原代小鼠视网膜神经胶质 Müller 细胞的分离

本手稿描述了从小鼠眼睛中分离视网膜神经胶质 Müller 细胞的详细方案。该方案从小鼠眼睛的摘除和解剖开始，然后是 Müller 细胞的分离、接种和培养。

穆勒细胞是视网膜的主要神经胶质细胞。它们在维持视网膜高度代谢活跃的神经元方面发挥着非常重要的作用。我们的实验室建立了一种从小鼠眼睛中分离穆勒细胞的技术。这项技术将能够研究穆勒细胞在不同视网膜疾病中的作用，了解疾病的发病机制，并开发治疗靶点。

[旁白]根据您所在机构批准的方法对小鼠进行道德安乐死。通过将 5/45 型镊子按在眼眶区域诱导眼球突出来使眼睛剋出，然后通过将镊子的手臂定位在眼睛后部来提取眼睛，然后轻轻地从眼眶区域拉出。将眼睛放入 10 mL 穆勒细胞眼液中，让它们静置过夜，或在室温下静置约 18 小时。18 小时后，将眼液倒出要丢弃的管子，将其倒出。用温热的磷酸盐缓冲盐水或PBS清洗眼睛。将 PBS 从要丢弃的管中倒出，再次倒出 PBS。然后将眼睛放入含有10mL胰蛋白酶溶液的100毫米培养皿中。将培养皿放入培养箱中，在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 1.5 至 2 小时。孵育后，将眼睛转移到含有大约5mL完全原代穆勒细胞生长培养基的60毫米培养皿中。值得注意的是，该视频是在引擎盖外录制的，以提高可见性和清晰的演示。对于实际实验，它们应在如图所示的层流罩中进行。将眼睛放在解剖显微镜下并开始解剖。使用 M5S 型镊子和 Vannas 剪刀去除结缔组织、眼外肌和视神经。在这里，用 Vannas 剪刀切割视神经。用 M5S 型镊子抓住眼睛，然后用 Vannas 剪刀或注射器针头在锯齿部分切开一个切口。用两根 M5S 型镊子抓住切口，开始从眼睛后部拉动或撕裂角膜。以小增量拉动以确保视网膜的完整性保持完整。这是关于如何从眼罩后部去除角膜的演示。一旦晶状体和神经视网膜暴露出来，就去除眼睛的色素沉着层，那里可能粘着虹膜。然后从晶状体上取下神经视网膜。从神经视网膜上去除任何色素沉着组织，以提高分离的纯度。鉴于神经视网膜的粘性，您不太可能去除所有色素沉着组织。收集所有神经视网膜并将它们撕成小块。将神经视网膜接种在含有 4 mL 完全原代穆勒细胞生长培养基的 T25 烧瓶中。最后，将烧瓶放入培养箱中，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育。图 A 显示了在传代 0 和传代 1 处的健康穆勒细胞培养物。色素的缺乏表明不存在RPE细胞，RPE细胞是分离中的主要污染物。这在图 B 中用 RP65（一种 RP 特异性标记物）得到加强。