Name: 从造血器官中分离基质细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学习从鼠类骨髓、胸腺及人类胸腺组织中分离基质细胞的方法，用于单细胞多组学分析。该方案支持造血功能研究，助力识别异质性基质细胞群体并推动血液学治疗创新。

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我们得到了马萨诸塞州总医院HSCI-CRM流式细胞术实验室和哈佛大学Bauer核心实验室提供的专业技术支持。T.K. 和 K.G. 得到了瑞典研究理事会的资助，C.M. 得到了德国研究基金会的资助。我们感谢Sergey Isaev和I-Hsiu Lee在单细胞RNA测序数据分析方面提供的帮助。

所有涉及人体组织的工作均在获得麻省总医院机构审查委员会（IRB）批准后进行。所有动物实验均按照麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。本研究使用了8至10周龄的C57Bl/6小鼠，包括雄性和雌性。实验动物来自商业来源（见材料表）。
1. 小鼠胸腺组织的制备
<ol>
	<li>准备以下缓冲液和溶液。
	<ol>
		<li>含 2% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 的 Medium 199 (M199)（参见材料表）。</li>
		<li>小鼠组织解离混合液：在 M199 + 2% FBS 中加入 0.5 WU/mL Liberase TM 和 6.3 U/mL DNase I（参见材料表）。</li>
		<li>含 2% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 的 M199。 
		注意：为提高 RNA 质量，可将含 FBS 的培养基替换为含 BSA 的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠胸腺解剖
	<ol>
		<li>按照机构批准的规程，通过 CO2 窒息法处死小鼠，并将其仰卧放置。用 70% 乙醇喷洒胸部毛发使其湿润，然后打开胸腔。</li>
		<li>使用手术剪在肋骨下方做一横向切口，小心地解剖胸腺。沿小鼠两侧肋骨剪至锁骨处，然后剪断膈肌，使胸壁松开。用镊子抬起肋骨以暴露胸腔。
		<ol>
			<li>胸腺为位于胸腔顶部、心脏上方的白色双叶状器官。用镊子夹住胸腺，轻轻剪断固定胸腺的结缔组织。将解剖得到的胸腺组织放入盛有冰上预冷的 M199 + 2% FBS 的 6 孔板孔中。 
			注意：当处理老龄鼠、经辐射处理的小鼠或具有胸腺缺陷的突变品系时，胸腺可能非常小，需使用解剖显微镜才能可靠地切除该器官。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用钝头镊子和微型弹簧剪去除所有非胸腺组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠胸腺组织的酶解解离（每 10 分钟一次，共 30 分钟）
	<ol>
		<li>将清洗后的胸腺置于 15 mL 离心管盖中，用无菌手术剪将其充分剪碎。 
		注意：在即将用于消化反应的离心管盖中进行组织剪碎，可最大限度减少因转移组织导致的损失。这一点在处理老龄鼠、经辐射处理的小鼠或具有胸腺缺陷的突变品系时尤为重要。在这些情况下，胸腺体积较小，必须尽可能减少材料损失。</li>
		<li>向 15 mL 离心管中加入 2 mL 小鼠组织解离混合液，将装有胸腺碎片的管盖拧紧，倒置混匀 5 次，确保组织充分重悬于解离液中。</li>
		<li>为防止泄漏，用石蜡膜包裹管盖，然后将离心管水平置于 37 °C 水浴中，以 250 rpm 振荡，孵育 10 分钟。 
		注意：消化步骤的成功依赖于在 37 °C 条件下并伴随振荡进行孵育。本方案已使用振荡水浴优化。若无此设备，其他可在加热条件下实现振荡的方法也可能适用，但我们建议先针对具体条件优化该方案。</li>
		<li>将 15 mL 离心管放入试管架中，静置使组织碎片沉降。小心吸出上清液，并通过 70 µm 细胞筛滤入预冷的 50 mL 离心管中。</li>
		<li>重复步骤 2–4 两次，共完成 3 轮消化。最后一次孵育结束时，组织应基本完全解离。</li>
		<li>向收集的细胞悬液中加入 20 mL M199 + 2% FBS，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用适量体积的 M199 + 2% FBS 重悬细胞，随后进行细胞计数。 
		注意：重悬所用 M199 + 2% FBS 的体积取决于胸腺状态。对于 6–10 周龄的小鼠，建议使用 3–4 mL M199 + 2% FBS 重悬组织；而对于使用老龄鼠、经辐射处理的组织或具有胸腺缺陷的突变品系的实验，因胸腺体积较小，所需体积应为 0.1–1 mL。</li>
		<li>将细胞悬液用 0.4% (w/v) 台盼蓝溶液按 1:2 比例稀释，取样加入血细胞计数板，在明场显微镜下计数。统计未染色细胞以确定每毫升活细胞数量，并统计蓝色染色细胞以评估样品活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠胸腺基质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
	<ol>
		<li>于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟收集细胞。将细胞重悬于含 25 U/mL Protector RNase 抑制剂（参见材料表）的 M199 + 2% FBS 中，调整细胞浓度至 5 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>加入小鼠 Fc 封闭抗体（参见材料表），终浓度为 2 µg/mL，于 4 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>于 4 °C 用以下抗体标记细胞 30 分钟：CD45-PE/Cy7（4 µg/mL）、Ter119-PE（4 µg/mL）、CD31-BUV737（2 µg/mL）和 EpCam-BV711（2 µg/mL）（参见材料表）。</li>
		<li>用 M199 + 2% BSA 洗涤样品，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于含活力染料（如 DAPI，0.5 µg/mL 或 7-AAD，1 µg/mL）（参见材料表）的 M199 + 2% BSA 中。随后按照既定方案进行胸腺基质细胞的 FACS 分离19。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人胸腺组织的制备
<ol>
	<li>准备以下缓冲液和溶液。
	<ol>
		<li>含 2% (v/v) FBS 的 Medium 199 (M199)。</li>
		<li>含 1.5% (w/v) BSA 的 M199。</li>
		<li>人组织解离混合液：在 M199 + 1.5% BSA 中加入 1 mg/mL Collagenase IV、2 mg/mL Dispase 和 6.3 U/mL DNase I（参见材料表）。 
		注意：人胸腺组织制备过程中的最后一步消化包含胰蛋白酶（trypsin）。因此，在此之前的所有操作步骤必须使用含 BSA 的缓冲液进行，因为 FBS 会抑制胰蛋白酶的活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行人胸腺组织的分离
	<ol>
		<li>将人胸腺组织（按照先前已发表的方法19获取）置于适量 M199 + 1.5% BSA 中，并在冰上保存直至开始处理。</li>
		<li>操作人胸腺组织时，应视其具有潜在感染性，所有操作均需在组织培养生物安全柜中进行，并遵循美国疾病控制与预防中心（CDC）指南中的标准防护措施20。</li>
		<li>将组织放入盛有 10 mL 冰冷 M199 + 1.5% BSA 的 10 cm 培养皿中。使用无菌镊子和剪刀，小心去除在器官摘取过程中受损的胸腺外脂肪或其他组织。</li>
		<li>使用手术剪和镊子将胸腺剪切成约 1 cm3 的小块，然后用 10 mL 注射器的活塞轻轻按压组织块，以释放部分正在发育的胸腺细胞，从而减少待消化的组织体积。 
		注意：若需后续分析胸腺细胞的发育阶段，请保存释放出的造血细胞组分。但切勿将此组分与酶解过程中产生的基质细胞组分混合。观察发现，合并这两部分会显著增加细胞悬液中堵塞的风险，最终降低基质细胞的得率。在轻柔压碎组织的过程中，仅有极少量基质细胞损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行人胸腺组织的酶解分离（共 90 分钟，分 30 分钟为一轮）
	<ol>
		<li>将约 5 mg 经轻微压碎的胸腺组织碎片转移至 50 mL 锥形管的管盖中，然后使用无菌手术剪将组织进一步剪碎。</li>
		<li>向 50 mL 锥形管中加入 8 mL 人组织解离混合液，将装有剪碎人胸腺组织的管盖盖上，轻轻倒置混匀 5 次，确保所有组织均与酶混合液充分接触。</li>
		<li>用石蜡膜密封管盖以防止泄漏，将锥形管水平置于 37 °C、振荡（250 rpm）的水浴中孵育 30 分钟。</li>
		<li>将 50 mL 锥形管置于试管架中，静置使人胸腺组织碎片沉降，然后小心移除上清液，并通过 70 µm 细胞滤筛转移至另一个置于冰上的新 50 mL 管中。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2–2.3.4，共进行两轮人组织解离混合液的消化。</li>
		<li>第二轮消化完成后，向剩余组织中再加入 8 mL 人组织解离混合液，并同时向组织解离管中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下继续孵育 30 分钟。 
		注意：人组织的消化时间必须至少达到 90 分钟，因为更短的孵育时间会导致基质细胞得率显著降低。</li>
		<li>最后一次孵育结束后，将细胞悬液和残留的组织碎片与此前收集的上清液合并，通过 70 µm 细胞滤筛过滤。向样品中加入 3 mL FBS 以终止胰蛋白酶反应，并将样品置于冰上。</li>
		<li>按照步骤 1.3 所述方法进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行人胸腺基质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
	<ol>
		<li>将人胸腺细胞悬液离心沉淀，重悬于含 25 U/mL Protector RNase 抑制剂的 M199 + 2% FBS 中，调整细胞浓度至 5 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，加入人 Fc 封闭剂（5 µg/mL）（参见材料表），孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，用以下抗体对样品染色 30 分钟：CD45-BV711（2.5 µg/mL）、CD235a-BV711（2.5 µg/mL）、Lineage-cocktail-FITC（3.76 µg/mL）、CD66b-FITC（20 µL/100 µL 样品）、CD8-APC/Cy7（5 µL/100 µL 样品）、CD4-BV605（5 µL/100 µL 样品）、CD31-PE/Dazzle594（10 µg/mL）和 EpCam-BV421（2.5 µg/mL）（参见材料表）。</li>
		<li>用 M199 + 1.5% BSA 洗涤样品，并在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于含活率染料（如 DAPI，0.5 µg/mL 或 7-AAD，1 µg/mL）的 M199 + 1.5% BSA 中。随后按照既定方案19进行胸腺基质细胞的 FACS 分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠骨组织和骨髓组织的制备
注意：为了获得最高纯度的基质细胞并实现组织的最佳解离，骨组织和骨髓组分需分别进行两次独立的消化反应。在消化步骤完成后，可将样品合并，作为单一的基质细胞组分进行分选。
<ol>
	<li>准备以下缓冲液和溶液。
	<ol>
		<li>含 2% (v/v) 胎牛血清（FBS）的 M199 培养基。</li>
		<li>小鼠骨与骨髓（B&amp;M）解离混合液：在 M199 + 2% FBS 中加入 Stemxyme（2 mg/mL）、Dispase（1 mg/mL）和 DNase I（10 U/mL）（参见材料表）。 
		注意：B&amp;M 解离混合液需新鲜配制，并在使用前置于冰上保存。</li>
		<li>含 0.5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的 M199 培养基。</li>
		<li>含 0.5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
		<li>含 2% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 的 M199 培养基。 
		注意：为提高 RNA 质量，可将含 FBS 的培养基替换为含 BSA 的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠骨髓分离
	<ol>
		<li>按照机构批准的程序，通过 CO2 窒息法处死小鼠，并用 70% 乙醇喷洒以润湿毛发。</li>
		<li>小心取出双侧股骨、胫骨、骨盆和肱骨，放入盛有 M199 + 2% FBS 的培养皿中，并置于冰上21,22。</li>
		<li>用组织擦拭纸去除所有肌肉、韧带和软骨组织，以尽量减少对骨骼的损伤并保留骨膜层。将骨骼转移至另一新培养皿中，加入 M199 + 2% FBS 并置于冰上。</li>
		<li>使用解剖刀切开长骨的生长板，去除骨骺，并将其放入盛有 M199 + 2% FBS 的 10 cm 培养皿中，置于冰上。</li>
		<li>用 28 G 针头和装有 10 mL M199 + 2% FBS 的 10 mL 注射器冲洗骨髓，直至骨骼呈淡白色。将冲洗液收集至置于冰上的 15 mL 离心管中。将冲洗后的骨骼放入含骨骺的 10 cm 培养皿中。 
		注意：彻底冲洗骨髓以实现组织的完全分离，有助于获得更高质量的样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠骨髓组织的酶解解离（总共 30 分钟，分三次，每次 10 分钟）
	<ol>
		<li>将 15 mL 离心管直立放置于冰上，待骨髓沉降至管底后，缓慢用移液器吸除 10 mL M199 + 2% FBS。</li>
		<li>向 15 mL 管中加入 4 mL B&amp;M 解离混合液，置于 37 °C 水浴中（不振荡）孵育 10 分钟。</li>
		<li>5 分钟后，将管子轻轻倒置混匀三次，再放回水浴中。</li>
		<li>第一个 10 分钟结束后，确认细胞沉淀位于管底，将上清液通过 70 µm 细胞筛过滤，收集至预冷的 50 mL 管中。向剩余的骨髓沉淀中加入 2 mL 新鲜 B&amp;M 解离混合液，重新放回水浴中。</li>
		<li>使用 1 mL 移液器剧烈吹打，解离任何残留的骨髓组织碎片。将所得细胞悬液全部收集至与前一步相同的离心管中。向收集的细胞悬液中加入 20 mL M199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTA。 
		注意：在步骤 3.3.5 中，最终消化样本后加入的缓冲液含有 EDTA，有助于抑制进一步的酶活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠骨髓组织中造血细胞的去除。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟。弃上清后，用含生物素标记抗体（5 mg/mL）的 500 µL PBS + 0.5% BSA 重悬细胞，抗体靶向 CD45、Ter119、CD11b、Gr1、B220 和 CD3（参见材料表）。转移至带盖的圆底离心管中。</li>
		<li>在室温避光条件下，于旋转摇床上孵育 10 分钟。</li>
		<li>充分涡旋磁珠，向管中加入 25 µL 磁珠。</li>
		<li>在室温避光条件下，于旋转摇床上孵育 5 分钟。</li>
		<li>将离心管置于配套磁架上 2–3 分钟，收集上清液至新离心管中。 
		注意：此步骤后，骨髓可与骨组织部分合并或分别保存。若谱系清除成功，所得细胞悬液中应无红细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠骨组织的酶解解离。
	<ol>
		<li>在 10 cm 培养皿中，用 50 mL 离心管的平头盖将骨骼压碎成更小的碎片。将上清液通过 70 µm 细胞筛过滤，以分离筛内残留的骨碎片。 
		注意：也可使用研钵和研杵进行骨组织破碎。但此方法通常会产生更多碎片，且当骨骼被研磨而非压碎时，基质细胞的存活率较低。基质细胞仍附着于骨组织中，而含造血细胞的上清液应被弃去。</li>
		<li>使用剪刀剪碎细胞筛中的骨碎片，以增加表面积，提高酶解效率。用 5 mL M199 + 2% FBS 洗涤骨组织。</li>
		<li>将骨组织部分转移至新 50 mL 离心管中，加入 5 mL 小鼠 B&amp;M 解离混合液（参见材料表）。</li>
		<li>为防止泄漏，用石蜡膜包裹管盖。然后将离心管水平置于 37 °C 水浴中，以 120 rpm 振荡 30 分钟。</li>
		<li>消化完成后，加入 25 mL M199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTA，将含基质细胞的上清液通过 70 µm 细胞筛过滤至预冷的 50 mL 离心管中。 
		注意：应观察确认消化后骨碎片明显减少。在步骤 3.5.5 中，最终消化样本后加入的缓冲液含有 EDTA，有助于抑制进一步的酶活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小鼠骨与骨髓基质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>用含 10 µg/mL 小鼠 Fc 封闭剂的 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA 重悬细胞，在 4 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>对细胞进行染色（最多 1000 万个细胞/100 µL 总染色体积），使用以下抗体：CD45-PE/Cy7（1 µg/mL）、Ter119-PE/Cy7（1 µg/mL）、CD31-BV421（0.66 µg/mL）、CD140a-APC（2 µg/mL）、Sca1-AF700（0.66 µg/mL）、CD51-PE（2 µg/mL）、CD105-PE/dazzle（2 µg/mL）（参见材料表）。</li>
		<li>将 Calcein-AM 平衡至室温，用 50 µL DMSO 重悬。每次使用前新鲜配制，重悬后置于室温保存。在加入已用抗体染色混合液重悬的样本前，先用 PBS 将 Calcein 预稀释至 0.1 mg/mL，然后按 20 µg/mL 加入样本中，避光于 4 °C 孵育 20–30 分钟。</li>
		<li>用 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA 洗涤样本，在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃上清，用 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA 重悬细胞。按照既定方案进行骨与骨髓基质细胞的 FACS 分离19。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimizing Stromal Cell Isolation from Thymus and Bone Marrow

<ol><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li>
<li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li>
<li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830(2023).</li>
<li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li>
<li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li>
<li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+human+thymus+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Pathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li>
<li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li>
<li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li>
<li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951(2013).</li>
<li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li>
<li>Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html">Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html</a> (2023).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936(2016).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

D.T.S. 是 Agios Therapeutics 和 Editas Medicines 的董事兼股东；是 Magenta Therapeutics 和 LifeVault Bio 的创始人、董事、股东及科学顾问委员会成员；是 Fate Therapeutics 和 Garuda Therapeutics 的股东及创始人；是 Clear Creek Bio 的董事、创始人及股东；并担任 FOG Pharma、Inzen Therapeutics 和 VCanBio 的顾问，同时获得住友迪艾普制药（Sumitomo Dainippon）的资助研究经费。D.T.S. 和 K.G. 是专利 US20220143099A1 的发明人。

造血器官中的基质细胞对正常的血液生成至关重要，而造血基质的紊乱可能导致造血功能维持及应激反应出现严重障碍9,23,24。深入了解造血基质细胞对于认识血液系统疾病7,9,10,24以及开发治疗这些疾病的疗法25,26具有重要意义。然而，可重复地将造血基质与实质组织分离仍是一项挑战，尤其是在单细胞多组学技术发展的背景下，该技术要求高质量的样本制备，同时最大化基质细胞的得率和多样性。本文所述方案已优化，可兼容大多数下游多组学应用，并能有效应对造血基质细胞分离中的各项挑战1,2,19。
分离造血基质细胞时需要考虑的首要问题是解离条件。最佳的组织解离对于将基质细胞从组织中充分释放、以真实反映基质区室的全部异质性至关重要1,2。选择合适的解离酶组合取决于实验目的及后续的实验流程。我们建议尽可能新鲜配制解离酶混合液，并在使用前始终置于冰上。某些组分（如中性蛋白酶 dispase）较难溶解，可能需要更长时间的移液混匀&#160;。不推荐使用涡旋振荡，因为这可能会破坏消化酶的天然构象，最终导致其失活。值得注意的是，EDTA 会抑制酶的活性，因此在主动消化过程中应避免使用，但若含酶缓冲液无法及时去除，可用 EDTA 终止反应。除了酶混合物本身外，还有两个因素对组织高效解离至关重要：（1）充分剪碎和切割组织以增加表面积；（2）使用消化酶进行足够长时间的孵育。例如，人胸腺组织的解离难度显著高于小鼠组织，因此需要更长的消化时间。若未对人组织进行相应调整，将导致基质细胞的得率和细胞种类减少（图 2A）。解离酶的最佳作用温度为 37 °C，而这一温度不可避免地会影响基因表达27。尽管在低温或更低温度下进行解离有助于维持细胞状态，但目前尚无适用于骨组织和骨髓组织的商业化低温活性解离酶组合。对于任何需要消化处理的组织，不同细胞类型的异质性及其所占比例将不可避免地随消化时间、酶混合物的组成和处理方式而变化。在这些初始步骤之后，异质性和细胞代表性还会进一步受到过滤步骤的限制，例如分选时喷嘴的尺寸、难以捕获的细胞类型（如基质中的脂肪细胞）以及微流控装置中通道的直径。因此，在比较不同数据集时，应意识到这些实验方案的差异可能影响亚群的代表性。由此可以推断，在评估对基质系统施加扰动的影响时，必须严格保持处理步骤的一致性。
尽管测序成本已持续降低，单细胞技术通常仍受限于可分析的细胞数量。为最大限度地利用每种试剂盒的容量，在可能的情况下均采用了造血细胞磁性耗竭法。该方法可避免在骨髓和胸腺样本组分中大量存在的非目标细胞污染，因为这些污染细胞的数量远多于基质细胞。然而，若起始材料有限（例如移植后胸腺组织），磁性耗竭策略不可避免地导致细胞非特异性丢失增加，此时该方法可能并不适用。此外，在组织制备与消化过程中，机械碾压、切割以及酶解细胞外基质成分会产生大量碎片。此类污染物若保留在样本中用于分析，可能导致后续处理过程中的堵塞问题、单细胞索引分选时出现大量阴性孔，以及在数据分析中显著抬高父代门控（parent gate）的百分比。采用钙黄绿素（Calcein）染色用于门控识别细胞/活细胞。钙黄绿素有多种颜色，可高度适配不同的染色组合。使用钙黄绿素时，应注意避免反复冻融（即：始终现配现用，溶解后于室温保存）。
利用带有DNA寡核苷酸条形码的抗体对样本进行多重检测的能力28，可显著提升在10x Genomics等平台上的单细胞测序反应的使用效率。用于样本多重检测的标签抗体（hashtagging antibodies）针对不同的细胞表面分子或核膜靶点设计，并对小鼠和人类样本均具有特异性。尽管细胞标签系统已成功应用于多种组织，但在实验中若联合使用消化酶混合物与后续的标签标记步骤，可能导致细胞回收率显著降低。我们曾尝试在解离后增加额外的洗涤步骤，并添加EDTA以抑制&#160;消化酶的活性。然而，即使采取了这些措施，预期的标签识别率仍低于造血细胞。研究发现，在采用酶消化方案时，标签捕获率仅为30%–70%。值得注意的是，同一抗体克隆若以荧光素偶联形式使用，则可在相同细胞群中标记&#62;90%的基质细胞。因此，任何将组织酶消化与标签标记相结合的实验设计均应预先开展预实验，并需谨慎确保充分抑制酶活性。

在健康成人中，血细胞的从头生成发生于骨髓和胸腺。这些部位的基质细胞对维持造血功能至关重要，但基质成分仅占组织的不到1%1,2,3,4。因此，获得支持造血功能的基质细胞的纯化分离物构成了重大挑战，特别是对于需要快速处理以获取高质量样本的单细胞多组学研究而言尤为如此。不同消化液组分可能干扰多组学分析中的某些步骤5,6。本文所述方案详细介绍了从骨髓和胸腺组织中分离多种类型基质细胞的方法。
骨髓和胸腺中基质成分的扰动会严重破坏血细胞发育，并可能导致恶性肿瘤7,8,9。造血支持性基质在细胞毒性预处理及骨髓移植后会受到损伤，导致维持造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的细胞因子和生长因子分泌减少2,10,11。此外，衰老会影响骨髓和胸腺的基质细胞，可能促进衰老相关的造血表型。胸腺是最早发生显著年龄相关性退变的器官。早在青春期开始时，脂肪组织和纤维化组织便开始取代支持T细胞发育的基质12,13。在骨髓中，随着年龄增长，脂肪细胞含量增加，血管壁龛和骨内膜壁龛也发生显著重塑14,15,16。
为了研究多种应激状态下支持造血功能的基质，以及人和小鼠胸腺组织中的此类基质，我们优化了先前发表的消化方案1,2,8,17,18。这些方案可高效且可重复地分离细胞，并适用于单细胞RNA测序（scRNAseq）及其他多组学分析技术。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD（7-氨基放线菌素 D）</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>抗人谱系抗体混合物 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 小鼠</td><td>Jackson</td><td>664</td><td>雄性或雌性，8–12 周龄</td></tr><tr><td>Calcein&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Corning 无菌细胞筛，白色，孔径：70 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90083</td><td>&amp;nbsp;2500 U/mL</td></tr><tr><td>Easysep 小鼠链霉亲和素 RapidSpheres 分离试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>合格一次性产品</td></tr><tr><td>人 Fc 封闭剂</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401127001</td><td>研究级</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD4-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase 抑制剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD105-PE /dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD11b-生物素</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD140a-APC</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭剂）</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD31-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD31-BV421</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD3-生物素</td><td>Biolegend</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45.2-生物素</td><td>Biolegend</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45R/B220-生物素</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD51-PE</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 EpCam-BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563134</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>Biolegend</td><td>108142</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-生物素</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ter119-生物素</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ter119-PE</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ter119-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>Stemxyme&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004107</td><td></td></tr></tbody></table>

造血器官中基质细胞的分离

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

单细胞测序技术使得研究人员能够绘制造血器官基质中异质性细胞群体的图谱。这些方法为研究稳态下尚未解析的细胞异质性，以及由外界应激或衰老过程所诱导的细胞类型组成变化提供了有力工具。本文提供了从小鼠和人胸腺，以及小鼠骨骼和骨髓中分离高质量基质细胞群体的分步实验方案。通过这些方案分离得到的细胞适用于生成高质量的单细胞多组学数据集。文中讨论了样本消化、造血谱系细胞耗竭、流式细胞术分析/分选等步骤的影响，以及这些因素如何影响与单细胞测序技术的兼容性。通过展示流式细胞术图谱示例，说明了有效与低效解离的效果，并结合测序后分析中下游基质细胞得率，为使用者提供了可识别的操作提示。充分考虑基质细胞的特定需求，对于获得高质量且可重复的实验结果至关重要，这将推动该领域的科学认知不断深入。

这些方案可从胸腺和骨髓中获得适用于流式细胞分析以及单细胞多组学（如单细胞RNA测序）的可重复的基质细胞类型。小鼠胸腺组织在应激因素（如骨髓移植前的细胞毒性预处理或自然衰老过程）下会发生显著重塑。因此，在上述两种情况下，胸腺细胞数量均显著减少（图1A）。一只8周龄野生型小鼠的胸腺约含有1亿个细胞，而2岁小鼠胸腺的细胞数量可能仅为前者的一半，骨髓移植后4天的胸腺细胞数甚至可低至500,000个（图1A）。
细胞毒性预处理将优先清除造血细胞，从而使基质细胞组分相对富集（图1B）。然而，由于总体细胞数量较低，分离获得足够数量的胸腺基质细胞仍具有挑战性。因此，可能需要合并多只动物以获取适用于下游多组学分析的细胞数量，并尽可能减少样本损失。为了对胸腺基质细胞进行多组学分析，需通过荧光激活细胞分选（FACS）分离活的、单个的、CD45-Ter119-细胞（图1C），以确保能够从大多数应激条件下分选出足够数量的细胞。
为了保持基质区室的异质性，我们通常不会根据单一的阳性基质标记物进行分选，而是排除造血细胞。尽管如此，仍建议在分析中包含阳性基质细胞标记物，以确保已实现适当的组织解离。然而，FACS 分选并不完美，根据单细胞 RNA 测序（scRNAseq）结果，分选出的细胞中有 30%–50% 来源于造血细胞（图 1D、E）。在 FACS 前通过磁性去除 CD45+ 细胞可改善这一情况；但对于胸腺细胞数量减少的条件（图 1A），不建议采用此方法，因为磁性去除过程中额外的操作步骤会导致样本损失，从而使基质细胞得率过低，无法满足后续实验应用的需求。
在分离人胸腺基质细胞时，最关键的步骤是酶消化。如果解离步骤进行得过快，总体的基质细胞得率以及各类基质细胞亚群的比例将显著降低（图2A）。建议始终包含胸腺内皮和上皮细胞的标记物，以确保组织消化充分；因为仅通过排除造血细胞标记物并不能准确评估基质细胞的实际释放情况。这一点在图2A中得到例证：与消化90分钟的样本相比，消化30分钟样本中造血标记物阴性细胞的比例更高。然而，如后续设门分析所示，较短的消化方案所获得的内皮细胞和上皮细胞得率非常低（图2A）。
为进行人类胸腺基质细胞的FACS分离以用于多组学研究，建议使用造血谱系抗体混合物以及CD4和CD8抗体，同时结合泛造血细胞标记CD45和红系标记CD235a（图2B），以提高基质细胞的富集效果。因此，针对人类胸腺基质的多组学分析，应通过FACS分选活的、单个的、CD45-CD235a-谱系-CD4-CD8-细胞（图2B）。与小鼠样本的单细胞RNA测序结果类似，该策略仍可能导致30%–50%的造血细胞污染，但已足以实现对人类胸腺基质区室的可接受分辨率（图2C、D）。
对于骨组织和骨髓基质，采用与胸腺组织相同的方法；通过圈选造血标志物阴性的细胞来分离基质细胞，并加入进一步的基质细胞标志物作为消化过程的对照（图3）。钙化组织（如骨组织）的解离会导致大量碎片产生。加入钙黄绿素（calcein）作为活细胞染料，可排除大部分此类碎片，否则这些碎片会虚假地增加分选细胞数量并降低目标细胞群的比例（图3）。在比较对所有细胞进行圈选与仅对钙黄绿素阳性（Calcein+）细胞进行圈选的流式图中，这一点得到了明确体现（图3）。与人胸腺基质细胞类似，造血标志物阴性细胞的比例并不能可靠地反映骨组织和骨髓组织解离的效率（图3）。尽管在消化步骤失败的样本中，CD45-Ter119-门内可能含有大量细胞，但对典型的骨和骨髓基质细胞标志物CD31、CD140a和CD51的进一步分析清楚表明基质细胞释放效果不佳（图3 和 图4）。
对于小鼠骨组织及骨髓基质细胞的FACS分离，建议采用 图3 所示的设门策略，仅分选 CD45-Ter119-Calcein+ 细胞，同时监测分选细胞群的前向散射与侧向散射特性以及基质细胞标志物表达，以确保消化效果最佳（图3A）。在FACS分选前，先通过磁珠法去除骨髓中造血谱系阳性细胞，并结合所示设门策略，可获得>90%为基质细胞的单细胞测序样本。一次此类单细胞RNA测序结果（图5A、B）显示，在基于转录组的细胞注释后，分析细胞中的造血污染极低（造血标志基因示例见 图5C）。这与胸腺基质细胞制备形成鲜明对比：由于移植后胸腺组织起始材料有限，在分选前未进行磁珠法去除非目标细胞（图1F）。
<img alt="胸腺细胞数量及小鼠胸腺单细胞RNA测序；造血细胞和基质细胞的流式细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠胸腺基质细胞的流式细胞术与单细胞RNA测序分析。 （A）8周龄小鼠（对照组）、经致死剂量照射并在4天前接受移植的8周龄小鼠（移植组）以及2岁龄小鼠（老年组）中胸腺细胞数量的定量分析。（B）代表性流式细胞图显示，在致死剂量照射并移植后第4天，胸腺基质细胞亚群的富集情况。（C）用于分选小鼠胸腺基质细胞以进行单细胞多组学分析的流式细胞术设门策略。（D）显示小鼠胸腺组织中基质细胞（蓝色）和造血细胞（红色）的UMAP图。（E）显示小鼠胸腺样本中造血标志基因表达的UMAP图。（F）小鼠胸腺单细胞RNA测序样本中基质细胞与造血细胞的数量统计。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="人胸腺FACS数据、单细胞RNA测序UMAP图、样本分析的细胞类型标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：人胸腺基质细胞的流式细胞术与单细胞RNA测序分析。（A）FACS图显示不同消化时间对人胸腺基质细胞群体释放的影响的代表性结果。（B）用于分选人胸腺基质细胞以进行单细胞多组学分析的流式细胞术设门策略。（C）显示人胸腺中基质细胞（蓝色）和造血细胞（红色）的UMAP图。（D）显示人胸腺样本中造血标记基因表达的UMAP图。（E）人胸腺单细胞RNA测序样本中基质细胞与造血细胞的定量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析细胞标志物 CD45、Ter119、Calcein-FITC、CD140a、CD51、CD31 的流式细胞术散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠骨髓基质细胞标志物与Calcein有助于评估组织解离效率。（A）对所有细胞及Calcein+细胞设门后，CD45-Ter119-小鼠骨髓基质细胞的代表性流式细胞术分析结果。进一步对CD31-细胞设门后，选择Calcein+细胞时CD140a+CD51+细胞比例更高。（B）骨组织消化失败的代表性流式细胞术分析结果，显示缺失CD140a+CD51+细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析细胞解离的流式细胞术示意图；FSC、SSC 指标；多克隆鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：骨髓基质细胞的设门策略。（A）用于小鼠骨髓基质细胞单细胞多组学分析的流式细胞术设门策略。（B）骨髓消化失败的流式细胞术分析结果，显示缺失 CD140a+CD51+ 细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠骨组织和骨髓的单细胞RNA测序；基质细胞/造血细胞的UMAP图；样本组成图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：骨髓单细胞RNA测序及基质细胞与造血细胞组成分析。（A）小鼠骨组织和骨髓的UMAP图，显示基质细胞（蓝色）和造血细胞（红色）。（B）小鼠骨组织和骨髓样本中基质细胞与造血细胞的定量分析。（C）小鼠骨髓样本中造血标志基因的UMAP图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了可从鼠骨、骨髓、胸腺及人胸腺组织中分离基质细胞的实验方案，这些方案适用于单细胞多组学分析。

单细胞测序技术使得造血器官间质中异质性细胞群体的图谱绘制成为可能。这些方法提供了一种观察……

骨髓和胸腺中造血细胞的发育高度依赖于基质细胞的支持。造血基质细胞功能的紊乱可能导致造血效率低下，甚至引发恶性血液疾病。本实验室致力于研究基质细胞对造血过程的调控机制，以及如何通过干预该机制获得治疗性益处。单细胞测序技术的出现推动了众多研究领域的近期快速发展。在我们的研究领域亦是如此，单细胞分辨率使得人们能够鉴定出造血器官中此前未知的异质性基质细胞群体。我们的实验方案经过优化，旨在应对这一需求，我们希望这些方案能够促进更多针对基质细胞的研究，以解决该领域中的关键科学问题。首先，将已处死的小鼠置于手术台上，打开胸腔。使用手术剪在肋骨下方做一横向切口，并沿小鼠两侧肋骨剪至锁骨处。随后剪开膈肌以松解胸壁，用镊子提起肋骨，暴露胸腔。用镊子夹住胸腺，轻轻剪断固定胸腺的结缔组织。为了进行小鼠胸腺组织的酶解离，将清洁后的胸腺放入一个15毫升的离心管盖中，并使用无菌手术剪将组织彻底剪碎。向管中加入2毫升小鼠组织解离试剂盒中的消化液。将含有胸腺组织块的管盖盖上，倒置离心管5次以重悬组织。用石蜡膜包裹管盖。孵育结束后，将离心管放入试管架中，静置使组织沉淀。弃去上清液，并通过70微米细胞滤网将其转移至一个50毫升预冷的离心管中。然后向细胞悬液中加入20毫升含2% FBS的M199培养基。在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于 M199 加 2% FBS 的培养基中。首先，取自小鼠分离的股骨、胫骨、骨盆和肱骨。用手术刀切开长骨的生长板，去除骨骺。将其置于含有M199培养基加2%FBS的10厘米培养皿中，冰上放置。接着，使用28号针头和装有M199培养基加2%FBS的10毫升注射器，将骨髓冲洗至冰上的15毫升离心管中。将冲洗后的骨骼放入培养皿中，与骨骺一同放置。将15毫升离心管直立置于冰上，直至骨髓沉淀。然后移除M199培养基（含2% FBS）。向15毫升离心管中加入4毫升B和M解离试剂，于37°C水浴中孵育。孵育后，收集上清液，并通过70 µm细胞滤筛过滤至预冷的50 mL离心管中。向剩余的骨髓沉淀中加入2 mL新鲜的B和M解离混合液，然后放回水浴中。使用1 mL移液器剧烈吹打残留的骨髓组织块。将所有细胞悬液收集到之前使用的同一管中。向细胞悬液中加入20毫升含0.5% BSA和2毫摩尔EDTA的M199培养基。随后，在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。将沉淀重悬于500微升含0.5% BSA和生物素抗体的PBS中。在室温避光条件下，于摇床孵育10分钟。接着，充分涡旋振荡磁珠。向管中加入 25 µL 磁珠，并再次在旋转摇床上孵育。将管子置于配套磁铁上静置 2 至 3 分钟，收集上清液至新管中。使用 50 mL 管的平头盖端在 10 cm 培养皿中将骨骼打断成更小的碎片。通过70微米细胞筛过滤上清液，以分离骨碎片。用剪刀在细胞筛中将骨碎片剪碎。将带有骨碎片的滤膜置于50毫升离心管上，并用手术刀打开滤膜。用镊子将骨组织组分转移至5毫升小鼠B和M解离混合液中。然后将试管水平置于37摄氏度水浴中，以120转/分钟振荡30分钟。消化完成后，加入25毫升含0.5% BSA和2毫摩尔EDTA的M199培养基。将含有基质细胞的上清液通过70微米细胞滤网过滤至预冷的50毫升离心管中。

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从造血器官中分离基质细胞

造血干细胞（HSCs）的分离与移植

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

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本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

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小鼠骨髓基质细胞与破骨细胞前体的分离、培养及分化

本方案介绍了一种安全且高效的CD133+造血干细胞修饰方法。所展示的非病毒性、基于磁性多聚复合物（polyplex）的技术，可为优化治疗性干细胞效应以及通过磁共振成像监测所给予的细胞产品提供基础。...

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我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。...

长期与短期造血干细胞的分离方法

体内骨类器官法用于获取治疗性造血干细胞/祖细胞

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。...

从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

学习从鼠类骨髓、胸腺及人类胸腺组织中分离基质细胞的方法，用于单细胞多组学分析。该方案支持造血功能研究，助力识别异质性基质细胞群体并推动血液学治疗创新。

造血器官中基质细胞的分离

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