二维液相色谱-质谱联用技术结合分子网络法用于鉴定藏药Aconitum pendulum 中的化学成分

本研究采用二维高效液相色谱-质谱（2D-HPLC-MS）技术结合分子网络分析，对藏药APB的复杂化学成分进行了系统解析。旨在建立一种更高效的天然药物化学成分鉴定方法。当前实验的主要挑战在于质谱部分未配备高分辨质谱仪，导致检测到的成分数量较少。

二维液相色谱-质谱联用技术（2D-LC-MS）结合样品分离与分子网络技术，能够更准确地鉴定和定量复杂化合物混合物，可更好地处理复杂的数据信息，提高分析的效率和准确性。本实验室致力于应用现有技术实现天然药物化学成分的分离。首先通过称量乌头（Aconitum pendulum bush，简称APB）开始样品制备。

使用精度为万分之一的天平，在一个3毫升的微量离心管中称取0.25克干燥的APB。加入2.5毫升甲醇，然后在240瓦功率、40千赫频率下超声处理30分钟。将超声处理后的样品在1.2G条件下离心5分钟，并收集上清液。

使用0.22微米膜过滤器进行过滤。接下来，以乙腈作为有机相（即B相），以含有0.1%甲酸的超纯水作为水相（即A相），配制二维流动相。将两相溶液经0.22微米滤膜过滤后，在40千赫兹条件下进行超声脱气15分钟。置换流动相后需排气，以去除其中的气泡。

选择C18柱作为一维色谱柱，亲水柱作为二维色谱柱，并将其安装至仪器上。为调节合适的分流比例，通过一个T型接头将二维液相色谱仪器的流出液连接至质谱进样口，T型接头的另一端连接分流管线。调节流速至合适值，以确保质谱所需的合适流速。

开始二维液相色谱（2D-LC）时，双击仪器在线图标，化学工作站将自动与1260LC通信并进入工作站界面。进行二维液相色谱方法参数设置时，单击进样器模块，右键单击“方法”，设置进样体积、流速以及一维泵的流动相时间梯度。在“停止时间”下输入样品运行时间。

单击主菜单仪器，然后在下拉菜单中单击二维液相色谱方法（2D-LC Method）。在二维液相色谱模式（2D-LC Mode）中选择“全面”（Comprehensive）。调制时间输入两分钟，二维梯度停止时间输入1.9分钟。

将流速设置为2毫升。编辑二维梯度并设定波长。编辑方法后，在方法菜单中选择“另存方法为”以命名新方法，然后单击“确定”。开始时，打开真空泵的开关，打开氩气瓶主阀和分压阀，并将压力调节至约0.3兆帕。

为建立质谱方法，将运行时间（分钟）设置为 93.00，并输入数值以配置采集时间、离子化模式、质量范围、传输值编号、传输值持续时间等参数。根据屏幕上显示的数值设置扫描事件的详细信息。在设置数据依赖参数时，将正负离子模式的独立设置禁用。

将前体离子的中性丢失数设为最多三个，产物离子质荷比列表中的峰数设为最多三个。保存以将这些设置配置为仪器方法。单击“序列设置”按钮以打开序列表格。

在表格中输入样品类型、文件名、路径、样品编号、仪器方法、位置、进样量及其他相关信息。保存信息以记录序列列表，然后单击“开始分析”按钮以设置并启动质谱采集。

开始数据准备时，导出二维高效液相色谱-质谱（2D-HPLC-MS）的原始质谱数据。接下来，为了连接到 GNPS FTP 服务器，在 WIN SCP 界面的会话配置页面中填写连接信息。填写完信息后，单击“开始”按钮以建立与 GNPS FTP 服务器的连接。

通过打开网页浏览器并访问 GNPS 网站来创建分子网络。新用户需要注册账户，然后登录。在 GNPS 网站的主界面中，点击“数据分析”下的“创建分子网络”。

在任务创建页面，点击“选择输入文件”按钮，然后选择并上传数据文件。在工作流程选项选项卡中，设置生成分子网络（MN）的各种参数。这些参数包括峰提取算法、峰过载值、相似性计算方法等。根据需要完成相应的参数设置后，点击页面底部的“提交”按钮以运行任务。

任务运行完成后，在“Jobs”选项卡中找到已创建的任务，点击工作流名称以查看分析结果。网站提供分子网络图（MN图）、替代物、共生网络及其他相关信息。通过分子网络分析鉴定出APB样本中的四种生物碱成分，分别为乌头碱（Aconitine）、14-苯甲酰乌头碱（14-Benzoylaconine）、14-Oecetalnelene和去甲乌头碱（Hypoconatine）。

这四种化合物具有相同的母核结构。乌头碱、14-苯甲酰乌头原碱、14-苯甲酰乌头原碱和去甲乌头碱结构相似，仅取代基不同。