并补充新鲜培养基。所形成的肝类器官（HEP spheroids）适用于HEP-MES类器官组装模型或M-CM模型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. MES 类球体的制备
<ol>
	<li>在含有DMEM、10% 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素的完全DMEM培养基中，于T-175培养瓶中培养HFF/MRC-5细胞。将细胞培养物维持在37 °C、5% CO₂条件下。2每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，用1×PBS洗涤细胞一次，弃去洗涤液。向培养瓶中加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 5-10 分钟。</li>
	<li>加入等量的cDMEM，冲洗细胞使其脱离培养瓶。待细胞完全脱落后，将细胞悬液转移至15 mL无菌锥形离心管中，在 300 x g 5 分钟。</li>
	<li>将细胞悬液重悬于新鲜的cDMEM中，并计数细胞以确定最终浓度（单位：个细胞/mL）。图1B).</li>
	<li>细胞染料标记 
	注意：此为可选步骤。
	<ol>
		<li>将所需量的细胞悬液转移至15 mL无菌锥形离心管中，在300 ×g条件下离心细胞悬液 x g 5 分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于无血清培养基中，调整细胞密度至最终浓度为 1.0 x 106 细胞/mL。每毫升细胞悬液中加入5 µL荧光细胞标记溶液，将细胞悬液在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 旋转20分钟。 
		注意：无血清培养基为DMEM，仅添加1%青霉素-链霉素。根据细胞悬液密度调整孵育时间，以获得均匀染色。</li>
		<li>孵育完成后，将细胞悬液在450 × g下离心 x g 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜的 cDMEM 中。重复此洗涤过程两次（共三次）图1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体形成
	<ol>
		<li>将细胞重悬于新鲜的cDMEM中，调整至终浓度为1.0 × 105 根据细胞计数调整至相应细胞浓度（cells/mL）。充分混匀细胞悬液，每孔加入100 µL至琼脂糖包被的96孔板中。 
		注意：细胞悬液密度应调整为在琼脂糖包被的96孔板中每孔接种10,000个细胞。</li>
		<li>将培养板在340 × g条件下离心 x g 孵育10分钟，然后在37 °C、5% CO₂条件下继续培养2 5-9 天（图1D). 
		注意：铺板后每隔一天更换一次培养基，轻柔吸去50%的cDMEM并补充等量新鲜培养基。MES类球体适用于HEP-MES类组装体模型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 肝细胞-间充质细胞类器官组装体的形成
注意：参见步骤3和步骤4，了解HEP（图2A）和MES类球体（图2B）的形成过程。
<ol>
	<li>使用移液器从96孔板中单独收集HFF/MRC-5类球体，转移至含有新鲜cDMEM的15 mL无菌锥形离心管中。让类球体在管中静置5分钟，然后用预温的cDMEM轻轻冲洗。 
	注意：冲洗过程应轻柔操作，小心处理。</li>
	<li>使用移液器将单个HFF/MRC-5类球体轻柔转移至含有HepG2-WT类球体的孔中。加入冰冻的生长因子减少型（GFR）Matrigel（MG）或大鼠尾胶原（CG），按1:1和1:5比例稀释，随后在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时（图2C）。 
	注意：MG需在2 °C至8 °C冰箱中冰上过夜解冻。操作MG时务必使用预冷的移液器、枪头和离心管，因其在高于10 °C时会形成凝胶。</li>
	<li>孵育后，向每孔加入75 µL新鲜cDMEM，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育2-3天。 
	注意：接种后每隔一天更换培养基，轻柔移除50%的cDMEM并补充新鲜培养基。即使不更换培养基，类组装体仍可在3-4天内形成。HEP-MES类组装体的形成也可在无基质条件下进行。</li>
</ol>
6. HEP 类球体液滴的形成
注意：HEP 类球体的形成步骤参见第3步（图3A）。可使用两种不同的材料将 HEP 类球体悬浮于液滴中。以下提供两种方法。
<ol>
	<li>GFR MG 液滴
	<ol>
		<li>使用移液器从 96 孔板中单独收集 HepG2-WT 类球体，并将其置于冰上的 15 mL 无菌锥形离心管中静置沉降。</li>
		<li>在另一个 15 mL 无菌锥形离心管中，将 1 mL 冰冷的 GFR MG 与冰冷的对照培养基按 1:1 比例稀释混合。用移液器吸出含有 HepG2-WT 类球体的 15 mL 管中的培养基，并将其置于冰上。 
		注意：MG 需在 2 °C 至 8 °C 冰箱中冰上过夜解冻。操作 MG 时应确保使用预冷的移液器、枪头和离心管，因为 MG 在高于 10 °C 时会形成凝胶。</li>
		<li>将 MG 溶液加入 HepG2-WT 类球体中，确保类球体在 MG 溶液中均匀分布。</li>
		<li>使用 200 µL 移液器吸取含单个类球体的 15 µL MG 溶液，缓慢接种至 60 mm 培养皿中（图 3B）。 
		注意：若每个液滴中接种了多个类球体，应移除并重新正确接种。必要时可调整类球体位置，确保其位于液滴中心。为实现最佳接种效果，建议采用反向移液法以减少气泡形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠尾部 CG 液滴 
	注意：所有 CG 溶液的配制均需在冰上进行。
	<ol>
		<li>使用移液器从 96 孔板中单独收集 HepG2-WT 类球体，并将其置于冰上的 15 mL 无菌锥形离心管中静置沉降（图 3B）。</li>
		<li>在微量离心管中加入 358.8 µL 去离子水、100 µL 10x PBS、12.1 µL 1 N NaOH 和 529.1 µL 大鼠尾部 CG 原液，总体积为 1 mL。 
		注意：大鼠尾部 CG 原液必须始终最后加入。</li>
		<li>将 CG 溶液加入 HepG2-WT 类球体中，确保类球体在 CG 溶液中均匀分布。</li>
		<li>使用 200 µL 移液器吸取含单个类球体的 15 µL CG 溶液，缓慢接种至 60 mm 培养皿中。 
		注意：若每个液滴中接种了多个类球体，应移除并重新正确接种。调整类球体位置以确保其位于液滴中心。为实现最佳接种效果，建议采用反向移液法以减少气泡形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加入培养基前，将液滴于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 60 分钟。</li>
	<li>缓慢向培养皿中加入 5 mL 所需培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育，每三天更换一次培养基（图 3C）。 
	注意：在 HEP 液滴形成实验中使用了 M-CM。</li>
</ol>
7. M-CM 的制备
<ol>
	<li>收集 HFF/MRC-5 细胞，并以 5,000 个细胞/cm2 的接种密度将其接种至 T-75 组织培养处理过的培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下用 15 mL 完全 DMEM 培养基培养 72 小时。 
	注意：在此期间应监测培养瓶，以确保细胞处于最佳健康状态。</li>
	<li>72 小时培养后，将 M-CM 收集至 15 mL 无菌圆底离心管中。在 290 x g 条件下离心 5 分钟以去除碎片，并使用 0.2 µm 滤膜过滤以实现灭菌（图 4A）。</li>
	<li>用完全生长培养基按 1:1 至 1:7 的稀释比例稀释 M-CM，并加入到目标实验中（图 4B）。 
	注意：在 HEP 液滴形成实验中使用 M-CM。</li>
</ol>
8. 肝细胞-间充质细胞混合类球体的形成
注意：请参考步骤 3.1-3.5 制备 HepG2-WT 细胞悬液，以及步骤 4.1-4.5 制备 HFF/MRC-5 细胞悬液。
<ol>
	<li>将 HepG2-WT 细胞重悬于新鲜的 cDMEM 中，使每种细胞悬液的最终浓度为 1.0 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>将 HFF/MRC-5 细胞重悬于新鲜的 cDMEM 中，使每种细胞悬液的最终浓度为 1.0 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>按 1:1 的比例将 HepG2-WT 和 HFF/MRC-5 细胞悬液转移至 15 mL 无菌圆锥形离心管中，以获得最终浓度为 2.0 × 105 个细胞/mL 的混合细胞悬液。充分混匀后，每孔加入 100 µL 细胞悬液至涂有琼脂糖的 96 孔板中。 
	注意：设定细胞悬液密度，以使琼脂糖包被的 96 孔板中每孔含有 20,000 个细胞。</li>
	<li>将培养板在 340 ×g 条件下离心 10 分钟，并在 37 °C、5% CO2 环境中孵育 1–2 天（图 5C）。</li>
	<li>添加纤维蛋白水凝胶 
	注意：此为可选步骤，在接种 HEP-MES 混合类球体 72 小时后进行。
	<ol>
		<li>在 15 mL 无菌圆锥形离心管中，按 4:1 的比例混合纤维蛋白原（3.25 mg/mL）和凝血酶（12.5 单位/mL），以形成纤维蛋白，并将试管置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将纤维蛋白与孔中现有的混合类球体以 1:1 的比例用当前孔中的 cDMEM 进行稀释后，加入各孔。将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>孵育后，向每孔加入 75 µL 新鲜 cDMEM，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 1–2 天。 
	注意：接种后每隔一天更换一次培养基，轻柔地移除 50% 的 cDMEM 并补充等量新鲜培养基。</li>
</ol>
9. 高密度MES迁移模型
注意：HepG2-WT 类球体的制备步骤参见步骤 3（图 6A），HFF/MRC-5 细胞悬液的制备步骤参见 4.1–4.5（图 6B）。
<ol>
	<li>将 HFF/MRC-5 细胞悬浮于新鲜的 cDMEM 中，调整终浓度为 6.0 × 105 个细胞/mL，并置于冰上。</li>
	<li>按 1:1 比例混合 HFF/MRC-5 细胞悬液与冰冻的 MG/CG（图 6C）。 
	注意：设置细胞悬液密度，以确保在琼脂糖包被的 96 孔板中每孔含有 30,000 个细胞。将 MG 在 2 °C 至 8 °C 冰箱中过夜冰上解冻。操作 MG 时应使用预冷的移液器、枪头和离心管，因其在高于 10 °C 时会形成凝胶。</li>
	<li>用移液器将 100 µL HFF/MRC-5 与 MG 的混合液转移至含有 HepG2-WT 类球体的孔中。将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>孵育后，向每孔加入 75 µL 新鲜 cDMEM，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育，最长可达 12 天。</li>
</ol>
10. 统计分析
<ol>
	<li>使用 Microsoft Excel 或任何统计/绘图软件审查和分析收集的数据。 
	注意：对于两组之间的统计学评估，采用 Student t 检验（双尾，类型 II），且将小于或等于 0.05 的 p 值视为具有统计学意义，并在正文及图示/图注中予以标明。</li>
</ol>

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

<ol><li>Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hex+homeobox+gene+controls+the+transition+of+the+endoderm+to+a+pseudostratified%2C+cell+emergent+epithelium+for+liver+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development.</a> Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).</li>
<li>Gualdi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+specification+of+the+gut+endoderm+in+vitro%3A+Cell+signaling+and+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control.</a> Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).</li>
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NP 是 Khufu Therapeutics 的创始人，这是一家类器官工程公司，致力于开发治疗急性和慢性肝病的疗法。

本方案包含多种培养简单和复杂类组装体的方法，以及在早期肝脏器官发生过程中诱导三维集体细胞迁移的技术24,25。所述方案强调了多个关键步骤，其中类球体形成是所有方法中的核心环节。通过使用微孔板（96孔或384孔），结合非黏附性或琼脂糖包被的培养板，实现类球体的形成。该方法可大量生成类球体，以满足后续实验需求，同时考虑到部分类球体可能未达到预期大小或形态不规则的情况。不符合预期标准的类球体将在后续实验中被剔除。类球体形成的初始效率受多种因素影响，包括操作者的经验水平。操作类器官需要较高的技术水平，涵盖类球体（或类器官）的形成、在不同孔之间的转移、向类球体添加生物基质以及在同一孔中放置多个类球体等环节。
类球体的形成需要仔细关注多个因素，包括可重复的细胞计数与接种、琼脂糖包被（或非黏附表面）、定期更换培养基、染料标记方法、轻柔操作类球体和培养板，以及显微镜观察。关于染料标记的具体条件，例如细胞数量与类型以及标记持续时间，应通过实验测试确定。通常，GFR MG 的浓度平均为...

肝细胞迁移在肝脏器官发生、疾病以及细胞治疗中发挥着重要作用。在肝脏器官发生过程中（小鼠胚胎期E8.5-9.0），由于来自周围间充质和心脏的诱导信号，前肠腹侧的前肝上皮开始表达肝脏相关基因。在E9.0时期，前肠上皮细胞由立方状转变为假复层柱状形态，导致上皮增厚，形成肝憩室1,2。在此关键阶段，肝憩室仅由约1,500个细胞组成。随后，覆盖肝憩室的肝内胚层进一步增厚，发生去层化，并形成迁移中的肝母细胞（HBs）条索结构。这些肝母细胞与内皮细胞和间充质细胞共同迁移，向周围的间充质组织分支延伸，启动三维集体细胞迁移，从而形成肝芽3,4。事实上，在此阶段，细胞集体经历以下过程：（1）共迁移，即与其他类型细胞协同移动；（2）分支形态发生，即形成分支状管样结构；（3）间质迁移，即在其他细胞表面或之间迁移。至E11.5时期，迁移停止，原始肝脏已形成，并扩增了103倍3。在肝脏器官发生的后期阶段也可能需要肝细胞迁移，例如大鼠胎儿肝母细胞的基因表达研究表明，与三维集体细胞迁移、形态发生及细胞外基质重塑相关的基因显著上调5。除了在早期肝脏器官发生中的作用外，三维集体迁移还与进展期肝细胞癌（HCC）的局部扩散和转移密切相关，最终导致预后恶化和治疗耐药性增加6。成体和胎儿肝细胞在肝脏再殖过程中从脾脏迁移至肝脏时也采用集体迁移方式。体内成像研究显示，移植的肝细胞在数小时内即进入门静脉，随后进入肝窦状隙，并在肝组织中迁移&#160;7,8,9。最后，最近的研究表明，在小鼠和人类肝脏再生过程中会出现迁移的肝母细胞，部分证据显示其以片层形式移动10。总体而言，具有多种形态发生模式的肝脏集体迁移在器官发生、癌症、肝细胞治疗以及肝脏再生中均发挥着重要作用。
大量遗传学研究已探索了三维肝脏集体细胞迁移背后的分子通路。这些研究表明，肝索结构的缺失会阻碍肝脏的形成，凸显了肝索的形成及其与支持细胞相互作用在肝脏发育过程中的必要性1,11,12,13。这些研究还表明，肝脏的生长由多种因素启动，包括来自心脏中胚层分泌的FGF-2、周围间充质分泌的BMP4、HGF以及内皮细胞的相互作用。此外，与迁移相关的转录因子，如HEX、PROX1和TBX3，也发挥着关键作用2,14。综上所述，遗传学研究提供了证据，表明可溶性因子信号通路可诱导转录因子的表达，进而驱动肝母细胞（HBs）与其周围间充质之间的迁移、信号传导及分子相互作用。
尽管早期肝脏器官发生过程中的细胞迁移已被广泛研究，目前 体外 研究&#160;肝迁移研究常采用二维实验，联合使用高迁移性的肝细胞癌细胞 体内 肿瘤模型15这些研究揭示了影响肝内迁移的多个因素，包括 TGFβ-116，c-Myc17YAP18，goosecoid19，actopaxin20，以及miRNA21,22,23尽管在理解三维肝细胞迁移的分子机制方面已取得显著进展，但二维与三维细胞迁移之间存在的显著差异表明，二维检测方法具有固有的局限性。此外，这些模型通常未包含间充质细胞类型，而间充质细胞对于细胞迁移和生长均至关重要。尽管目前已在整合支持性间充质的肝脏三维迁移模型开发方面取得进展，但这些模型主要关注共迁移现象，而未深入探究多种集体迁移模式。
通过多种自组装和形态发生过程由类球体生成组织的能力，促进了合成组织的科学研究。这些组织在药物开发与筛选、疾病建模、治疗以及其他生物医学和生物技术应用中具有广泛用途。本文提供了多种工程化的三维体外（in vitro）培养系统的方法学细节，这些系统旨在呈现不同模式的肝脏三维集体迁移。这些系统包括：（1）在基质中进行HEP与MES类球体的共培养；（2）将HEP类球体基质液滴与M-CM共同培养；（3）HEP-MES混合类球体；以及（4）将HEP类球体基质与高密度MES细胞共同培养。这些系统能够在三维环境中稳健地模拟肝脏集体迁移，从而增进我们对肝脏器官发生、癌症及治疗相关分子与细胞过程的理解。

<table><tbody><tr><td>384孔黑色/透明圆底超低吸附球体微孔板</td><td>Corning</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板，平底，TC，无菌，1个/袋，100个/箱</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0576</td><td>低EEO</td></tr><tr><td>Axiovision软件</td><td>ZEISS</td><td></td><td>版本4</td></tr><tr><td>细胞培养皿，60 mm，TC，无菌，20个/包，500个/箱</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，175 cm&amp;sup2;，带透气盖，TC，无菌，5个/包，40个/箱</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>709003</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，75 cm&amp;sup2;，带透气盖，TC，无菌，5个/包，100个/箱</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL，聚丙烯材质，无菌，带刻度，50个/袋，500个/箱</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>L226010</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾来源，100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含GlutaMAX补充剂，含丙酮酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EVOS荧光与相差显微镜</td><td>EVOS</td><td>AMEFC4300R</td><td>1,360 × 1,024像素分辨率</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定合格，美国来源</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>人血浆来源纤维蛋白原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4883-500MG</td><td>500 mg</td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>HFF-1</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>IJ1.46r；https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Matrigel生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无LDEV，10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>MSCGMT人源间充质干细胞生长完全培养基套装</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>人血浆来源凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6884-100UN</td><td>100单位</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD细胞标记溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI细胞标记溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO细胞标记溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio荧光显微镜</td><td>ZEISS</td><td></td><td>SE64，1,344 &amp;times; 1,024像素分辨率</td></tr></tbody></table>

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

慢性肝病已达到流行病的程度，全球受影响人数超过8亿。目前的治疗方法——原位肝移植——存在多种局限性。肝脏再生医学领域已涌现出颇具前景的解决方案，其中肝脏器官发生具有重要意义。早期肝脏器官发生在胚胎第8.5至11.5天之间，涉及上皮-间充质相互作用的形成，进而引发形态发生、肝索结构的建立以及细胞集体迁移。然而，目前尚缺乏有效的方法 体外 该过程的建模。本研究提供了一系列详细方法，可利用人类细胞系对肝脏器官发生的不同阶段和方面进行建模。在其中一系列方法中，采用肝样（HEP）和间充质（MES）类球体的类组装体技术，以模拟肝脏器官发生中早期结构，再现早期形态发生过程，并展示间质细胞迁移现象 在体这些创新的类组装体系统有助于识别影响类组装体形成和迁移的因素。肝内胚层类球体（HEP spheroid）培养系统也被用于模拟集体迁移和分支形态发生过程。间充质条件培养基（M-CM）在启动剂量依赖性分支迁移中发挥重要作用。所有所述方法均表现出高度可重复性和高成功率。通过将这些事件串联起来，本研究将有助于重现有序的形态发生事件，从而逆向解析器官发生过程 体外 和 体内.

目前，针对疾病建模、药物发现和组织工程（图7）等生物医学应用领域的合成组织研究日益受到关注。在该领域中，由人多能干细胞（hPSC）衍生的类器官、球状体及细胞正被构建成更具有合成性、复杂性且更大尺寸的组织。这一转变过程涉及形态发生原理的应用、微加工技术等工具的使用，以及生物基质的整合，从而实现对合成组织的精确工程化构建（图7）。本文介绍了若干与此总体主题相一致的方法。
聚团对类球体形成的影响 
本研究采用的方法依赖于三维类球体的成功形成。类球体在接种后五至九天内发生融合，最终形成完整且结构完整的类球体，即表明类球体形成成功。成功的一个早期迹象是，在培养板离心后，细胞在孔板中央发生聚团。尽管在细胞初始分布较分散的情况下类球体形成频率较低，但仍表明类球体仍有可能成功形成。若细胞在接种后九天内未能充分铺展并融合，则表明类球体形成失败。
在本实验中，采用了两种尺寸的类球体：小类球...

类器官技术革新了器官发育、药物发现和疾病研究中的个性化组织建模。类器官工程正朝着构建复杂合成组织的方向发展。其目标是整合形态发生、类组装体技术与生物基质，以推动组织工程的进步。本实验方案有助于模拟肝脏器官发生过程，并为合成组织的构建建立指导性规范。

慢性肝病已达到流行病的程度，全球受影响人数超过8亿。目前的治疗方法是原位肝移植……

我们的研究范围集中在肝脏器官发生领域。我们试图回答的问题是，肝脏是如何变得如此之大的，并利用逆向工程的方法从干细胞构建肝组织。在肝脏再生医学领域，最近的进展集中在微型化方向。我们正在利用干细胞制造能够模拟真实器官的微型组织，从而研究器官的形成过程和器官生物学。我们的实验室在肝脏再生医学领域取得了多项重要发现。通过应用这些微型化技术，我们已确定了肝脏器官发生过程中的关键步骤，包括形态发生和细胞迁移。因此，这是我们在该领域的一项关键发现。本论文中所述方案的优势在于，能够在微型化条件下实现多种不同的类器官技术。本质上，我们现在可以研究分支形态发生及其他迁移相关过程，这些是在微型肝脏组织中进行的、其他技术无法提供的研究内容。由于我们迄今为止所开展的工作，未来将要研究的问题涉及细胞的生长与迁移是如何协调的，以及我们如何通过特定机制将组织组装成更大型、类似肝脏的组织结构。首先，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于T75培养瓶中培养人肝母细胞瘤HepG2野生型细胞，每日更换培养基。当细胞达到80%融合度时，用PBS冲洗细胞。弃去PBS后，加入5毫升0.05%的胰蛋白酶EDTA孵育细胞。然后加入等量的cDMEM以冲洗细胞脱离培养瓶。待细胞脱落之后，将混合液转移至15毫升无菌锥形离心管中，在室温下以300 ×g离心5分钟。用cDMEM重悬细胞后，对细胞进行计数，以确定每毫升中的最终细胞浓度。为标记细胞，将细胞在15毫升锥形管中以300 ×g离心5分钟。将沉淀重悬于无血清培养基中，调整细胞终浓度为每毫升1×10⁶个细胞，并在旋转条件下，每毫升细胞悬液中加入5 µL荧光细胞标记溶液进行孵育。接着，将细胞悬液在450 ×g离心5分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于新鲜的cDMEM培养基中。进行类球体形成时，充分混匀细胞悬液，随后向每个经琼脂糖包被的96孔板孔中加入100 µL细胞悬液。将培养板在340 G条件下离心10分钟，并在37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育5至9天。无论大小，肝类球体在第5天均完全紧实，随着增厚从半透明转变为不透明。首先，在96孔板中获取肝类球体和间充质类球体。使用移液器将人包皮成纤维细胞或 HFF MRC-5 球体逐个收集至含有新鲜 cDMEM 的 15 毫升无菌锥形离心管中。将球体置于冰上孵育 5 分钟，使其沉降，然后用预温的 cDMEM 轻柔冲洗。使用移液器将单个 HFF MRC-5 球体轻柔转移至含有一个人类肝母细胞瘤 G2 野生型球体的孔中。将类球体与冰浴的生长因子减少型Matrigel以1:1比例孵育。然后，向每孔加入75 µL新鲜cDMEM，并在37°C、5% CO₂条件下培养两至三天。荧光显微镜观察及图像分析证实，尽管存在轻微的形态学差异，类组装体在不同基质和培养基中均成功形成。进一步分析表明，类球体之间距离越近，收缩时间越短。首先，获取来源于人肝母细胞瘤G2野生型细胞的肝类球体。将类球体单独收集至一个15毫升无菌锥形离心管中，并将试管置于冰上，使类球体沉降。然后，小心地从试管中吸除培养基。在另一个15毫升无菌试管中，将1毫升冰上预冷的生长因子减少型基质胶（Matrigel）或GFR MG与冰上预冷的对照培养基按1:1比例混合。将混合液加入含有类球体的试管中，确保类球体均匀分布。使用200微升移液器，从MG溶液中收集单个类球体15微升，缓慢接种至60毫米的培养皿中。随后，在37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育60分钟，然后缓慢加入5毫升所需培养基至培养皿中。至第9天，肝类球体已形成向成纤维细胞簇延伸的粗大迁移条索。首先，收集人包皮成纤维细胞或 HFF MRC-5 细胞，并以每平方厘米 5,000 个细胞的密度接种于 T75 组织培养处理过的培养瓶中。在 15 毫升完全 DMEM 培养基中，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 72 小时。接着，将间充质细胞条件培养基（M-CM）收集至 15 毫升无菌锥形管中，并在 290 ×g 下离心 5 分钟，以去除碎片。用0.2微米滤器过滤上清液以实现灭菌，并保留滤过液。然后，根据所需实验，用完全培养基将M-CM稀释至最高1:7的稀释比例。将HFF MRC-5细胞重悬于新鲜cDMEM中，使其最终浓度达到每毫升6×10⁵个细胞，并将试管置于冰上。将细胞悬液与冰浴的生长因子减少型Matrigel或大鼠尾尾胶原按1:1比例混合。取100微升HFF MRC-5与Matrigel混合液加入含有肝类球体的孔中，将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。最后，向每孔中加入75微升新鲜cDMEM，并继续孵育长达12天。通过肝类球体与M-CM形成液滴，在体外有效诱导了集体迁移。M-CM的浓度依赖性效应促进了类球体向外延伸出细胞条索和分支结构。至第11天，类球体伸出的细胞突起更加明显，形成了相互连接的片状结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于模拟肝脏器官发生、构建组合体和使用人类细胞系设计合成组织的体外培养技术

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

该方案旨在用于体外构建先进的三维肝细胞培养模型，可对纳米材料在急性或长期重复剂量暴露条件下相关的遗传毒性危害进行更符合生理状况的评估。...

用于长期纳米材料暴露后体外遗传毒性检测的先进三维肝脏模型

本方案介绍了一种具有伴随性纤维化间质区室的三维仿生模型。该模型采用生理相关浓度的水凝胶按比例制备，模拟间质细胞外基质的生物物理特性，而细胞外基质是细胞相互作用、肿瘤生长及转移的活性调节介质。...

一种用于在具有可调生物物理特性的三维环境中研究肿瘤-间质相互作用的肝癌仿生模型

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

我们对现有的肝细胞癌（HCC）类器官培养方案进行了全面概述和优化，涵盖了类器官培养的各个阶段。该体系可作为识别潜在治疗靶点和评估药物候选物有效性的有力模型。...

人肝细胞癌患者来源类器官模型的建立与优化用于潜在靶点识别及药物发现

本研究介绍了一种利用组织切片机自动生成患者来源的胶质母细胞瘤三维类器官的自动化方法。该方法为获得此类类器官用于治疗测试提供了一种合适且有效的途径。...

使用组织切片机体外培养患者来源的胶质瘤类器官

近期技术进步使得大规模生产成为可能 体外...

一种用于药物开发的全人源肝细胞培养系统

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

了解利用干细胞分化与微型化技术构建肝脏类器官的方法，研究肝脏器官发生过程中的形态发生与细胞迁移机制，为再生医学和组织工程提供重要的实验平台与理论依据。

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

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