Name: 移植到小鼠眼前房的肝球体的体内成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 了解小鼠眼前房肝球体移植的非侵入性活体成像技术。该方法利用共聚焦显微镜实现单细胞分辨率的长期纵向监测，为肝脏生理学和病理学研究提供高分辨率数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了瑞典糖尿病协会、卡罗林斯卡学院基金、瑞典研究理事会、诺和诺德基金会、Erling-Persson家族基金会、卡罗林斯卡学院糖尿病战略研究计划、Knut和Alice Wallenberg家族基金会、Jonas &amp;#38; Christina af Jochnick基金会、瑞典糖尿病学协会以及ERC-2018-AdG 834860-EYELETS项目的资助。图示由FL-B使用BioRender.com绘制。

所有动物实验均经卡罗林斯卡学院动物实验伦理委员会批准。
1. 小鼠原代肝细胞的提取及肝类球体的生成  体外
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>用于插管、肝脏切除和原代肝细胞分离，除移液管和离心管外，还需准备以下无菌或一次性材料（图1A）：蠕动泵、水平转子离心机、吸水垫、解剖垫、两把弯头镊子、手术剪、一支27 G蝶形针、一个70 µm细胞筛、一个细胞刮刀、一个100 mm培养皿、细胞计数板，以及96孔U型底微孔板。</li>
		<li>按照表1列出的成分配制用于肝脏灌注、原代肝细胞分离及肝类球体生成的溶液。 
		注意：消化缓冲液和梯度溶液应新鲜配制。</li>
		<li>设置灌注系统，包括一个蠕动泵，将42 °C水浴中的溶液输送至肝脏（图1A）。较高的水浴温度可确保缓冲液以37 °C的最佳温度到达肝脏。根据管路长度和室温（RT）调整该设置。</li>
		<li>进行插管时，将27 G蝶形针连接至管路末端。在最终分离步骤中使用的铺板培养基应保持在4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操作步骤
	<ol>
		<li>将以下溶液在42 °C水浴中预热至50 mL离心管中：40 mL PBS、20 mL灌注缓冲液和12 mL消化缓冲液。</li>
		<li>为清洗并预热泵管，循环约20 mL预热的PBS。</li>
		<li>更换为灌注缓冲液管路，排尽管内气泡并使蝶形针充满液体，设定流速为4 mL/min。在整个操作过程中更换缓冲液时，确保管路中无气泡。</li>
		<li>通过颈椎脱位法处死小鼠，并用针固定四肢于解剖板上。</li>
		<li>用70%乙醇润湿腹部毛发，切开皮肤以暴露消化器官。</li>
		<li>将肠道移向右侧，暴露门静脉和下腔静脉（图1B）。</li>
		<li>将蝶形针以水平位置插入下腔静脉约其中点处，确保其稳固，然后启动泵。</li>
		<li>当肝脏开始膨胀，或靠近的肝叶出现白色斑点时，剪开门静脉，使血液和灌注缓冲液流出。</li>
		<li>肝脏应立即开始变白。使用弯头镊子每隔5秒夹闭门静脉一次，以促进血液清除。</li>
		<li>重复步骤1.2.9，直至肝脏呈黄色且血液完全清除（约使用15–20 mL灌注缓冲液）。</li>
		<li>停止蠕动泵，更换为消化缓冲液管路后重新启动泵。当消化缓冲液到达肝脏时，将流速降至2.5 mL/min。 
		注意：消化缓冲液中的酚红可用来判断其是否已到达肝脏，从而在处理过程中调节泵的参数。</li>
		<li>为促进缓冲液到达所有肝叶并确保充分消化，重复步骤1.2.9数次。</li>
		<li>当消化缓冲液耗尽或肝脏外观显示已充分消化时，停止蠕动泵。 
		注意：可通过用镊子轻轻夹捏肝叶并观察组织是否出现轻微压痕来视觉评估消化程度。肝脏也会变得松软。</li>
		<li>为取出肝脏，剪断腹腔内的肝韧带及其他连接组织，尽量完整取出，并将其放入含有10 mL冷铺板培养基的培养皿中（表1）。</li>
		<li>去除胆囊后，用镊子在肝叶上轻轻夹捏，轻微撕裂肝包膜。轻轻摇晃培养皿中的肝脏，可观察到细胞释放到培养基中。</li>
		<li>用镊子固定肝脏，轻轻沿肝叶拖动细胞刮刀以释放细胞。 
		注意：正确的肝小叶间消化将产生细胞悬液，而非组织碎片。</li>
		<li>使用移液管从培养皿中收集细胞悬液，并通过置于50 mL离心管上的70 µm细胞筛过滤。用新鲜的铺板培养基冲洗培养皿中残留的消化肝细胞，并转移至滤器中。</li>
		<li>在4 °C下以50 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，保留约1 mL液体覆盖细胞沉淀，轻柔涡旋混匀以重悬细胞，然后逐步加入10 mL冷铺板培养基。</li>
		<li>向细胞悬液中加入10 mL梯度溶液，并轻轻倒置管子10次。</li>
		<li>在4 °C下以200 × g离心10分钟。</li>
		<li>沉淀物中含有活性较高的肝细胞（以肝细胞为主），而上清液中含有死细胞和碎片。用移液管弃去上清液，保留约1 mL，通过轻柔涡旋重悬沉淀。</li>
		<li>向细胞悬液中加入20 mL冷铺板培养基，在4 °C下以50 × g离心5分钟，以洗去梯度溶液。</li>
		<li>弃去上清液，保留约1 mL液体覆盖沉淀，将细胞重悬于20 mL冷铺板培养基中。 
		注意：此处细胞沉淀可能较紧密，必要时可用10 mL移液管轻轻吹打解离细胞。</li>
		<li>使用细胞计数板和台盼蓝染色手动测定细胞数量和活力。 
		注意：肝细胞在管中会迅速沉降；为重悬细胞，可轻柔倒置管子数次。</li>
		<li>将肝细胞以每孔200 µL铺板培养基、每孔1200个细胞的密度接种至96孔超低吸附培养板中。 
		注意：每孔最佳培养基体积为200 µL；但也可在每孔100 µL条件下接种。</li>
		<li>以200 × g离心3分钟，使细胞聚集于孔底中央。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育，静置5天使其自然形成类球体（图1C）。</li>
		<li>第5天时，小心吸出每孔一半的培养基，更换为无血清维持培养基（表1）。此后每48小时重复此操作，直至第10天，此时肝类球体已准备好用于移植。 
		注意：培养的肝类球体中形成类似包膜的结构，表明细胞聚集良好且具有较高活性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将肝类器官移植至眼前房（ACE）
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>将肝类器官移植到前房时，需准备好以下资源（图2A）：体视显微镜、异氟烷麻醉装置、诱导室、异氟烷、加热垫、定制金属底板、小鼠头部固定器和气体面罩、连接在刚性万向节上的镊子、Hamilton 500 µL螺纹活塞注射器、硅胶管、聚乙烯管和泵管、定制钝头玻璃导管或24 G导管、70%乙醇、无菌生理盐水、无菌23 G针头、眼膏（液体石蜡与凡士林按1:1比例混合）、一次性1 mL注射器，以及35 mm细胞悬液培养皿。</li>
		<li>使用70%乙醇和生理盐水清洗Hamilton注射器、管路和导管。</li>
		<li>用生理盐水填充Hamilton注射器、管路和玻璃导管，并用胶带将Hamilton注射器水平固定在实验台上（图2A）。</li>
		<li>使用定制的钝头玻璃导管。
		<ol>
			<li>使用双阶段微电极拉制仪拉长硼硅酸盐玻璃毛细管，使其内径&#62;300 µm，以便吸取类器官。</li>
			<li>使用微电极斜面仪对尖端进行斜切并钝化，并将导管尖端暴露于火焰数秒以软化边缘。 
			注：微电极斜面仪包含一个手动操作的旋转砂轮，因此无特定参数设置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>或者，可使用24 G导管的塑料部分制作导管（图2B）。</li>
		<li>准备好异氟烷麻醉装置，并将加热垫预热至37 °C。</li>
		<li>用一段聚乙烯管包裹连接在刚性万向节上的镊子尖端，形成环状结构，以帮助稳定眼球。</li>
		<li>使用移液器和200 µL吸头，将肝类器官从96孔板转移至含维持培养基的35 mm细胞悬液培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操作步骤
	<ol>
		<li>在诱导室内使用2.5%异氟烷和280 mL/min空气对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>当小鼠失去意识后，将麻醉浓度降低至1.8%异氟烷和280 mL/min空气，将麻醉管连接至头部固定器，并迅速将动物转移至加热垫上，使其鼻部置于头部固定器内。</li>
		<li>用螺钉固定头部，轻柔地将眼球推出眼窝，并用镊子夹住固定，同时在双眼表面滴加生理盐水以防止干燥。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用Hamilton注射器将肝类器官吸入并收集至导管尖端，并将其水平静置于清洁表面上。 
		注：吸取类器官时同时吸入培养基有助于防止类器官粘附于导管壁。</li>
		<li>使用23 G针头小心穿刺角膜，并用纸巾吸干渗出的房水。如需扩大切口，可小心地横向滑动针头以切割角膜。 
		注：角膜穿刺使用一次性无菌针头，因此切口前无需对角膜进行消毒。</li>
		<li>向眼球滴加生理盐水以避免干燥。</li>
		<li>取含有肝类器官的导管，将其垂直持握，使类器官在重力作用下移向导管尖端。</li>
		<li>将导管轻柔插入穿刺孔，使斜面朝向瞳孔方向，使用Hamilton注射器缓慢将肝类器官注入前房（图2C）。 
		注：建议在拔出导管前等待数秒，使眼内外液体压力重新平衡，以避免类器官反流脱出。</li>
		<li>从角膜外部，用导管尖端轻触角膜，将肝类器官推至瞳孔周围并远离切口位置（图2C）。</li>
		<li>等待约5–10分钟，待肝类器官沉降至虹膜表面后，再松开镊子释放眼球。</li>
		<li>在手术眼涂抹凡士林眼膏，有助于润滑并促进角膜愈合。</li>
		<li>如有需要，可采用相同方法对第二只眼进行手术。</li>
		<li>在小鼠苏醒前，给予镇痛药物以避免术后不适，例如皮下注射无菌生理盐水配制的0.1 mg/kg布托啡诺。 
		注：由于该操作时间极短（少于10分钟），仅引起轻微不适，且小鼠恢复迅速，未观察到疼痛或行为异常，因此仅给予一次镇痛剂量即可。除苏醒前给予的术后镇痛外，小鼠无需其他术后护理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在体 ACE中移植肝类球体的成像
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>准备以下材料和仪器用于非侵入性实验 体内 ACE中移植肝类器官的成像图3A：直立式共聚焦显微镜、长工作距离浸水物镜、异氟烷麻醉仪、诱导室、异氟烷、加热垫、定制金属底板、小鼠头部固定器和气体面罩、连接至固体万向节的镊子、人工泪液凝胶、眼膏（液体石蜡与凡士林按1:1比例混合）。</li>
		<li>可选材料包括可注射荧光探针、一次性注射器以及用于尾静脉注射的27 G针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验步骤
	<ol>
		<li>在诱导室中使用2.5%异氟烷和280 mL/min空气对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>当小鼠失去意识后，将麻醉气体浓度调至1.8%异氟烷和280 mL/min空气，将麻醉管连接至头部固定器，并迅速将动物转移至加热垫上，使其鼻部置于头部固定器内。</li>
		<li>使用螺钉将头部固定在头架中。</li>
		<li>在双眼上各滴一滴人工泪液凝胶，以防止干燥。</li>
		<li>此时，通过尾静脉静脉注射荧光探针，并立即进行成像。</li>
		<li>倾斜头部，轻轻将眼球推出眼窝，并用镊子夹住眼球，固定在物镜下方的适当位置。</li>
		<li>在角膜与物镜之间填充足量的人工泪液凝胶，通过目镜对肝脏类器官进行聚焦观察。 
		注意：如果可能，取下其中一个目镜的目镜，以获得非放大视野，从而更轻松地在虹膜上定位类球体。</li>
		<li>为了在动物呼吸运动存在的情况下获得高分辨率成像，应使用25倍物镜及以下成像参数：图像格式512 × 512像素，扫描速度600 Hz，Z轴层厚3 µm。详细成像参数见 表2. 
		注意：在整个成像过程中，通过调节异氟烷的麻醉浓度至1.6–2.2 mL/h，以达到浅麻醉状态并控制呼吸节律，从而最大限度地减少动物的移动。</li>
		<li>成像结束后，在移除异氟烷并唤醒动物之前，用凡士林眼膏处理已成像的眼睛。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Noninvasive Intraocular In Vivo Imaging of Engrafted Liver Spheroids in Mice

<ol><li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Sci Rep. 6, 25187(2016).</li>
<li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li>
<li>Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+cell+culture+model+identifies+Wnt%2Fbeta-catenin+mediated+inhibition+of+p53+as+a+critical+step+during+human+hepatocyte+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration.</a> Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248(2020).</li>
<li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964(2020).</li>
<li>Kozyra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+3D+spheroids+as+a+model+for+steatosis+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance.</a> Sci Rep. 8 (1), 14297(2018).</li>
<li>Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+primary+hepatocyte+culture+systems+for+analyses+of+liver+diseases%2C+drug+metabolism%2C+and+toxicity%3A+Emerging+culture+paradigms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications.</a> Biotechnol J. 14 (7), e1800347(2019).</li>
<li>Shibuya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+the+hepatocyte+spheroids+for+hepatocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation.</a> Cell Transplant. 30, 9636897211000014(2021).</li>
<li>Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+multicellular+spheroid+of+rat+hepatocytes+transplanted+intraperitoneally+after+90%25+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy.</a> Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li>
<li>Lazzeri-Barcelo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+liver+spheroids+for+noninvasive+high-resolution+in+vivo+monitoring+of+liver+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function.</a> Nat Commun. 15 (1), 767(2024).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+physiology%2Fpathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology.</a> Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Primary+Mouse+Hepatocyte+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation.</a> STAR protocols. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Baze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+primary+human+hepatocytes+in+monoculture+and+coculture+with+nonparenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells.</a> Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).</li>
<li>Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nonparenchymal+cells+from+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver.</a> Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).</li>
</ol>

P-OB 是 Biocrine AB 的联合创始人兼首席执行官，IBL 和 BL 是 Biocrine AB 的顾问。

本方案描述了一种用于眼内治疗的新型平台 体内 ACE中移植的肝类器官成像。ACE既往已被用作其他器官来源微组织（如胰岛）的移植部位11,12, 由于其独特的移植微环境，富含血管、神经和氧气，并可通过角膜进行成像观察。活体肝脏成像能够实现对细胞及生物学过程的可视化 原位，无法进行长期纵向监测。通过腹部窗口对肝脏进行成像需要复杂的手术操作，且器官在体内的运动使得随时间推移对单个细胞进行追踪变得困难。因此，这种新型成像方法实现了对肝细胞在单细胞分辨率下的非侵入性、长期纵向监测。
本方案分为三个部分。第一部分是通过两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞，该方法改编自 Charni-Natan 等人的研究13，不同之处在于我们是在死亡小鼠上进行肝脏灌注，而非在麻醉的活体动物上操作。这种改进具有一些优势，例如减少伦理方面的顾虑，并避免机体中残留麻醉剂。在本研究中，我们利用分离所得的肝细胞富集组分生成肝类球体，但这并不排除使用其他专门的方案分离其他非实质细胞群体，以构建具有不同组分的共培养类球体14,15。
本方案的第二部分涉及将肝类器官移植到受体小鼠的角膜缘（ACE）。该手术在麻醉小鼠中进行，操作快速（不到10分钟）且简便，无需术后治疗。角膜穿刺口可自行闭合，并在3–5天内愈合。在愈合过程中，偶尔会在切口周围观察到轻微雾化现象，但数日内即可消退。我们未在手术动物的眼部观察到前粘连（anterior synechia）病例。移植操作在洁净但开放的实验室环境中进行，未出现眼部感染问题。类器官在眼内的接种与定植不会影响受体动物的视力或改变其行为。在本方案中，我们使用异氟烷（isoflurane）麻醉进行移植手术以及后续操作 在体内 成像，小鼠对该过程耐受性良好。由于其作用具有剂量依赖性，因此可在操作过程中轻松调整剂量，并具有缩短麻醉后睡眠和苏醒时间的优势。然而，也可使用其他可注射麻醉剂。移植后，通常需等待约1个月，使类球体完全植入、实现血管化并获得神经支配，之后再进行治疗干预 体内 成像。我们还证实，利用人肝类球体和免疫缺陷型受体小鼠，可以实现移植与定植。10.
该方法的第三部分是 体内 ACE中移植肝类器官的成像。本方案描述了 体内 成像装置利用了科研成像机构中常见的显微镜设备。此外，专用材料（如小鼠头部固定器和塑料套管）现已可商业化获取。借助该成像装置，我们能够获取Z轴层面图像，并根据激光穿透深度和荧光检测能力，对类球体结构进行三维重建。对移植后肝类球体中细胞功能的监测依赖于荧光蛋白的可视化，这些荧光蛋白可报告细胞类型、细胞功能及动态变化。因此，该成像平台可通过多种方式单独或联合使用：（1）可通过静脉注射荧光探针，例如用于标记和追踪细胞的抗体以及功能性染料；（2）肝类球体可由表达肝脏特异性荧光蛋白的报告小鼠模型中分离的细胞构建，例如可报告细胞周期动态的FUCCI肝类球体；（3）肝类球体的形成 体外 可与转染或转导技术联用，使类球体表达荧光蛋白和生物传感器，例如腺相关病毒。在我们的实验条件下，使用单光子激发时，成像深度可达约60–100 µm。然而，该深度取决于激光功率、是否具备多光子成像条件、荧光探针的发射特性、探测器的灵敏度，以及类球体移植所在眼球的角度。成像完成后，可使用Image J和Imaris等常用软件进行后续图像分析。例如，在使用FUCCI报告系统时，可计数绿色标记的细胞周期活跃细胞，并与总的红色细胞数量进行比较，以评估移植类球体内的细胞周期活性。此外，ACE成像平台允许将药物以滴眼液形式施加于眼球，或直接注射至ACE内，以治疗移植物并监测其反应。实验动物处死后，移植的类球体可通过手动显微解剖轻松回收，并提供有价值的信息 离体 技术，如免疫荧光染色、转录组学分析等10.
该技术存在一定的局限性。首先，根据我们的经验，受体小鼠必须为白化品系，即具有非色素性的虹膜。移植后，肝类球体将被一层虹膜细胞单层覆盖，虽然这并不影响类球体的存活能力或功能，但虹膜细胞中的色素会阻碍成像。第二个问题是麻醉状态下小鼠眼内成像过程中的稳定性。在成像过程中， 体内 成像过程中，必须密切监测动物的麻醉浓度和呼吸情况，以尽量减少其移动。尽管如此，采用此处所述的成像参数，我们仍能够实现单细胞水平的高分辨率成像。
总之，本方案描述了一种非侵入性方法的实施过程 体内 小鼠眼部移植肝样组织的成像平台。我们采用简便的操作步骤、常规设备和经济的材料，使该方法易于被众多研究者所采用。该模型结合了以下优势： 体外 3D肝球状体与 体内 利用ACE提供的微环境和光学可及性，为在基础研究和临床前环境中研究肝脏生理学和病理学创建了一个有价值的平台。

哺乳动物在健康和疾病状态下肝功能的监测受限于缺乏高分辨率、非侵入性的方法 在体 成像技术。由于该器官位置难以接近，其可视化受到限制，因此需要整合细胞过程， 体内 研究依赖于在不同时间点处死动物。为了克服这一成像局限，大量工作依赖于 体外 模型，在这些模型中，可在受控环境中对类肝微组织进行可视化和研究。
近年来，三维培养系统（如肝类球体）的发展推动了肝脏研究的进步。肝类球体是一种多细胞聚集体，在一定程度上模拟了肝组织的微环境及其复杂的细胞间相互作用。1 并且相较于传统的单层培养具有明显优势2,3肝类球体也被用作不同肝病的模型4,5,6 并在此过程中发挥了关键作用&#160;理解疾病机制。然而，当前仍存在一些关键局限性 体外 肝脏模型的不足之处在于缺乏生理性的 体内 微环境及在培养中的有限使用时间（约20天）3肝脏类器官此前已被移植到不同部位 体内，例如肾包膜下7 或腹腔内注射8，这些区域无法进行光学成像。活体肝脏成像是一种先进的技术，可实现细胞分辨率的实时成像。目前，该技术 原位 肝脏成像仅能在外置的器官上进行，该方法具有高度侵入性，且通常具有致死性9尽管安装腹部窗口可实现肝脏的重复成像，但该操作需要复杂的手术及术后护理。
为了在细胞分辨率下进行长期动态监测，我们探索了将肝类器官移植到小鼠眼球前房（anterior chamber of the eye, ACE）的技术。在此环境中，类肝组织可在生理条件下定植，与机体信号相连，并可通过光学成像进行实时观察。角膜为透明组织，可作为天然窗口，使种植于虹膜上的微组织能够通过共聚焦显微镜实现无创、长期的活体成像。本文介绍这一新开发平台的工作流程。 体内 肝脏类球体成像10. 本方案是其实施的逐步操作指南，分为（1）小鼠原代肝细胞的提取和 体外 肝球体的形成、（2）将肝球体移植至受体小鼠的肾包膜下腔隙，以及（3） 体内 对麻醉小鼠体内移植的肝类球体进行成像。此外，我们将展示该成像平台的一些应用可能性与实际用途。

<table><tbody><tr><td>27 G 蝴蝶针</td><td>Venofix</td><td>4056388</td><td></td></tr><tr><td>AAV8-CAG-GFP</td><td>Charles River</td><td>CV17169-AV9</td><td>在肝类球体形成期间，以 1 &amp;micro;L/mL 浓度与分离的肝细胞共孵育</td></tr><tr><td>无水乙醇和 70% 乙醇</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>吸水垫</td><td>Attends</td><td>203903</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白-Cre;RCL-tdTomato（B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J；B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J）</td><td>Jackson</td><td>#003574 和 #007914</td><td>小鼠来自本单位内部繁育</td></tr><tr><td>B6 白化小鼠（B6(Cg)-Tyrc-2J/J）</td><td>Jackson</td><td>#000058</td><td>小鼠来自本单位内部繁育</td></tr><tr><td>B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH</td><td>INFRAFRONTIER/EMMA</td><td>EM:08395</td><td>小鼠来自本单位内部繁育</td></tr><tr><td>BD Insyte IV 导管 24 G x 0.75 英寸</td><td>BD Medical</td><td>381212</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐标准玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网，70 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>定制金属板</td><td>五金商店</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>双级玻璃微电极拉制仪</td><td>Narshige</td><td>型号 PC-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>电热垫</td><td>五金商店</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>绿色 CMFDA</td><td>Abcam</td><td>ab145459</td><td>用 DMSO 重悬，以 100 &amp;micro;g/只小鼠的剂量在含 10% FBS 的 PBS 中给药</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td>型号 1750 Luer 尖端螺纹活塞注射器，500 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>HBSS；无钙、无镁、无酚红</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HCX IRAPO L 25x/0.95 W 物镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>0.8 L 诱导室</td><td>Univentor</td><td>8329001</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>凝集素 DyLight-649</td><td>Invitrogen</td><td>L32472</td><td>以 1 mg/mL 浓度、100 &amp;micro;L/只小鼠给药</td></tr><tr><td>Liberase TM 研究级酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>微电极斜面研磨仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>型号 BV-10</td><td></td></tr><tr><td>小鼠头部固定器和气体面罩</td><td>Narshige</td><td>型号 SGM-4</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96 孔 U 型底微孔板</td><td>Thermo Fisher</td><td>174929</td><td></td></tr><tr><td>单纯眼膏</td><td>APL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x；无钙、无镁</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td>型号 ISM795</td><td></td></tr><tr><td>PharMed BPT 泵用管路</td><td>VWR</td><td>VERN070540-07</td><td>内径 0.76 mm，外径 2.46 mm</td></tr><tr><td>pHrodo Red-LDL</td><td>Invitrogen</td><td>L34356</td><td>以 1 mg/mL 浓度、100 &amp;micro;L/只小鼠给药</td></tr><tr><td>Portex 细内径聚乙烯管</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/140</td><td>内径 0.4 mm，外径 0.8 mm</td></tr><tr><td>硅胶解剖垫</td><td>五金商店</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>固体万向节</td><td>Narshige</td><td>型号 UST-2</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>型号 M80</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 悬浮培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td></td></tr><tr><td>镇痛新（Temgesic）</td><td>Indivor</td><td>N/A</td><td>皮下注射，剂量为 0.05 mg/mL，2 &amp;micro;L/g 小鼠</td></tr><tr><td>透明硅胶管</td><td>VWR</td><td>228-1450</td><td>内径 1.5 mm，外径 3 mm</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Univentor 400 麻醉机&amp;nbsp;</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr><tr><td>直立式激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>型号 TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Novartis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>William's E 培养基；无谷氨酰胺、无酚红</td><td>Gibco</td><td>22551089</td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像小鼠眼前房移植的肝类器官

In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye

哺乳动物肝脏的生物医学研究因缺乏相关方法而受到阻碍 在体内 以细胞分辨率进行无创纵向成像。迄今为止，肝脏的光学成像 原位 通过活体成像可实现细胞水平的高分辨率成像，但该方法无法在同一动物体内进行多次重复，因而不能实现纵向观察。非侵入性成像方法（如生物发光成像）虽可在同一动物上进行多次重复成像，却无法达到细胞分辨率。为弥补这一方法学上的不足，我们开发了一种非侵入性 体内 小鼠眼眼前房移植肝类器官的成像。本研究所述工作流程中，生成原代小鼠肝类器官 体外 并将类球体移植到受体小鼠眼球前房，使其在虹膜上着床。角膜作为天然的观察窗口，可通过常规共聚焦显微镜对移植的类球体进行成像。这些类球体可在眼内存活数月，在此期间可于健康与疾病状态下对细胞进行研究，并利用合适的荧光探针通过多次成像持续监测其对不同刺激的反应。在本方案中，我们详细阐述了实施该成像系统所需的各个步骤，并说明如何充分发掘其应用潜力。

通过两步胶原酶灌注法，利用蠕动泵将温热的缓冲液经肝脏血管系统循环，从而从鼠肝脏中分离出富含肝细胞的原代肝细胞（图1A）。具体操作中，对下腔静脉进行插管，并剪开门静脉以允许缓冲液流过（图1B）。首先，使用基于HBSS的缓冲液灌注肝脏，以清除血液。若插管成功且无血栓形成，肝脏会在数秒内变白并呈黄色。随后，将含有Liberase酶混合物的消化缓冲液循环通过肝脏，使组织解离为单细胞悬液。细胞经手动计数后，接种至96孔超低黏附（ULA）板中，可在数日内自发组装形成类球体。至第5天，类球体已形成，其周围出现的薄层包膜表明聚集成功（图1C）。我们通常等到第10天进行移植，此时类球体结构致密，并已形成牢固的细胞间连接。每孔接种的细胞数量决定了肝类球体的大小，每孔接种1000、1200和1500个细胞所形成的类球体直径分别为238 µm ± 10 µm、248 µm ± 17 µm和298 µm ± 19 µm（均值±标准差）（图1C、D）。在移植时，我们选择直径约为250 µm的类球体，原因如下：（1）类球体尺寸不宜过大，以避免缺氧和中心坏死，但需含有足够数量的细胞以维持细胞间通讯，并支持移植物在眼部的重塑；（2）该尺寸类球体的重量可使其自然沉降至虹膜表面，从而提高移植效率；（3）此尺寸与每只小鼠眼移植5–10个类球体的策略相匹配。
移植手术需要使用与玻璃插管相连的手动螺纹注射器（图 2A）。玻璃套管由硼硅酸盐玻璃毛细管在实验室中自行改制而成，使用微管拉制仪和斜面仪加工成精细的钝端尖部。一种更简单的替代套管可通过将市售的塑料导管连接至注射器管路，并用移液器吸头固定来制备图2B）。手术包括通过角膜切口将肝类球体接种到角膜缘血管网（ACE）中（图2C）。将类球体置于瞳孔边缘，以便更易于成像观察，并防止其移入眼房角。移植实验采用白化小鼠，因其无色素的虹膜有利于 体内 移植肝类器官的成像。将7–10个类器官/眼移植至受体小鼠双眼，分别在移植后（post-Tx）3天、1周和1个月采集立体图像，以记录角膜愈合情况及类器官移植成功率。图 2D值得注意的是，肝脏类球体在眼前房移植后从刚移植到完全定植期间外观的变化，是由于移植物在虹膜上的附着，以及虹膜细胞在类球体表面形成单层生长所致。肝脏类球体在眼前房的定植成功率为70%（n = 9只眼，包括雄性和雌性小鼠）图2E）。移植后的最初几天对存活和植入最为关键，可能是因为受体动物揉眼，导致角膜愈合前类器官脱落。移植后肝类器官的大小无显著差异，其形态变化归因于移植物重塑和植入过程。图 2F移植后1个月，虹膜上所有移植的类球体均已血管化并神经支配，免疫荧光染色结果如图所示（图 2G).
非侵入性 体内 对麻醉后的受体小鼠使用直立式共聚焦显微镜和长距离浸入式物镜进行成像图3A，表2）。ACE 中的荧光成像可通过多种方法实现，如图所示 图3B将荧光探针注射到受体小鼠的循环系统中，可实现对类球体中不同类型细胞和结构的可视化观察。我们使用凝集素标记血管（图3C），CMFDA 用于观察胆小管网络（图 3D）以及pHrodo-LDL，证实了类球体细胞对LDL的主动摄取（图3E）。也可使用来自报告基因小鼠模型的肝类球体。白蛋白-Cre:tdTomato 类球体可用于标记和追踪肝细胞（图3F），并利用表达荧光泛素细胞周期指示剂（FUCCI）生物传感器的球状体，在单细胞分辨率下可视化细胞周期动态图3G最后，肝类球体可进行遗传修饰 体外 移植前，以及在腺相关病毒（AAV）-GFP转导的情况下，可观察到表达 体内 超过6个月（图 3H).
<img alt="肝脏类器官实验，展示孵育装置、手术操作、细胞生长图像及尺寸数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66234/66234fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1小鼠原代肝细胞的分离与肝类球体的制备 (A用于分离原代小鼠肝细胞的材料与设备：1. 分离缓冲液；2. 水浴锅；3. 蠕动泵；4. 培养皿；5. 细胞筛；6. 吸水垫；7. 解剖垫；8. 细胞刮刀；9. 27 G 蝴蝶针；10. 解剖工具。B手术期间的腹腔：对下腔静脉进行插管灌注，同时剪开门静脉以允许缓冲液流过。C) 肝细胞球体形成的明场图像 体外 接种后第0天（d0）、第5天（d5）和第10天（d10），比例尺 = 200 µm. (D不同细胞接种浓度下的肝类球体大小，n = 21 个类球体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66234/66234fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡装置；肝类器官移植；光学平台；手术步骤；图表数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66234/66234fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：肝类器官移植至小鼠眼前房（ACE）及其定植情况。（A）用于将肝类器官移植至眼前房（Tx）的材料与设备：1. 培养皿中的肝类器官；2. 无菌生理盐水；3. 眼用软膏；4. 23 G 针头；5. 套管；6. 哈密尔顿注射器；7. 麻醉气体导管；8. 头部固定装置与面罩；9. 加热垫；10. 定制金属底板；11. 镊子与实心万向节。（B）套管与哈密尔顿注射器的组装：1. 玻璃套管通过 Portex 管和 27G 针头连接至哈密尔顿注射器；2. 玻璃套管通过额外的硅胶管和 PharMed 管连接至 Portex 管；3. 可选的组装式塑料套管；4. 塑料套管的组成部分：24G BD Insyte 塑料导管通过 PharMed 管连接，并套入截断的 10 µl 移液器吸头中以增强稳定性与握持性。（C）移植手术步骤示意图：1. 将类器官吸入套管中；2. 用针头穿刺角膜；3. 将套管插入切口，并将类器官释放至眼前房（ACE）；4. 从眼球外部将类器官调整至靠近瞳孔、远离切口的位置。（D）手术当天及术后 3 天、7 天和 30 天小鼠眼内肝类器官（sph）的立体图像。箭头指示存活的类器官。（E）肝类器官（每孔 1200 个细胞）移植后的定植率，n = 6 只受体小鼠共 9 只眼。（F）移植前体外培养的肝类器官大小（in vitro，n = 单次制备的 20 个类器官）与移植后 1 个月在眼前房内的大小（in vivo，n = 3 只受体小鼠共 16 个类器官），通过计算垂直与水平直径的平均值获得。（G）移植后 2 个月肝类器官的免疫荧光染色，显示血管化（CD31，粉红色，虚线勾勒类器官团块）和交感神经支配（酪氨酸羟化酶（TH），橙色），比例尺 = 100 µm。F 图数据经许可改编自 Lazzeri-Barcelo 等人10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66234/66234fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞分离、类球体生成、移植、活体成像；显微镜检查、荧光" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66234/66234fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：无创眼内 体内 移植肝类球体的成像 (A) 实验材料与设备 在体 ACE成像：1. 直立式激光扫描共聚焦显微镜；2. 暗箱；3. 电动XYZ载物台；4. 浸入式物镜；5. 头部固定装置与气体面罩；6. 镊子与固态万向节；7. 加热垫；8. 定制金属底板。B) 图示所采用的不同方法 体内 眼内移植肝类器官的荧光信号成像。C-H) ACE-肝脏类器官在培养过程中的代表性图像 体内 通过共聚焦显微镜成像。利用背向散射信号观察类球体的体积和结构；C) 通过静脉注射荧光凝集素标记血管，比例尺 = 100 µm; (D) 荧光CMFDA标记的胆小管网络，比例尺 = 50 µm; (E) 通过注射荧光pHrodo-LDL探针检测LDL摄取，比例尺= 100 µm; (F表达Td-Tomato的肝细胞，箭头指示细胞核，星号指示类球体内的血管结构，比例尺 = 50 µm; (G) 监测表达FUCCI的肝类器官中的细胞周期动态，比例尺 = 50 µm （主图）和 20 µm （放大图）。(H肝脏类球体转导 体外 在移植前使用 AAV8-GFP 处理，并在移植后 6 个月对眼部成像，比例尺 = 50 µm图G中的图像已获许可改编自Lazzeri-Barcelo等人的研究。10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66234/66234fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：用于分离原代小鼠肝细胞的溶液。 分离小鼠肝细胞所需的溶液与缓冲液组成。消化缓冲液和梯度溶液组分应在分离当天新鲜配制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66234/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载本表。</a>
表2. 用于肝类器官眼内活体成像的Leica SP5共聚焦显微镜设置。 本表格经Lazzeri等10许可改编。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66234/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

在此，我们介绍一种可实现非侵入性 体内 小鼠眼前房移植肝类器官的成像。该实验流程涵盖从原代肝细胞生成类器官，到将其移植至小鼠眼前房的全过程 体内 通过共聚焦显微镜实现细胞分辨率成像。

哺乳动物肝脏的生物医学研究因缺乏能够在体内以细胞分辨率进行非侵入性纵向成像的方法而受到阻碍。直到……

在我们课题组，我们利用小鼠眼球的前房作为肝类固醇体内非侵入性成像的移植部位。这一新建立的成像平台将为研究人员提供一种独特的工具，并拓展我们在基础和临床前研究中对肝脏生理学和病理学的理解。在生物医学研究中，我们依赖于细胞过程的可视化，以理解疾病的机制。目前，肝脏研究领域缺乏能够在活体内对肝细胞进行长期纵向监测的高分辨率成像方法。与活体肝脏成像技术相比，我们的技术具有非侵入性优势，可对肝细胞在多次成像过程中进行重复观察，从而实现以单细胞分辨率监测肝脏功能在不同刺激下的动态变化。利用我们的平台，移植至眼部的肝脏类器官可在体内存活数月之久，且同一受体小鼠可在不同时间点接受非侵入性成像观察。这使得我们使用的实验动物数量减少，同时提高了体内数据的质量。在过去十年中，我们课题组已将眼部成像平台发展为一种强大的研究工具。该平台最初设计用于胰腺胰岛的成像，现已拓展应用于肝脏类固醇研究，并有望进一步扩展至其他器官和研究领域。首先，准备好所有必需的资源，用70%乙醇清洁Hamilton注射器管路和套管，随后用生理盐水冲洗。用生理盐水充满后，将Hamilton注射器水平固定在实验台面上。接着，准备好异氟烷麻醉装置，并将加热垫预热至37摄氏度。用一段聚乙烯管套住连接在实心万向节上的镊子尖端，形成一个环状结构。使用200微升移液器及吸头，将96孔板中肝脏的PHE转移至含有维持培养基的35毫米细胞悬浮培养皿中。麻醉小鼠后，将其转移至加热垫上，并用螺丝固定头部以保持不动。然后轻轻将眼球从眼窝中取出，并用镊子固定。为防止干燥，在两只眼睛上各滴一滴生理盐水。在体视显微镜下，用汉密尔顿注射器吸取肝类器官。将套管水平放置于清洁的表面上。使用23号针头，小心刺穿角膜，并将针头侧向滑动以扩大切口。用纸巾吸干渗出的房水，并向眼球滴加生理盐水以保持湿润。将套管垂直放置，使肝类器官沉降至管尖，然后使用 Hamilton 注射器轻轻将其插入孔中，缓慢将肝类器官注入角膜缘外植体（ACE）中。用套管尖端从外部轻柔触碰角膜，以将肝类器官调整至瞳孔周围位置。5 到 10 分钟后，松开镊子释放眼球。为了润滑并促进角膜愈合，将凡士林眼膏涂抹于手术眼。在小鼠苏醒前，皮下注射镇痛剂以避免术后不适。首先，用麻醉剂麻醉小鼠，将肝类器官移植至ACE内，并用螺钉固定头部。为防止干燥，在双眼上各滴一滴人工泪液凝胶。通过尾静脉静脉注射荧光探针，并立即开始成像。将头部倾斜后，轻轻将眼球从眼窝中挤出，并将其固定在成像物镜下。为了填充角膜与物镜之间的空间，滴加足量的人工泪液凝胶，并通过目镜对准肝脏类器官进行聚焦。使用25倍物镜采集活体图像。最后，在唤醒动物之前，将凡士林眼膏涂抹于成像眼。非侵入性活体眼内成像显示移植的肝类器官中存在血管、门脉网络以及低密度脂蛋白（LDL）摄取能力。表达荧光泛素细胞周期指示生物传感器的肝类器官被长期监测，实现了单细胞分辨率的观察。

in-vivo-imaging-liver-spheroids-engrafted-anterior-chamber-mouse

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

移植到小鼠眼前房的肝球体的体内成像

本视频介绍了一种成像方法，用于在稳定小鼠肝脏器官后，利用多光子显微镜观察和研究其血管内的动态过程。多光子显微镜能够在活体条件下以高空间分辨率对生物组织进行成像。...

基于成像夹具支撑的小鼠肝脏分期成像用于多光子显微血管可视化：一种借助稳定装置获取小鼠肝脏血管多维图像的成像技术

来源： Bosco, A., et al. 神经退行性疾病中视网膜小胶质细胞活化的体内动态：小鼠青光眼中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量. J. Vis. Exp. (2015)...

在青光眼小鼠模型中对视网膜小胶质细胞的活体成像

一种结合眼内移植与共聚焦显微镜的新方法，可实现对移植组织内细胞的纵向、无创实时成像，分辨率达单细胞水平...

移植至眼前房以实现纵向、非侵入性 在体 实时单细胞分辨率成像

在肝脏中对免疫细胞进行稳定的活体高分辨率成像具有挑战性。本文提供了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，利用活体多光子激光扫描显微镜，对小鼠肝脏中免疫细胞的迁移及细胞间相互作用进行长时间（约6小时）的观察研究。...

利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像

本实验方案的目的是通过激光扫描显微镜对植入小鼠眼前房的胸腺组织中的胸腺细胞进行纵向活体实时追踪。由于角膜透明且移植物具有血管化特性，可连续记录前体细胞的招募过程以及成熟T细胞的迁出过程。...

实时 体内 通过激光扫描显微镜追踪眼前房中的胸腺细胞

采用手术原位移植技术，将患者来源的肿瘤组织块植入小鼠体内，同时结合培养的人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系进行针头注射，从而建立人肝转移性葡萄膜黑色素瘤的原位异种移植小鼠模型。...

在免疫缺陷小鼠中建立肝脏原位人眼葡萄膜黑色素瘤异种移植平台

本方案的目的是持续监测人胰岛移植过程的动力学变化以及宿主细胞与供体细胞的贡献情况。通过将人胰岛移植到NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠受体的眼前房（ACE），随后进行多次双光子成像，即可实现该目标。...

活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

结直肠癌（CRC）类器官的门静脉注射可产生富含间质的肝转移灶。该结直肠癌肝转移小鼠模型是研究肿瘤与间质相互作用的有力工具，也可用于开发新型靶向间质的治疗策略，例如腺相关病毒介导的基因治疗。...

通过门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移微环境

我们提出了一种利用光纤共聚焦激光显微内镜（CLM）无创研究结膜下注射后脂质体在眼部时空分布的实验方案。...

时空 在体 内 使用光纤共聚焦激光显微内镜成像眼部药物递送系统

本方案描述了利用光学相干断层扫描技术在小鼠脉络膜中植入并评估黑色素瘤的方法。...

小鼠脉络膜黑色素瘤的植入与评估 通过 光学相干断层扫描

了解小鼠眼前房肝球体移植的非侵入性活体成像技术。该方法利用共聚焦显微镜实现单细胞分辨率的长期纵向监测，为肝脏生理学和病理学研究提供高分辨率数据。

活体成像小鼠眼前房移植的肝类器官

探索更多视频