Name: 通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 了解利用多重双报告基因策略分析SARS-CoV-2病毒颗粒表面蛋白表位的方法。该技术通过流式细胞术实现高通量病毒宿主相互作用分析，为抗病毒药物和疫苗开发提供新靶点。

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我们感谢瑞典 SciLifeLab 的亲和力蛋白质组学-斯德哥尔摩 SciLifeLab 单位团队开发并应用了本文所述的方法，感谢人源抗体治疗单位提供 scFv 和 Fab 试剂，以及 Jonas Klingström 提供经临床样本来源的 SARS-CoV-2 分离株感染的 VeroE6 细胞。作者感谢 Luminex 公司（德克萨斯州奥斯汀）的 Sherry Dunbar 博士（PhD，MBA）提供的研究支持，以及 Biomedical Publishing Solutions（佛罗里达州巴拿马城；mattsilver@yahoo.com）的 Matt Silverman 理学硕士（MSci）、博士（PhD）在科学内容和写作方面的协助。本研究得到了 Knut 和 Alice Wallenberg 基金会以及生命科学实验室（SciLifeLab）的资金支持（项目编号 VC2020-0015 资助 Claudia Fredolini 和 Francesca Chiodi，项目编号 VC-2022-0028 资助 Claudia Fredolini）。

1. 链霉亲和素和对照抗体与磁性微球的偶联
注意：使用不同荧光标记的荧光染色磁珠（直径为 6.5 µm、内含磁铁矿的聚苯乙烯微球），具体磁珠信息见材料表，用于制备以下珠结合物及对照：（1）与通过中性亲和素连接剂偶联的磁珠结合的生物素化重组人 ACE2；（2）与通过中性亲和素连接剂偶联的磁珠结合的生物素；（3）直接与磁珠偶联的山羊 IgG；以及（4）未偶联的磁珠。待偶联至磁珠的蛋白质应不含叠氮化钠、牛血清白蛋白（BSA）、甘氨酸、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、甘油或含胺类添加剂。活化缓冲液为 0.1 M 一碱磷酸钠（无水 NaH2PO4），pH 6。pH 5 的 2-吗啉乙磺酸（MES；50 mM）缓冲液用于稀释结合物。洗涤缓冲液为 PBS-T（1× PBS [磷酸盐缓冲盐水]，pH 7.4 + 0.05% (v/v) Tween-20）。储存缓冲液为 2.7 mg/mL ELISA 封闭试剂（BRE）+ 0.1% 抗菌剂（此处为 ProClin 300）。
<ol>
	<li>从冰箱中取出磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）粉末，以及从冷冻柜中取出预先分装好的65 mg 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC），室温（RT；18–22 °C）放置30分钟使其回温。在此期间，将NHS和EDC均存放于含有硅胶珠的封套中，以防止空气中的水分引起水解。</li>
	<li>准备微球用于活化和偶联。 
	注意：微球内的荧光染料对光敏感，非使用状态下应避光并保存于冷藏温度（4–8 °C）。
	<ol>
		<li>根据产品说明书，通过短暂涡旋、超声或旋转（15–30 rpm，15分钟）重悬四种不同颜色编码的微球储备液（12.5 × 106/mL）（材料表）。</li>
		<li>将每种微球悬液各40 µL（含5 × 105个微球）转移至半体积、平底96孔微孔板的指定孔中（材料表）。</li>
		<li>洗涤磁性微珠。 
		注意：洗涤步骤可手动操作，也可使用自动洗板机。
		<ol>
			<li>向各孔加入80 µL/孔活化缓冲液，将微孔板置于磁力板分离器上静置30秒，使微珠固定；在微珠仍被磁力固定时，吸除上清液。</li>
			<li>将微孔板从磁力板分离器上取下，用50 µL活化缓冲液重悬微珠。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用磺基-NHS和EDC活化微珠。
	<ol>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，用活化缓冲液配制50 mg/mL的磺基-NHS工作液。将NHS原装粉末放回冰箱（4–8 °C），并防潮保存。</li>
		<li>在另一1.5 mL微量离心管中，用活化缓冲液配制50 mg/mL的EDC工作液。将预先分装的65 mg EDC粉末溶于1.3 mL活化缓冲液中。 
		注意：磺基-NHS和EDC在溶解后即开始水解并逐渐失活。在向微珠中加入NHS和EDC之前，应避免中断偶联操作。溶解后的NHS或EDC溶液不得保存用于后续实验。</li>
		<li>通过体积比混合20%磺基-NHS储备液（50 mg/mL）、20% EDC储备液（50 mg/mL）和60%活化缓冲液，配制用于微珠活化的活化溶液。每个微珠活化反应（使用5 × 105个微珠/反应）需50 µL活化溶液，并额外准备足够体积以补偿移液损耗。</li>
		<li>向含有已洗涤微珠的各孔中加入50 µL完整的活化溶液。结合孔中原有的50 µL微珠悬液（在活化缓冲液中），最终磺基-NHS浓度为5 mg/mL，EDC最终浓度也为5 mg/mL。</li>
		<li>用一次性压敏塑料或铝箔封板膜密封微球反应板，在室温（18–22 °C）避光条件下，于轨道摇床上（650 rpm）孵育20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗去微珠上多余的活化溶液。
	<ol>
		<li>将微孔板在233 ×g下离心1分钟。</li>
		<li>将活化后的微珠置于磁力板分离器上固定30秒。取下封板膜，在微孔板仍置于磁力分离器上的情况下，吸除磁力固定的微珠上清液。</li>
		<li>将微孔板从磁力分离器上取下，向每孔加入100 µL MES缓冲液。</li>
		<li>重复步骤1.4.2–1.4.3一次，共完成两次洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将中性亲和素（neutravidin）和山羊IgG（对照）偶联至相应的微球组。准备足够的中性亲和素和山羊IgG工作液，每反应需100 µL，并额外准备足够体积以补偿移液损耗，具体如下： 
	注意：中性亲和素蛋白粉末需先用超纯水重悬，再用PBS稀释为1 mg/mL的储备液后分装保存/使用（中性亲和素蛋白不能直接溶于PBS，但可溶于水至约10 mg/mL）。
	<ol>
		<li>在1.5 mL低蛋白吸附微量离心管中，用MES缓冲液配制浓度为125 µg/mL的中性亲和素工作液。</li>
		<li>用MES缓冲液配制浓度为17.5 µg/mL的山羊IgG对照抗体工作液。&#160;</li>
		<li>准备含有活化微珠的微孔板。将微珠置于磁力板分离器上固定30秒，在微孔板仍置于磁力分离器上的情况下，吸除磁力固定的微珠上清液。</li>
		<li>向含有微珠的适当孔中加入100 µL中性亲和素工作液（125 µg/mL），用于中性亲和素-生物素及中性亲和素-ACE2偶联。</li>
		<li>向指定作为山羊IgG单独对照的孔中加入100 µL山羊IgG工作液（17.5 µg/mL）。</li>
		<li>向指定作为空白对照（未偶联微珠）的孔中加入100 µL MES缓冲液。</li>
		<li>密封微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下，于轨道摇床上（650 rpm）孵育2小时。孵育1小时后短暂涡旋混匀，以确保微珠保持悬浮状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PBS-T洗涤微珠。
	<ol>
		<li>将微孔板在233 × g下离心1分钟。</li>
		<li>将偶联后的微珠置于磁力板分离器上固定30秒，在微孔板仍置于磁力分离器上的情况下，吸除磁力固定的微珠上清液。</li>
		<li>将微孔板从磁力分离器上取下。</li>
		<li>向每孔含微珠的孔中加入100 µL PBS-T。</li>
		<li>重复洗涤步骤1.6.2–1.6.4一次，共完成两次PBS-T洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备偶联后的微珠用于储存。
	<ol>
		<li>将偶联后的微珠置于磁力板分离器上固定30秒，在微孔板仍置于磁力分离器上的情况下，吸除磁力固定的微珠上清液。将微孔板从磁力分离器上取下。</li>
		<li>向每种微球ID中加入50 µL储存缓冲液，以淬灭剩余的微珠活性。</li>
		<li>将微孔板置于冷藏温度（4–8 °C）避光过夜（16–22小时）孵育。</li>
		<li>将未偶联微珠和山羊IgG偶联微珠的悬液（各50 µL）转移至相应标记的1.5 mL低蛋白吸附微量离心管中，并用两份100 µL储存缓冲液冲洗原孔，以确保最大程度回收微珠。 
		注意：未偶联微珠和山羊IgG偶联微珠最终均为5 × 105个，总体积250 µL（即2 × 103个微珠/µL）。将离心管保存于冷藏温度（4–8 °C），待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物素化ACE2和生物素结合至中性亲和素偶联的微珠。
	<ol>
		<li>用10 mM PBS配制重组人源生物素化ACE2工作液，ACE2浓度为18 µg/mL，每反应需100 µL。同时用10 mM PBS配制生物素工作液，生物素浓度为2.4 mg/mL，每反应需100 µL。</li>
		<li>准备含有中性亲和素偶联微球的微孔板。
		<ol>
			<li>将微球置于磁力板分离器上固定30秒，在微孔板仍置于磁力分离器上的情况下，取下封板膜并吸除磁力固定的微球上清液。</li>
			<li>将微孔板从磁力分离器上取下，向每孔加入50 µL 10 mM PBS。</li>
			<li>重复步骤1.8.2.1–1.8.2.2一次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向含有中性亲和素偶联微球的适当孔中加入100 µL生物素化ACE2工作液。向其他适当孔中加入100 µL生物素工作液。</li>
		<li>密封微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下，于轨道摇床上（650 rpm）孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤1.6.1–1.6.5所述方法洗涤微球。</li>
	<li>按照步骤1.7.1–1.7.4所述方法制备并储存ACE2偶联和生物素偶联的微球。 
	注意：生物素化ACE2偶联微珠和生物素偶联微珠最终均为5 × 105个，总体积250 µL（即2 × 103个微珠/µL）。</li>
</ol>
2. 接合试验
<ol>
	<li>通过混合第1节中制备的四种微球（即：链霉亲和素-生物素化ACE2偶联微球、链霉亲和素-生物素偶联微球、山羊IgG偶联微球和未偶联微球）来制备微球混合液。 
	注意：储存用微球的浓度为 2 × 103 个微球/µL，混合时应使工作用微球混合液中每种微球的终浓度为 40 个/µL。
	<ol>
		<li>根据检测所需体积（5 µL/反应）计算工作用微球混合液的总体积，并额外预留用于弥补移液损失的体积。短暂涡旋每种微球悬液，然后在新的低蛋白吸附微量离心管中加入等量计算体积的四种微球悬液。此时微球浓度为每种微球 400 个/µL。</li>
		<li>用储存缓冲液将上述混合微球悬液进一步稀释10倍，制备工作用微球混合液（工作浓度为每种微球 40 个/µL）。 
		注意：可先配制少量工作用微球混合液，用于估算每种微球的微球数/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微球与山羊抗ACE2抗体孵育。
	<ol>
		<li>将 5 µL 工作用微球混合液分别加入平底半体积96孔微孔板的3个孔中。</li>
		<li>向微孔板中含微球的3个孔中各加入 50 µL 山羊抗ACE2抗体（用PBS-T稀释至 0.4 µg/mL，材料表）。密封微孔板，涡旋混匀，并在室温（18–22 °C）下避光于旋转摇床（650 rpm）孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 233 ×g 离心1分钟，沉淀微球，并按照1.6.2–1.6.4步骤所述用PBS-T洗涤微球三次。</li>
	<li>将微球与检测抗体孵育。
	<ol>
		<li>将 5 µL 工作用微球混合液分别加入微孔板中6个新的孔中。</li>
		<li>分别用PBS-T作为稀释液，在3个独立的1.5 mL离心管中配制每种检测抗体的工作混合液，浓度均为 1 µg/mL：抗山羊IgG-PE、抗小鼠IgG-PE和抗兔IgG-PE。</li>
		<li>将检测混合液各取 50 µL 分别加入3个孔中（每种检测抗体对应3个孔），其中抗山羊IgG-PE加入与步骤2.2中抗ACE2抗体相同的孔中。</li>
		<li>密封微孔板，涡旋混匀，并在室温（18–22 °C）下于旋转摇床（650 rpm）孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 233 × g 离心1分钟，沉淀微球，并按照1.6.2–1.6.4步骤所述用PBS-T洗涤微球三次。</li>
	<li>每孔加入 100 µL PBS-T，使用双报告系统流式分析仪进行检测，设置如下： 
	模式：双报告系统；超时时间：45秒；DD门控：7500–17500；每种微球最低计数：100个（最低质控阈值：每种微球35个）。</li>
</ol>
3. 产生SARS-CoV-2感染细胞的上清液
SARS-CoV-2 病毒在宿主 Vero E6 细胞（猴肾上皮细胞系；ATCC；材料表）中进行扩增。Vero E6 细胞在改良伊格尔培养基（MEM）中培养，培养条件为 37°C、5% CO2 和 95% 相对湿度。每升 MEM 中添加 10 mL L-谷氨酰胺（200 mM）、38 mL NaHCO3（7.5%）、5 mL 青霉素/链霉素溶液以及 50 mL 胎牛血清（FCS）；材料表。
警告：处理 SARS-CoV-2 时应采用适当的生物安全程序和设备。
<ol>
	<li>Vero E6 细胞在两个 150-cm² 培养瓶中培养至汇合2 细胞培养瓶。用SARS-CoV-2病毒感染其中一个培养瓶，另一个进行假感染处理作为对照。</li>
	<li>将约 100,000 个野生型（WT）SARS-CoV-2 感染性颗粒与 5 mL Eagle's MEM 培养基混合。</li>
	<li>从一个150 cm²培养瓶中吸除培养基2 烧瓶中加入 55 mL 完全 MEM 培养基以制备未感染对照上清液。吸除其余 150-cm² 培养瓶中的培养基2 将病毒混合液加入细胞中，37 °C孵育1小时，每15分钟轻轻摇动培养瓶以均匀分布病毒。</li>
	<li>向已接种SARS-CoV-2的培养瓶中加入50 mL完全MEM培养基，培养细胞直至观察到细胞病变效应，每24小时肉眼观察培养瓶一次。 
	注意：感染后大约需要3-4天才会出现细胞病变效应。根据国际标准化组织（ISO）指南，通过倒置光学显微镜观察Vero E6细胞单层结构的细胞病变效应（如细胞收缩、皱缩、变圆、脱落、胞质内颗粒消失、明显裂解等）进行定性评估。 体外 细胞毒性检测16.</li>
	<li>收集两个烧瓶中的细胞上清液，253 × g 离心6分钟 g 以沉淀细胞碎片。</li>
	<li>在细胞上清液中对SARS-CoV-2病毒进行紫外线灭活
	<ol>
		<li>将上清液每孔0.5 mL移取至24孔微孔板中的12个孔。将微孔板在适当的紫外灯下不加盖照射30秒。材料表). 
		注意：应通过在 Vero E6 细胞培养中尝试病毒扩增来确认细胞上清液中的病毒灭活效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞上清液分装至1.5 mL离心管中，于-20 °C保存备用。 
	注意：细胞上清液可在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
4.&#160;检测细胞上清液中的SARS-CoV-2病毒颗粒
<ol>
	<li>通过混合0.1% 酪蛋白、0.5% 聚乙烯醇、0.8% 聚乙烯吡咯烷酮和1% BSA（均为w/v，pH 7）配制检测缓冲液。通过在检测缓冲液中配制10% 兔IgG来制备样本稀释缓冲液。</li>
	<li>计算并配制用于检测的工作微珠混合物（步骤2.1）所需体积（5 µL/反应），并额外准备一定体积以补偿移液过程中的损失。</li>
	<li>制备上清液稀释系列。计算所需上清液体积。对每种scFv的每个稀释点进行三复孔检测，共五种scFv，因此每个稀释点和样本类型需15个孔。每孔使用45 µL稀释后的上清液，总计需675 µL；对于SARS-CoV-2和对照上清液，各使用一个1.5 mL微量离心管即可。
	<ol>
		<li>在4 °C条件下解冻SARS-CoV-2上清液和对照上清液至少1小时。保持上清液及其稀释液处于低温（2–8 °C）直至使用。为SARS-CoV-2和对照上清液分别标记并准备八个1.5 mL微量离心管。 
		注：最高检测浓度为1:1（2倍）上清液稀释，随后使用样本稀释缓冲液进行一系列1:2（3倍）稀释，最高稀释倍数为1:1458。仅含样本稀释缓冲液的空白孔作为无上清液对照。因此，每种上清液类型（SARS-CoV-2或对照）的检测稀释倍数分别为2、6、18、54、162、486和1458倍，并设缓冲液对照。</li>
		<li>向已标记的微量离心管中加入样本稀释缓冲液。1:1（2倍）稀释管需加入600 µL缓冲液，其余各管需加入800 µL缓冲液。通过在相应标记的管中将600 µL上清液与600 µL样本稀释缓冲液混合，制备最高浓度（1:1；2倍）的上清液稀释液，随后短暂涡旋混匀。</li>
		<li>通过依次将400 µL的1:1（2倍）稀释上清液转移至下一稀释管（即6倍稀释），继续进行3倍系列稀释，直至制备出最低稀释度（1458倍）。每次稀释前，均需短暂涡旋混匀各稀释上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使微球与上清液孵育。
	<ol>
		<li>将预先配制的工作微珠混合物涡旋30秒以重悬微球，然后向平底384孔微孔板的每个指定孔中加入5 µL微珠混合物。 
		注：也可使用96孔板。</li>
		<li>向384孔板中含微球的指定孔加入45 µL已配制的上清液稀释液。密封微孔板，并在室温（18–22 °C）避光条件下于旋转摇床（650 rpm）上孵育过夜（16–22小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤去除微球上的过量上清液。
	<ol>
		<li>从旋转摇床上取下微孔板，移除封板膜。以931 × g 离心1分钟。</li>
		<li>将微孔板置于磁力板分离器上30秒，使微球固定。保持微孔板仍在磁力分离器上，移除封板膜，并吸走上清液。</li>
		<li>将微孔板从磁力分离器上取下。</li>
		<li>向每个含微球的孔中加入60 µL PBS-T。</li>
		<li>重复步骤4.5.2–4.5.4两次，共进行三次PBS-T洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在不同的1.5 mL离心管中分别配制不同的检测混合液。每种检测混合液包含一种商用的人源单克隆抗S1（Hu-anti-S1）抗体（1 µg/mL）和五种不同FLAG标签scFv中的一种（1 µg/mL）（补充文件1、补充表1 和 补充表2），这些scFv靶向SARS-CoV-2颗粒上的刺突蛋白，用检测缓冲液（步骤4.1）稀释，共配制五种不同的检测混合液。</li>
	<li>重复步骤4.5.2–4.5.3。将洗涤后的微球重悬于每孔50 µL对应scFv特异性的刺突蛋白检测混合液中。密封微孔板，并在室温（18–22 °C）避光条件下于旋转摇床（650 rpm）上孵育1小时。</li>
	<li>以931 × g 离心微孔板1分钟。洗涤去除微球上过量的刺突蛋白检测试剂。按照步骤4.5.2–4.5.5，使用60 µL PBS-T进行三次洗涤。</li>
	<li>使微球与荧光检测抗体混合液孵育。
	<ol>
		<li>配制荧光溶液混合液，其中包含市售的PE标记抗人IgG抗体和BV421标记抗FLAG抗体，分别用检测缓冲液稀释至工作浓度0.2 µg/mL和1 µg/mL。每反应需50 µL荧光检测试剂。</li>
		<li>重复步骤4.5.2–4.5.3。将微球重悬于每孔50 µL荧光溶液混合液中。密封微孔板，并在室温（18–22 °C）避光条件下于旋转摇床（650 rpm）上孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以931 × g 离心微孔板1分钟。洗涤去除微球上过量的荧光溶液混合液。按照步骤4.5.2–4.5.5，使用60 µL PBS-T进行三次洗涤。</li>
	<li>将微球重悬于上一步洗涤后剩余的60 µL PBS-T中。使用步骤2.6所述参数，在双报告系统流式分析仪上分析微孔板。</li>
</ol>

Analysis of SARS-CoV-2 Using Dual-Reporter and Multiplex Technology

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作者声明无利益冲突。

基于微球的多重技术已被证明是在多种临床应用中进行高通量病原体检测的有价值平台。该平台基于流式细胞术原理，具有高度灵活性，可同时靶向检测数百种分析物，包括抗体、蛋白质和核酸18,19,20,21,22。然而，据我们所知，该技术此前尚未被用于检测完整的病毒颗粒。在本报告中，通过靶向SARS-CoV-2的三个独立表面表位，将该技术应用于完整病毒颗粒的检测。
有包膜RNA病毒与细胞外囊泡（EVs）在结构上具有高度相似性，后者是携带病毒RNA和蛋白质以及宿主蛋白质的小型磷脂双分子层膜结构23。此前已采用夹心免疫测定法检测EVs，该方法利用一对特异性识别两种不同表面蛋白的抗体24,25。传统夹心法仅能同时检测两种蛋白，而多重检测技术突破了这一限制，可在单次反应中同时检测两种以上的蛋白质。
此处所述的三激光双报告系统是迄今为止最先进的基于微球的流式分析仪器。与单报告读出系统相比，双报告系统（RP1 和 RP2 通道）可同时检测三种表面蛋白/表位。靶向多种病毒表面蛋白和表位能够更准确地反映病毒蛋白载量，这不仅可确认病毒确实保持完整，还为进一步研究病毒表面抗原以及病毒与宿主蛋白相互作用的机制提供了可能。
在 COVID-19 大流行期间，及时识别携带活性病毒颗粒的个体对于控制病毒传播至关重要。定量 RT-PCR 可检测到基因组 RNA，而不论其来源（完整病毒颗粒或游离 RNA）。然而，只有具备完整包膜且表面刺突蛋白（S 蛋白）可及的病毒才能介导细胞进入并实现后续的病毒复制。既往在患者样本中应用微流控芯片的研究表明，若能结合完整病毒颗粒的检测与即时检测（point-of-care testing），将有助于实现频繁检测，加强对疾病传播的监测，并更科学地确定需隔离的个体26。采用基于多重微球的检测方法，可设计用于同时筛查多种病毒及其表面抗原变异体的检测方案，从而更准确地掌握病毒在人群中的传播情况。
流式病毒术是流式细胞术的最新发展，旨在分析病毒颗粒。尽管该技术能够检测到离散的病毒颗粒，但对小型病毒的分析目前仍是流式病毒术面临的一个难题27,28。与本文所述方法类似，流式病毒术涉及利用与抗体偶联的金纳米颗粒捕获完整的病毒粒子。这两种方法的局限性包括：（i）依赖于针对微球或纳米颗粒所靶向的表面表达抗原的高亲和力捕获和检测试剂；（ii）区分病毒颗粒与细胞外囊泡的能力有限；（iii）缺乏用于准确颗粒定量的标准。
细胞会向周围环境分泌细胞外囊泡（EVs），当细胞被病毒感染时，还可能分泌与EVs大小相似且最终可能表达相同抗原的病毒粒子29。由于EVs的膜组成与病毒相似，仅使用基于亲和力的方法（如双激光单报告分子法）可能难以将二者区分开来。然而，本文所述策略具有更高的多重检测能力，可对颗粒的蛋白质组成进行更广泛、更深入的分析。基于流式的方法能够追踪单个颗粒，从而实现数字式定量。在本方法中解决定量问题的一种策略是：使用经过充分表征的、表达目标抗原的合成囊泡作为病毒样颗粒（VLPs），用于绘制标准曲线。
SARS-CoV-2 进入和离开宿主细胞的常见途径是通过病毒与宿主细胞膜之间的相互作用2,15。在此过程中，宿主膜蛋白被整合到病毒表面的可能性较高。通过筛选这些被整合的宿主蛋白，可以追踪感染途径，并可能预测不同风险患者疾病的&#160;进程，从而实现更早的治疗决策。此外，该方法还可在科研实验室中用于对不同样本批次的病毒进行表征。进一步研究可探讨不同特征是否与病毒传染性的不同水平相关，并可用于筛选靶向病毒表面蛋白的抗体和药物分子。
该方法的一个重要方面在于其依赖捕获和检测试剂对病毒上靶蛋白的亲和力。因此，亲和试剂的选择是决定检测性能的关键因素。可能需要筛选和测试多种亲和试剂，以确定在捕获和检测中具有最高亲和力的试剂。在此，使用重组受体结合域（RBD）以及来自感染SARS-CoV-2的Calu-3人肺上皮细胞上清液中的病毒颗粒，初步评估了10种scFv和12种Fab片段的性能（在所有后续研究中，使用VeroE6细胞进行培养/评估细胞毒性）。使用抗FLAG PE标记物检测带FLAG标签的scFv（补充表1和补充表2）。随后从中选出表现最佳的五种scFv，并与商用的人源抗S1抗体（表1）联合应用于感染的VeroE6非洲绿猴肾上皮细胞上清液的双报告检测中。
该实验方案成功的另一个关键因素是所选择的微球偶联方法。偶联方法应具有高效性，同时保持构象性表位或参与蛋白质结合的氨基酸残基完整且未被修饰。本研究采用EDC-NHS反应将中性亲和素（neutravidin）直接偶联至微球，并基于先前报道的方法30，利用中性亲和素与生物素（neutravidin + biotin）系统将重组ACE2蛋白结合到已偶联的微球上。其他偶联方法及其偶联效率亦可进行测试和比较。最后观察发现，不同荧光标记的检测试剂（例如，抗FLAG-藻红蛋白（anti-FLAG PE）和抗FLAG Brilliant Violet 421）可能导致不同的MFI水平，从而影响检测的灵敏度。
综上所述，本研究所描述的方法通过采用双报告分子策略，可实现对溶液中完整病毒颗粒的检测。同时分析三种表面决定簇，可提供一种更为特异的工具，用于表征病毒颗粒，并最终将其与其他细胞外囊泡（EVs）区分开来（例如，不含病毒抗原的囊泡）。该策略是流式病毒分析法的一种替代方案。尽管当前方法尚不能区分颗粒大小，但利用编码颜色的微球进行磁珠富集的策略，可通过高通量、高多重的分析方式，在表面抗原谱型分析和实验设计方面提供更广泛的能力。该检测方法具有高精确度和稳健性，且可拓展应用于任何类型细胞外囊泡或其他体液或液体基质中暴露表面抗原的生物颗粒的分析。本研究是一项概念验证性研究，证明了单链可变区片段（scFv）作为多重检测体系中一种检测试剂，在病毒颗粒多个蛋白表位分析中的实用性。未来还需进一步研究以明确scFv的特定性质（例如，结合亲和力、与其他试剂及靶标的交叉反应性），方能将其用于定量分析或临床用途。

最常见的致病病毒，如流感病毒、HIV、人巨细胞病毒以及SARS-CoV毒株，均为包膜病毒。包膜病毒对细胞的感染需要病毒膜与宿主细胞膜发生融合，从而将病毒基因组释放到细胞质中。随后病毒RNA进行复制，并被包装进新的病毒颗粒1,2。在这些过程中，不仅病毒蛋白，宿主细胞膜蛋白也可能被整合到病毒包膜中，成为新病毒颗粒的组成部分。整合到病毒包膜中的宿主细胞膜蛋白可能促进病毒进入新的宿主细胞，利用细胞间相互作用、归巢机制以及逃避免疫系统的机制3,4。
尽管研究病毒相关蛋白具有重要意义，但目前大多数可用的病毒分析技术5尚无法支持对病毒表面抗原进行高通量、高多重的表征，也无法检测单个病毒颗粒，或区分具有感染性的完整病毒颗粒、无感染性的RNA、病毒蛋白以及表达不同抗原的病毒亚群。近年来，流式细胞术经过改进并被应用于病毒颗粒分析，形成了一种新方法，即病毒流式分析法（flow virometry）。该方法可实现对单个病毒颗粒及其表面抗原的研究。然而，该技术仍存在诸多局限性，包括通量低、多重检测能力有限、实验操作复杂、数据分析困难，以及对小尺寸病毒颗粒的检测灵敏度有限等问题6,7。
基于微球的多重蛋白质和核酸定量技术是一种成熟的技术，具有广泛的应用，包括体液中的蛋白质定量、蛋白质-蛋白质相互作用研究以及病毒感染的诊断8,9,10,11,12,13。最近推出的一种流式分析仪器具备双报告通道，可在同一反应孔中检测两种荧光报告分子。这一新功能已被证明在不同免疫球蛋白同种型的并行分析中尤为有用14。本文描述了如何利用双报告系统并行靶向多种表面抗原，以检测完整的病毒颗粒。
作为概念验证，本报告详细介绍了针对SARS-CoV-2病毒颗粒的三重检测系统的开发。SARS-CoV-2由四种主要蛋白组成，其中之一是刺突蛋白（S），该蛋白包含两个亚基。第一个亚基S1可与人类细胞膜上表达的ACE2受体进行主要结合；第二个亚基S2则通过融合肽促进病毒进入靶细胞，在靶细胞膜上形成孔道，使病毒颗粒得以进入15。SARS-CoV-2其余三个结构蛋白分别为核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）和包膜蛋白（E）。核衣壳蛋白负责与RNA共同形成核糖核蛋白复合物，从而包装病毒基因组；而膜蛋白和包膜蛋白在病毒组装过程中发挥核心作用。
本实验针对表达于SARS-CoV-2包膜表面的S1亚基上的三个独立表位。实验使用SARS-CoV-2感染和未感染细胞的上清液进行系列稀释。病毒颗粒通过ACE2偶联的微球结合病毒表面的S1亚基而被捕获。随后，利用一种 commercially-available 带标签的免疫球蛋白单链可变区片段（scFv）、一种人源单克隆抗S1抗体（Hu-anti-S1）以及本实验室开发的FLAG标签scFv，平行检测病毒表面的S蛋白。在双报告系统中，Hu-anti-S1通过第一通道（RP1）进行检测，使用橙色R-藻红蛋白（PE）偶联的抗人IgG-Fc二抗；scFv则通过第二通道（RP2）进行检测，使用蓝色Brilliant Violet 421（BV421）偶联的抗FLAG二抗。病毒颗粒检测流程见图1。

<table><tbody><tr><td>ACE2-生物素</td><td>Acro Biosystems（美国特拉华州纽瓦克）</td><td>AC2-H82E6-25 μg</td><td>浓度：340 &amp;micro;g/mL，批号 BV35376-203HFI-2128</td></tr><tr><td>PE标记的抗山羊IgG</td><td>杰克逊免疫研究实验室（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）&amp;nbsp;</td><td>705-116-147</td><td>宿主物种：驴&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人IgG R-PE&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>H10104</td><td>浓度：0.15 mg/mL，货号：2079224，宿主物种：山羊</td></tr><tr><td>PE标记的抗小鼠IgG</td><td>杰克逊免疫研究实验室（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）&amp;nbsp;</td><td>115-116-146</td><td>宿主物种：山羊&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PE标记的山羊抗兔IgG&amp;nbsp;</td><td>杰克逊免疫研究实验室（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）&amp;nbsp;</td><td>111-116-144</td><td>宿主物种：山羊&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Thermo-Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>20RUO</td><td>100 mM，pH 10，浓度 1 mg/mL</td></tr><tr><td>PBS 中的酪蛋白封闭液</td><td>赛默飞世尔科技（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>37528</td><td>LOT#VD301372</td></tr><tr><td>ELISA封闭试剂（BRE）</td><td>罗氏（瑞士巴塞尔）</td><td>11112589001</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗 DYKDDDDK 标签抗体（抗 FLAG），0.2 mg/ml，大鼠 IgG2a &amp;lambda;</td><td>BioLegend（荷兰阿姆斯特丹）</td><td>637321</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Saveen &amp;amp; Werner（瑞典林雪平）</td><td>B2000-500</td><td>LOT#04D5865</td></tr><tr><td>EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）</td><td>Proteochem（美国犹他州飓风市）</td><td>C1100-定制（65 mg）</td><td>LOT# MK3857</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Gibco/Thermo Fisher（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗ACE2多克隆抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems/Bio-Techne（美国明尼阿波利斯）</td><td>AF933</td><td>宿主物种：山羊&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊IgG</td><td>Bethyl Labs（德克萨斯州蒙哥马利）</td><td>P50-200</td><td>LOT#P50-200-6</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>低吸附 1.5 mL 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>VWR（美国拉德诺）</td><td>525-0133</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex-C 微球</td><td>Luminex Corporation（美国德克萨斯州奥斯汀市）</td><td>MC10XXX-01</td><td></td></tr><tr><td>MEM 组织培养基</td><td>Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)</td><td>21430-020</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板，聚苯乙烯，半面积，透明</td><td>Greiner Bio-One（克雷姆斯明斯特）&amp;uuml;奥地利</td><td>675101</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)</td><td>25080-060</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>31000</td><td>批号：UK292857</td></tr><tr><td>PBS片剂</td><td>Medicago AB（瑞典乌普萨拉）</td><td>09-9400-100</td><td>LOT#272320-01</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco/Thermo Fisher（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚（乙烯醇）</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）&amp;nbsp;</td><td>360627</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）&amp;nbsp;</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>ProClin 300</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）&amp;nbsp;</td><td>48915-U</td><td></td></tr><tr><td>兔IgG</td><td>Bethyl 实验室（美国德克萨斯州蒙哥马利）</td><td>P120-301</td><td>批号#12</td></tr><tr><td>scFv-FAb1</td><td>内部生产</td><td></td><td>瑞典SciLifeLab人类抗体治疗单元。单克隆scFv。浓度：0.12 mg/mL。</td></tr><tr><td>scFv-FAb2</td><td>内部生产</td><td></td><td>瑞典SciLifeLab人类抗体治疗单元。单克隆scFv。批次1浓度：0.38 mg/mL。批次2浓度：0.45 mg/mL</td></tr><tr><td>scFv-FAb3</td><td>内部生产</td><td></td><td>瑞典SciLifeLab人类抗体治疗单元。单克隆scFv。浓度：0.34 mg/mL。</td></tr><tr><td>scFv-FAb4</td><td>内部生产</td><td></td><td>瑞典SciLifeLab人类抗体治疗单元。单克隆scFv。浓度：2.85 mg/mL。</td></tr><tr><td>scFv-FAb5</td><td>内部生产</td><td></td><td>瑞典 SciLifeLab 人类抗体治疗单元。单克隆 scFv。浓度：2.7 mg/mL。</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 感染性颗粒，瑞典分离株</td><td>内部生产&amp;nbsp;</td><td></td><td>瑞典公共卫生局</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 刺突抗体（人抗-S1）</td><td>Novus Biologicals（科罗拉多州森特尼尔）</td><td>NBP2-90980&amp;nbsp;</td><td>单克隆抗体。浓度：1 mg/mL。宿主：人。克隆号：CR3022。同种型：IgG1 Kappa。批号：T201B06</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠，无水</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）&amp;nbsp;</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）</td><td>赛默飞世尔科技（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>24510</td><td>批号 XH321563</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>BP337-50</td><td>LOT#194435</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Vilber Lourmat GmbH（德国埃伯哈德策尔）</td><td>VL-215.G</td><td>波长 = 254 nm；2 &amp;times; 15瓦灯泡</td></tr><tr><td>Vero E6 细胞</td><td>ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE（双报告分子流式仪）</td><td>Luminex Corporation（美国奥斯汀）</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr></tbody></table>

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

包膜病毒上的膜蛋白在多种生物学功能中发挥重要作用，包括病毒与靶细胞受体的结合、病毒颗粒与宿主细胞的融合、宿主与病毒之间的相互作用以及疾病发病机制。此外，存在于病毒颗粒上及宿主细胞表面展示的病毒膜蛋白已被证实是抗病毒药物和疫苗的理想靶点。本文描述了一种利用双报告系统流式细胞术检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）颗粒表面蛋白的实验方案。该检测方法采用多重技术，通过三个独立的亲和反应实现对病毒颗粒的三重检测。使用与重组人血管紧张素转换酶2（ACE2）偶联的磁珠从SARS-CoV-2感染细胞的上清液中捕获病毒颗粒。随后，同时加入两种分别标记R-藻红蛋白（PE）或 Brilliant Violet 421（BV421）的检测试剂。为验证概念可行性，采用了靶向SARS-CoV-2表面刺突蛋白（S1）不同表位的抗体片段。通过三个独立的亲和反应对病毒颗粒进行检测，具有高度特异性，并可确认完整病毒颗粒的有效捕获。对SARS-CoV-2感染细胞上清液进行剂量依赖性曲线分析，重复实验的变异系数（均值/标准差） &#706;14%。双通道检测的良好实验性能证实，可同时检测病毒表面两种靶蛋白的表位。本方案可应用于：（i）对包膜病毒表面表达的蛋白质进行高通量、高多重分析；（ii）检测具有活性的完整病毒颗粒；以及（iii）评估抗体和抗病毒药物对病毒抗原表面表位的特异性和亲和力。该方法还可拓展应用于暴露于体液或其他液体基质中各类细胞外囊泡和生物颗粒的检测。

偶联检测 
偶联实验表明，山羊IgG和亲和素-生物素化的ACE2已成功偶联至微球。通过使用不同动物来源的PE标记的二抗检测ACE2偶联微球，验证了该检测方法的特异性（图2）。不同检测抗体之间未观察到交叉反应。当使用山羊抗ACE2抗体与抗山羊IgG-PE抗体共同孵育微球混合物时，ACE2偶联微球和山羊IgG偶联微球均检测到高于背景的中位荧光强度（MFI；任意单位）值，而未偶联微球（裸露微球）或生物素包被微球则无信号。以抗小鼠IgG-PE和抗兔IgG-PE作为阴性对照，用于排除假阳性信号。微球与这些对照抗体孵育后产生的荧光信号可忽略不计，表明ACE2和山羊IgG的阳性信号具有特异性。
细胞上清液中病毒颗粒的可检测性 
使用偶联了重组人ACE2的磁珠从感染和对照（无病毒）VeroE6细胞培养上清液中捕获SARS-CoV-2病毒颗粒，随后利用一种单克隆抗体和五种不同的scFv同时检测病毒刺突蛋白的两个不同区域。在SARS-CoV-2感染细胞上清液的不同稀释度中，两个报告通道（RP1和RP2）均观察到浓度依赖性信号（图3），表明商用的Hu-anti-S1抗体以及不同的scFv均可识别结合在ACE2偶联微球上的病毒颗粒。在五种scFv中，有三种（scFv2、scFv3、scFv5）可在稀释至1:18时仍检测到病毒；其余两种scFv（scFv7和scFv9）则可检测至1:6稀释度。这种差异可能归因于对靶标的亲和力不同。如图3和表1所示，scFv3产生的MFI信号强度最高，其次分别为scFv5、scFv2、scFv7和scFv9。
全球范围内，与Hu-抗S1相比，scFv的检测结果显示出较低的MFI值。这可能表明其亲和力较低，但也可能是由于使用了不同的荧光染料（PE和BV421）标记所导致的人为假象。scFv7和scFv9的另一个趋势是，与其余三种构型相比，RP1通道（抗刺突蛋白）的MFI值也略低。这可能表明scFv与ACE2-Hu-抗S1相互作用之间存在交叉反应或以其他方式产生干扰，这也可能解释RP2通道中信号较低的现象。在未感染的Vero E6细胞上清液中，无论在RP1还是RP2通道均未检测到病毒颗粒。
链霉亲和素-生物素偶联的微球、山羊IgG微球以及未偶联的微球用作阴性对照微珠。病毒颗粒通过与ACE2偶联的磁性微球捕获，并使用商业化的抗刺突蛋白人源抗体在RP1报告通道中检测，同时在RP2报告通道中使用不同的scFv进行检测（各图左上角标注了所用的scFv）。在所有感染和非感染样本中均未检测到病毒颗粒。
检测的精密度与稳健性 
为评估检测的精密度，所有条件均设置三个重复。针对每个稀释点，计算了ACE2微球的变异系数（CV）。该检测中所有计算得到的CV值均低于15%，其中最高CV值为13%，最低为1%（表2）。从RP1通道的密度图（图4）可以看出，商品化人源抗S1抗体（Hu-anti-S1）的PE检测具有更高的精密度，CV值主要集中在3%左右。而RP2通道中scFV的BV检测CV值较高。然而，如表2所示，较高的CV值范围主要由病毒颗粒浓度较低的样本（例如空白样本）所驱动。为测试实验方案的稳健性，不同操作人员在不同日期制备微球混合物，并使用较低的样本量（减少72%），重复进行了两次实验。RP1和RP2通道均表现出极好的皮尔逊相关性，相关系数在0.98至1之间（p值 &lt; 0.01），证实了该检测的稳健性，并表明在样本量较少的情况下仍可应用该检测方法（图5）。该流式分析技术遵循“环境分析物理论”17，因此该检测对浓度敏感，而对样本体积不敏感。
<img alt="SARS-CoV-2 检测实验；中和过程，ACE2-微球法，荧光结果示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：病毒颗粒检测实验。（A）将感染与未感染的 Vero E6 细胞的上清液进行系列稀释后，加入至 96 孔板或 384 孔板中，并加入与链霉亲和素偶联的磁性微球，随后与生物素标记的人源 ACE2 或生物素结合。未偶联的微球与山羊 IgG 结合，以及裸露微球，与链霉亲和素-生物素偶联微球一同作为阴性对照。（B）形成的微球-病毒颗粒复合物使用检测混合液进行检测，该混合液包含 Hu-anti-S1 和一种带 FLAG 标签的不同 scFv 抗体。随后加入荧光混合液，其中包含靶向 Hu-anti-S1 的抗人 IgG-PE（藻红蛋白）以及靶向 scFv 的抗 FLAG Brilliant Violet 421。（C）三激光双检测系统发射红色、绿色和紫色激光以检测微粒复合物。红色激光检测微球的染料标记，绿色和紫色激光分别检测抗 S1 抗体和 scFv 抗体。生成的数据随后进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抗体偶联检测柱状图，显示MFI结果；抗ACE2，山羊IgG检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：偶联验证图。 微球混合物包含四种不同的微球ID，每种偶联了不同的蛋白：链霉亲和素-生物素-ACE2（ACE2）、未偶联微球（裸珠）、链霉亲和素-生物素（Biotin）和山羊IgG（Goat IgG）。在偶联检测中，使用了三种不同配置的检测荧光染料，分别为：山羊抗ACE2 + 抗山羊IgG-PE、抗小鼠IgG-PE 和 抗兔IgG-PE。Y轴显示在三种不同条件下每种微球测得的平均MFI（中位荧光强度；任意单位）信号。X轴显示所应用的不同捕获抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ACE2 scFv 蛋白结合；稀释度与平均荧光强度（MFI）曲线图；VeroE6 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：表面蛋白的多重检测。 Y轴：每个样本的平均MFI（中位荧光强度；任意单位 ± 标准差），每种条件设三个复孔进行分析。X轴：细胞上清液的系列稀释点。橙色：使用人源抗刺突蛋白抗体 + 抗人PE（藻红蛋白）检测Vero E6细胞感染SARS-CoV-2野生型（WT）后的上清液中的病毒颗粒。蓝色：使用不同的scFv抗体 + 抗FLAG Brilliant Violet 421检测Vero E6细胞感染SARS-CoV-2 WT后的上清液。灰色：使用人源抗刺突蛋白抗体 + 抗人PE检测未感染细胞的上清液。黑色：使用五种不同的scFv抗体 + 抗FLAG Brilliant Violet 421检测未感染细胞的上清液。病毒颗粒通过与ACE2偶联的磁性微球捕获，并在RP1报告通道中使用商用的人源抗刺突蛋白抗体检测，在RP2报告通道中使用不同的scFv抗体检测（各图左上角标明所用scFv）。在所有未感染的样本中均未检测到病毒颗粒。scFv3所靶向的表位具有最高的亲和力。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CV% 分布图，频率 vs CV%，比较两个数据通道 RP1 和 RP2。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：变异分散图。 Y 轴表示事件发生的频率，X 轴显示不同样本各重复的变异系数（CV）百分比。RP1 和 RP2 分别为第一和第二报告通道，用于检测与藻红蛋白和 Brilliant Violet 421 相关的荧光信号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术log(MFI)相关性分析图，RP1和RP2数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：运行间相关性矩阵。（A，B）Y轴：三次独立运行之间在log10尺度上的皮尔逊相关性矩阵，三次运行由三位不同操作人员使用不同的微球混合物完成，第三次运行采用较低的样本体积。直方图显示基于测得的MFI值的不同变量簇的分布情况。（A）不同运行间RP1报告通道的相关性。（B）不同运行间RP2报告通道的相关性。MFI = 任意单位下的中位荧光强度。***p &lt; 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>检测</td>
			<td>反应性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv2</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv3</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv5</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv7</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv9</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人抗刺突蛋白IgG</td>
			<td>++++</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：基于标准曲线中获得的MFI强度对scFv在检测中的排序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>RP1 (PE)</td>
			<td>RP2 (BV421)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本稀释度</td>
			<td>变异系数范围 [%]</td>
			<td>变异系数范围 [%]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空白</td>
			<td>3–11</td>
			<td>2–13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1458</td>
			<td>1–7</td>
			<td>2–7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:456</td>
			<td>4–6</td>
			<td>3–8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:162</td>
			<td>3–6</td>
			<td>3–7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:54</td>
			<td>2–4</td>
			<td>2–4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:18</td>
			<td>2–4</td>
			<td>1–4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>2–6</td>
			<td>1–6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>1–5</td>
			<td>1–3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：SARS-CoV-2感染上清液在RP1和RP2报告通道中各稀释点的变异系数（CV%）范围（均值/标准差 × 100）。
补充文件1：免疫球蛋白单链可变区片段（scFv）的制备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：使用 Fab 以重组刺突蛋白（RBD）系列稀释液成对筛选 scFv。 为评估不同检测肽的性能，将 12 种刺突蛋白 Fab 组合作为捕获抗体，加入含重组 RBD 的缓冲液中。应用 10 种靶向刺突蛋白不同表位的 scFv 作为检测抗体。根据捕获-检测配对的表现，结果被标记为失败（-）或成功（+）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：使用 Fab 片段与 scFv 成对检测 SARS-CoV-2 感染的 Calu-3 细胞上清液的系列稀释样本。 为评估不同检测肽的性能，采用 12 种不同的刺突蛋白 Fab 片段作为捕获试剂，针对 SARS-CoV-2 感染的 Calu-3 细胞上清液进行检测。选取 10 种靶向刺突蛋白不同表位的 scFv 作为检测试剂。根据捕获-检测配对的实验结果，将其标记为失败（-）或成功（+）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。

包膜病毒上的膜蛋白在多种生物学功能中发挥重要作用，包括病毒与靶细胞受体的结合、膜融合……

对包膜病毒的蛋白质组学分析表明，宿主蛋白会被整合到新形成的病毒中，从而影响病毒的复制、感染效率和致病性。本研究聚焦于病毒颗粒表面蛋白的图谱分析，旨在揭示病毒与宿主相互作用中的关键因子，为抗病毒药物和疫苗开发提供新的靶点。免疫电子显微镜是唯一能够直接可视化病毒表达蛋白的成像技术。然而，目前更常用的是基于磁珠的质谱免疫捕获技术和新兴的流动生物检测技术，以实现更广泛的蛋白质组分析，并对大量病毒颗粒进行筛选。我们的方法采用颜色编码的发光速度和双列表读出技术进行免疫捕获，能够对完整病毒变异体上的宿主表面蛋白进行多重分析，同时对多种病毒和抗原进行抗体及抗病毒药物的筛选。质谱分析和亲和蛋白质组学是鉴定病毒变体表面病毒蛋白和宿主蛋白的有力工具。我们所描述的策略将有助于更深入理解宿主蛋白在病毒颗粒上的作用，从而能够在不同实验条件下对感染样本进行高通量分析。首先，在1.5毫升低蛋白吸附的微量离心管中，用MES缓冲液配制NeutrAvidin的工作溶液。然后，用 MES 缓冲液配制山羊免疫球蛋白 G 对照抗体的工作溶液。涡旋振荡稀释后的抗体溶液，并对离心管进行离心。接下来，取含有活化珠的微量滴定板，置于磁力板分离器上静置30秒，使珠子固定。保持微量滴定板位于磁力分离器上的状态，吸除磁力固定的珠子上方的上清液。然后，向含有珠子的相应孔中加入100 µL NeutrAvidin溶液、抗体溶液和MES缓冲液。密封微孔板，并在室温下避光、以650 RPM在摇床中孵育两小时。然后使用自动洗板机用PBST洗涤磁珠。在过夜孵育后，用10毫摩尔磷酸盐缓冲液配制重组人生物素化ACE2和生物素工作液。将微球置于磁力板分离器上固定30秒，并吸取磁力固定后微球的上清液，操作如前所示。从磁力架上取下微量滴定板，向每孔加入50微升10毫摩尔的PBS。然后，向含有NeutrAvidin偶联微球的相应孔中加入100微升生物素化的ACE2和生物素工作溶液。密封微孔板，并在轨道摇床上孵育一小时，孵育条件如前所述。洗涤微球后，保存ACE2和生物素偶联的微球。首先，将酪蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白与 pH7 的溶液混合，以制备测定缓冲液。接着，用测定缓冲液配制 10% 兔免疫球蛋白 G，作为样品稀释缓冲液。根据检测需要，准备适量的工作磁珠混合液。然后，在 4 摄氏度条件下将制备好的 SARS-CoV-2 和对照上清液解冻一小时。为 SARS-CoV-2 和对照上清液分别标记并准备八个 1.5 毫升微量离心管。为制备每种上清液的最高稀释度，将 600 微升上清液加入相应标记的试管中，并与样品稀释缓冲液混合。轻轻涡旋混匀试管。依次将400微升1:1稀释的上清液转移至下一个稀释管中。每次进行后续稀释前，需先轻轻涡旋混匀各稀释后的上清液。然后，取预先配制的工作磁珠混合液，涡旋振荡30秒后，向384孔平底微孔板的每个指定孔中加入5 µL。再向384孔板中含微球的指定孔中加入45 µL已配制的上清液稀释液。密封微孔板，并在室温避光条件下，于650 RPM的摇床上孵育过夜。从摇床取下微孔板后，在931 G下离心1分钟，然后移除板封膜。为固定磁珠，将微孔板置于磁板分离器上静置30秒。保持微孔板仍在磁力分离器上的状态下，吸除磁珠固定的上清液。将微孔板从磁力分离器上取下后，向每孔含磁珠的孔中加入60 µL PBST。接下来，取五个1.5毫升离心管以配制不同的检测混合液。向每根离心管中加入人源单克隆抗S1抗体以及靶向SARS-CoV-2颗粒刺突蛋白的flag标签单链可变区片段。将每种特异性的单链可变区片段刺突蛋白检测混合液各50 µL加入已洗涤的微球中，每孔加入50 µL。密封微孔板并按照之前所示条件孵育。然后将微孔板离心。用60 µL PBST洗涤珠子三次，以去除多余的 spiked 检测试剂。接下来，配制含有PE标记的抗人免疫球蛋白G以及BV421（Brilliant Violet 421）标记的抗FLAG抗体的荧光溶液。将50微升荧光溶液加入已洗涤的微球中，每孔加入适量混合液，并按照之前所示条件进行孵育。然后，离心微孔板。用 60 微升 PBST 洗去微球上多余的荧光溶液混合物。将微球重悬于上一步洗涤所得的 60 微升 PBST 中。然后使用设定好的参数，在双报告基因流式分析系统上分析该样品板。在SARS-CoV-2感染细胞上清液的稀释样本中，两个报告通道均观察到浓度依赖性信号。五种单链可变区片段中有三种可在低至1:18的稀释度下检测到病毒。对于其余两种单链可变区片段，病毒在低至1:6的稀释度下仍可被检测到。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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