造血器官中基质细胞的分离

骨髓和胸腺中造血细胞的发育高度依赖于基质细胞的支持。造血基质细胞功能的紊乱可能导致造血效率低下，甚至引发恶性血液疾病。本实验室致力于研究基质细胞对造血过程的调控机制，以及如何通过干预该机制获得治疗性益处。

单细胞测序技术的出现推动了众多研究领域的近期快速发展。在我们的研究领域亦是如此，单细胞分辨率使得人们能够鉴定出造血器官中此前未知的异质性基质细胞群体。我们的实验方案经过优化，旨在应对这一需求，我们希望这些方案能够促进更多针对基质细胞的研究，以解决该领域中的关键科学问题。

首先，将已处死的小鼠置于手术台上，打开胸腔。使用手术剪在肋骨下方做一横向切口，并沿小鼠两侧肋骨剪至锁骨处。随后剪开膈肌以松解胸壁，用镊子提起肋骨，暴露胸腔。

用镊子夹住胸腺，轻轻剪断固定胸腺的结缔组织。为了进行小鼠胸腺组织的酶解离，将清洁后的胸腺放入一个15毫升的离心管盖中，并使用无菌手术剪将组织彻底剪碎。向管中加入2毫升小鼠组织解离试剂盒中的消化液。

将含有胸腺组织块的管盖盖上，倒置离心管5次以重悬组织。用石蜡膜包裹管盖。孵育结束后，将离心管放入试管架中，静置使组织沉淀。

弃去上清液，并通过70微米细胞滤网将其转移至一个50毫升预冷的离心管中。然后向细胞悬液中加入20毫升含2% FBS的M199培养基。在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。

弃去上清液后，将沉淀物重悬于 M199 加 2% FBS 的培养基中。首先，取自小鼠分离的股骨、胫骨、骨盆和肱骨。用手术刀切开长骨的生长板，去除骨骺。

将其置于含有M199培养基加2%FBS的10厘米培养皿中，冰上放置。接着，使用28号针头和装有M199培养基加2%FBS的10毫升注射器，将骨髓冲洗至冰上的15毫升离心管中。将冲洗后的骨骼放入培养皿中，与骨骺一同放置。

将15毫升离心管直立置于冰上，直至骨髓沉淀。然后移除M199培养基（含2% FBS）。向15毫升离心管中加入4毫升B和M解离试剂，于37°C水浴中孵育。

孵育后，收集上清液，并通过70 µm细胞滤筛过滤至预冷的50 mL离心管中。向剩余的骨髓沉淀中加入2 mL新鲜的B和M解离混合液，然后放回水浴中。使用1 mL移液器剧烈吹打残留的骨髓组织块。

将所有细胞悬液收集到之前使用的同一管中。向细胞悬液中加入20毫升含0.5% BSA和2毫摩尔EDTA的M199培养基。随后，在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。

将沉淀重悬于500微升含0.5% BSA和生物素抗体的PBS中。在室温避光条件下，于摇床孵育10分钟。接着，充分涡旋振荡磁珠。

向管中加入 25 µL 磁珠，并再次在旋转摇床上孵育。将管子置于配套磁铁上静置 2 至 3 分钟，收集上清液至新管中。使用 50 mL 管的平头盖端在 10 cm 培养皿中将骨骼打断成更小的碎片。

通过70微米细胞筛过滤上清液，以分离骨碎片。用剪刀在细胞筛中将骨碎片剪碎。将带有骨碎片的滤膜置于50毫升离心管上，并用手术刀打开滤膜。

用镊子将骨组织组分转移至5毫升小鼠B和M解离混合液中。然后将试管水平置于37摄氏度水浴中，以120转/分钟振荡30分钟。消化完成后，加入25毫升含0.5% BSA和2毫摩尔EDTA的M199培养基。

将含有基质细胞的上清液通过70微米细胞滤网过滤至预冷的50毫升离心管中。