Name: 建立子宫内膜异位症实验小鼠模型以研究其相关的不孕症 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 了解利用C57BL/6J小鼠建立子宫内膜异位症模型的方法，以研究生殖医学中相关不孕症的病理生理机制。该模型为开发新疗法提供了重要的实验工具。

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本研究由香港特别行政区政府研究资助局资助的主题研究计划（T13-602/21-N）资助。

本研究中进行的所有实验程序均经香港中文大学伦理委员会批准，并根据编号为21-203-MIS_[C]的协议进行监管。
1. 动物适应性饲养与筛选
<ol>
	<li>小鼠准备
	<ol>
		<li>从可靠的供应商处获取18只C57BL/6J小鼠（初产雌性，8-9周龄：6只为供体，12只为受体），并核实其健康证明文件。</li>
		<li>将所有小鼠饲养在受控环境中：温度22-24 °C，湿度40%-60%，12小时光照/12小时黑暗循环。如有条件，使用高效颗粒空气（HEPA）过滤器净化空气。</li>
		<li>让小鼠适应环境72小时，期间自由获取食物和饮水，尽量减少人为干扰以降低应激反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动情周期同步化
	<ol>
		<li>收集含有雄性信息素的垫料，并将其引入雌性小鼠笼中，持续48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阴道细胞学检测
	<ol>
		<li>于次日早晨进行阴道细胞学检查。 
		注：必须在每天的相同时间进行涂片，通常为上午9:00。
		<ol>
			<li>提前准备好双头棉签、经高压灭菌的PBS、35 mm培养皿和已预先标记的载玻片。在培养皿中加入10 mL PBS，将棉签一端浸入PBS中使其充分吸收液体。</li>
			<li>轻柔地从笼中取出一只小鼠，将其放置在一个空笼的盖子上。</li>
			<li>用一只手的拇指和食指抓住小鼠尾巴，另一只手持湿润的棉签，轻柔地插入小鼠阴道。将棉签尖端以约45°角对准动物体长轴方向，小心插入约1.0 cm深度。在插入过程中缓慢旋转棉签。 
			注：插入时缓慢旋转棉签有助于操作更顺畅，并减少对宫颈的刺激。</li>
			<li>通过持续旋转棉签，轻柔地采集阴道腔及阴道壁上的细胞，然后小心地将棉签抽出。 
			注：此过程中应确保棉签持续旋转，同时注意避免接触周围毛发。操作完成后，小心取出棉签，防止污染样本。</li>
			<li>通过轻轻滚动棉签尖端，将采集到的细胞转移至干净且已预标记的载玻片上。 
			注：每次转移细胞后应丢弃使用过的棉签，每只动物均需使用新的棉签。</li>
			<li>在显微镜下观察载玻片，检测角化上皮细胞。若阴道细胞学涂片中均匀存在角化上皮细胞，则表明小鼠处于动情期。拍摄图像并记录观察结果。 
			注：具备适当经验的操作者通常无需染色即可判读涂片。然而，若实验人员无法在未染色情况下准确&#34;读取&#34;涂片结果，则必须进行染色处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 子宫内膜异位囊肿模型的建立
注意：在模型建立过程中，仅选择处于动情期的小鼠作为供体和受体小鼠。对一只小鼠进行实验时，应确保其不在其他小鼠的视线范围内，并且在其完全恢复之前不得重新放回其他动物群体中。模型构建的示意图见图1。
<ol>
	<li>供体组织准备
	<ol>
		<li>使用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）联合麻醉供体小鼠。在麻醉状态下通过颈椎脱位法处死供体小鼠。</li>
		<li>用70%乙醇棉片对腹部区域进行消毒。</li>
		<li>使用无菌手术剪沿腹膜正中线做1 cm切口，暴露肌层。另取一把手术剪剪开肌层，暴露盆腔。</li>
		<li>将镊子尖端闭合，用钝性中央部分轻轻提起肠道。</li>
		<li>定位子宫和卵巢组织。无菌分离整个子宫角，包括双侧子宫角，确保切除组织的长度约为1.5 cm。将切除的组织置于含有PBS的培养皿中，并去除多余的脂肪组织。</li>
		<li>使用无菌手术刀将组织精细切割成1 mm³大小的组织块。定期添加PBS以保持组织湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移植手术操作
	<ol>
		<li>使用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物麻醉受体小鼠。</li>
		<li>涂抹眼用软膏以防止手术期间眼睛干燥。将小鼠仰卧位固定于无菌手术板上。</li>
		<li>通过轻柔移动小鼠后肢确定手术部位，皮下可触及骨性突起。该突起在皮肤下清晰可见，可作为手术过程中受体小鼠卵巢的可靠解剖标志。</li>
		<li>剃除手术区域毛发，确保周围150%区域均无毛发残留。随后使用碘伏和70%酒精交替消毒至少3次。使用无菌手术巾防止组织、无菌器械和缝线与残留毛发接触。最后，在预定手术部位做精确的侧向切口（3–5 mm）。</li>
		<li>用非优势手的镊子固定卵巢。向卵巢囊内缓慢注射100 µL PBS，观察轻微分离现象。</li>
		<li>在囊上制造一个微小切口。使用显微镊子移植子宫组织碎片（1 mm³）。 
		注意：避免过度填充，以防对周围组织造成压力。</li>
		<li>对于假手术组，除步骤2.2.6外，其余步骤均相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>使用可吸收缝线（如5-0 Vicryl）缝合肌层，使用不可吸收缝线（如5-0尼龙）缝合皮肤。</li>
		<li>将小鼠置于设定为37 °C的加热垫上，直至完全恢复意识。监测呼吸，并等待四肢转为粉红色。</li>
		<li>每12小时皮下注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg）以缓解疼痛，持续48小时。术后前24小时内每8小时检查一次疼痛、感染或不适迹象，之后3天内每日检查3次。 
		注意：在动物恢复至能够维持胸卧位意识水平之前，不得无人看护。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 模型验证
<ol>
	<li>大体验证
	<ol>
		<li>4 周后，使用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）联合麻醉受体小鼠。随后在深度麻醉状态下，通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
		<li>行正中切口，暴露腹腔以进行器官检查。</li>
		<li>取出带有可见病灶的卵巢，并拍照记录。</li>
		<li>仔细检查是否存在卵巢外的子宫内膜异位病灶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织学验证 
	注意：由于组织学实验中可能使用具有刺激性气味的溶剂，操作应在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>将卵巢连同病灶一起置于10%中性缓冲福尔马林中固定。</li>
		<li>按照 Adeniran 等人37所述的方法进行组织处理，包括组织取材、固定和包埋。</li>
		<li>连续切片，厚度为 4–5 µm，漂浮于 45 °C 水浴中，贴附于载玻片上。用小鼠编号、卵巢侧别和切片编号清晰标记载玻片，并在 37 °C 下过夜干燥。</li>
		<li>PAS-苏木精染色
		<ol>
			<li>脱蜡：将切片置于二甲苯或二甲苯替代剂中，以去除石蜡。 
			注意：此步骤可能需要重复数次。</li>
			<li>复水：将切片依次浸入浓度递减的乙醇溶液（100%、95%、80%、70%）中，逐步复水。</li>
			<li>高碘酸处理：用1%高碘酸溶液覆盖组织切片，在室温下作用5–10分钟。 
			注意：该步骤将组织中的糖类基团氧化为醛基，使其可与希夫试剂反应，生成紫红色沉淀，以显示卵巢结构。</li>
			<li>用蒸馏水充分冲洗切片，去除残留的高碘酸。</li>
			<li>用希夫试剂染色15分钟。</li>
			<li>先用热水流水冲洗切片以去除多余染料，再用蒸馏水冲洗。</li>
			<li>用1 g/L迈耶苏木精对切片进行复染，时间为2–3分钟。</li>
			<li>用流水冲洗切片2–3分钟。</li>
			<li>加入蓝化试剂，作用30秒。</li>
			<li>用蒸馏水冲洗切片。</li>
			<li>将切片依次浸入浓度递增的乙醇溶液（70%、80%、95%、100%）中逐步脱水。</li>
			<li>将切片浸入透明剂（如二甲苯）中使其透明。</li>
			<li>在载玻片上的切片处滴加封片介质，轻轻盖上盖玻片，确保无气泡产生。将载玻片置于通风橱中自然干燥，以促进封片介质固化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在光学显微镜下观察，记录卵巢中子宫内膜腺体、间质及出血性囊肿的存在，以确认子宫内膜异位症。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Development of a Novel Endometrioma-Simulating Mouse Model

作者声明无利益冲突。

卵巢子宫内膜异位症（OMA）在全球女性中的高发率凸显了一个重要的健康问题38。除了子宫内膜异位症的一般症状外，OMA 还带来额外的生育挑战，包括严重的盆腔疼痛、卵巢扭转的风险以及其他显著的临床影响39,40。尽管目前对 OMA 的发病机制和疾病进展的认识仍 largely 不明确，这一知识空白不仅阻碍了靶向治疗策略的制定，也导致许多女性持续接受疗效欠佳的治疗并反复出现症状。现代许多女性选择推迟生育，进一步加剧了与 OMA 相关的生育力担忧，因此更迫切需要全面理解并深入应对该病的病理生理机制。
从历史上看，阻碍我们深入理解卵巢子宫内膜异位症（OMA）的最重要障碍之一，是缺乏一个坚定且准确的动物模型。尽管过去已探索过多种模型，但这些模型往往难以准确再现OMA的特异性，或因在卵巢以外的器官中形成病灶而引入额外的混杂因素41。为此，我们开发了一种小鼠模型，以模拟OMA并加深对该疾病的理解。我们的手术技术包括将切碎的子宫组织植入小鼠卵巢囊中，以确保子宫内膜异位病灶在卵巢内形成。术后密切监测使我们能够评估OMA的进展，并保障小鼠的健康状况。为了提高模型的相关性，我们保留了完整的卵巢囊，而非将其切除。这一改进旨在防止移植组织泄漏至其他器官，确保病灶特异性地定位于卵巢。此外，我们在手术过程中还注意防范潜在的并发症，如出血或感染。在本研究中，采用PAS染色检测黏液的存在，这是评估卵巢卵泡组织学的常用方法42,43。在子宫内膜异位病灶邻近的卵巢切片中发现闭锁卵泡，是子宫内膜异位症对卵泡发育产生负面影响的关键证据43,44,45。这一发现对于进一步研究与子宫内膜异位囊肿相关的不孕问题具有重要意义，并得到了我们模型的支持。通过纳入组织学验证，我们得以全面理解该模型中与子宫内膜异位症相关的病理变化。这一环节增强了研究结果的可靠性与相关性，并有助于建立子宫内膜异位症与卵巢功能障碍之间的联系。同时，也必须认识到本技术的局限性。尽管该模型成功复制了与OMA相关的卵巢病灶，但可能仍无法完全反映子宫内膜异位症的复杂性。由于物种间的固有差异，将动物模型的研究结果外推至人类存在内在局限性。
相比之下，本研究在既往卵巢子宫内膜异位症小鼠模型的基础上进行了改进，此前的研究曾将子宫角植入卵巢中46。然而，本方法与既往模型之间存在显著差异。首先，本模型仅在卵巢上形成病灶，而既往模型除卵巢外，还在其他器官中出现子宫内膜异位病灶，而不仅局限于卵巢。这一区别使得既往模型更倾向于模拟子宫内膜异位症的混合亚型，而非特异性地模拟卵巢子宫内膜异位囊肿（OMA）。本模型的局限性表现使研究人员能够专注于OMA的细微特征，而不受其他器官病灶的干扰。通过克服这些局限性，本模型更准确地再现了OMA，为未来的研究提供了可靠的平台。其次，本模型在模拟OMA方面表现出令人满意的成功率，达到83%，确保了疾病复制的高度保真性。
值得注意的是，卵巢子宫内膜异位囊肿（OMA）的复发是一个重要问题，因为许多女性在初次治疗后仍会经历症状的反复发作。多项研究已针对子宫内膜异位症的复发情况及相关诊断检测方法进行了评估。例如，Yildiz 等人探讨了经阴道超声作为诊断工具的应用，用于识别特定的超声标志物和影像模式，以实现对疾病复发的准确诊断和监测47。另一项研究则关注子宫内膜异位症女性患者的长期随访，并评估了手术治疗后的复发率48。该研究强调，应根据疾病特征和患者个体因素制定个体化的治疗策略，以最大限度地降低复发风险。此外，部分研究人员还考察了循环生物标志物在预测子宫内膜异位症复发方面的潜力49。该研究探索了特定分子标志物与疾病复发之间的关联，为开发无创性诊断检测方法和个体化管理策略提供了理论依据。这些研究凸显了当前在理解与应对子宫内膜异位症复发方面所作的持续努力，以及为改善患者预后而发展新型诊断技术的进展。将这些研究的成果融入我们对 OMA 小鼠模型的研究中，有助于全面理解该疾病的复发规律及潜在的监测与管理诊断策略。
综上所述，该特异性卵巢子宫内膜异位囊肿（OMA）小鼠模型的建立，为子宫内膜异位症研究领域的新时代奠定了基石。通过填补长期以来的研究空白，该模型有望带来一系列深入见解与突破性进展，从而彻底改变我们对卵巢子宫内膜异位囊肿的理解、治疗乃至预防方式，最终改善患者的临床结局和生活质量。尤为重要的是，通过将本方法与既往的OMA模型进行比较，并结合有关子宫内膜异位症复发及诊断检测研究的结果，我们可进一步提升本研究在更广泛的子宫内膜异位症研究及临床诊疗背景下的相关性与应用价值。

子宫内膜异位囊肿（OMA）是子宫内膜异位症中最主要的亚型，在约17-44%的子宫内膜异位症患者中可观察到1,2。其特征是在卵巢内形成子宫内膜异位囊肿。这些囊肿俗称&#34;巧克力囊肿&#34;，因其特有的深棕色、焦油样质地而得名3。除OMA外，子宫内膜异位症还可表现为腹膜表浅型子宫内膜异位症（SUP）和深部浸润型子宫内膜异位症（DIE）。SUP指发生于腹膜表面的病灶，而DIE指病灶浸润深度超过腹膜表面下5 mm的类型4。这些子宫内膜异位症亚型在病灶位置、形态和浸润深度上的异质性，导致了临床症状的多样性及疾病严重程度的差异5,6。OMA尤其与更严重的子宫内膜异位症分期相关，并且与不孕、盆腔粘连以及卵巢癌风险升高有关1,7,8,9。
子宫内膜异位症，尤其是卵巢子宫内膜异位囊肿（OMA），与不孕症的关联是一个备受关注的临床问题。在不孕女性中，子宫内膜异位症的患病率为25-50%，而被诊断为子宫内膜异位症的女性中有30-50%存在不孕问题10,11,12,13,14。尽管与OMA相关的不孕机制尚不明确，但已有若干假说提出。一种观点认为，子宫内膜异位症可导致慢性炎症状态，从而干扰正常的卵巢功能并损害卵母细胞质量15,16；另一种观点则提出，卵巢卵泡液中存在异常的铁过载，这可能与卵母细胞成熟障碍相关14。其他研究还涉及激素调节紊乱17、卵母细胞质量下降18以及胚胎发育异常19等问题。
从历史上看，啮齿类动物模型在加深我们对子宫内膜异位症的理解方面发挥了关键作用，尤其是在研究其病理学特征、对生育力的影响以及疼痛机制方面20,21,22,23。啮齿类动物，特别是大鼠和小鼠，已被广泛用作动物模型，以探索该疾病的因果关系、潜在机制、可能的诊断技术以及治疗干预手段22,24,25,26。需要认识到的是，所有动物模型都有其特定的用途和局限性。选择何种模型取决于所要测量或研究的具体结果或方面27。例如，一项大鼠模型研究表明，压力可能加剧子宫内膜异位症的表现，并影响炎症相关参数，从而为了解该疾病的潜在诱因提供了线索28。
在子宫内膜异位症研究中，有多种啮齿类动物模型被采用。其中一种常用的方法是同源模型，即将啮齿类动物的子宫组织移植到同种动物的腹腔或肠系膜血管中29。该模型在免疫功能完整性和适用于长期研究方面具有优势30。然而，由于移植的异位小鼠子宫组织与人类子宫内膜异位病灶的特征存在部分差异，该模型也存在局限性31。另一种方法是异源模型，即将人类子宫内膜活检组织植入免疫抑制的小鼠体内32。该模型可利用人类异位子宫内膜作为供体组织来形成病灶，具有良好的建构效度32。然而，该模型依赖于免疫抑制小鼠作为受体，因而难以全面评估疾病发病机制中涉及的免疫反应33。尽管如此，必须指出的是，现有模型主要侧重于模拟泛化的子宫内膜异位症（SUP），未能充分反映卵巢型子宫内膜异位囊肿（OMA）和深部浸润型子宫内膜异位症（DIE）的独特特征34。目前，针对DIE的特异性模型极为缺乏，仅有少数模型存在，其中包括Yan等人近期建立的一种啮齿类动物模型35。这种稀缺性凸显了进一步研究和开发能够准确再现DIE特有特征的动物模型的迫切需求。此外，我们对OMA的理解，尤其是其与生育力之间复杂关系的认识，仍然十分有限26，36。
针对现有挑战，本文提出了一种新型的同源小鼠模型，旨在特异性模拟卵巢子宫内膜异位症（OMA）。该模型旨在深入揭示OMA相关不孕症的病理机制，从而填补生殖医学这一关键领域中的知识空白。简言之，本研究选用C57BL/6J小鼠，因其具有类似人类的生殖特征。在完成动情周期同步后，将供体小鼠的子宫组织剪碎，并以1:2的比例移植至受体小鼠的卵巢囊中。经过4周的观察期后，通过形态学和组织学检查对卵巢病灶进行评估，以确认OMA的存在并分析相关的卵泡闭锁情况。该模型的成功率达83%，为OMA研究提供了可靠的实验平台，尤其强调卵巢局部病灶的形成，便于开展针对性研究。

<table><tbody><tr><td>1 cc 注射器配 25 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>301320</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 细胞培养皿</td><td>FALCON</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10% 缓冲福尔马林</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x 磷酸盐缓冲液 (PBS) 缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305107</td><td></td></tr><tr><td>5-0 黑色编织丝线不可吸收缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>W500H</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粘附性显微镜载玻片</td><td>Marienfeld</td><td>810401</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺注射液&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXBUPRENOR5</td><td></td></tr><tr><td>双头棉签</td><td>SANYO Co., LTD.</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Alfasan International b.v</td><td>2203095-08</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Excelta Corporation</td><td>2827-NH-35-SE-ND</td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>10033691</td><td></td></tr><tr><td>过碘酸希夫 (PAS) 染色试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Ab150680</td><td></td></tr><tr><td>无粉无菌手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19020558</td><td></td></tr><tr><td>组织处理/包埋盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-197-700A</td><td></td></tr><tr><td>3 号手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-657</td><td></td></tr><tr><td>小型锯齿状半弯镊</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>小型手术剪</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5850</td><td></td></tr><tr><td>标准光学显微镜</td><td></td><td></td><td>用于评估阴道细胞学涂片和组织学分析。</td></tr><tr><td>10 号钢制手术刀片</td><td>B.Braun</td><td>BB510</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>MEDICOM</td><td>HMWS 077</td><td></td></tr><tr><td>灭菌耐热玻璃培养皿</td><td>Corning</td><td>70160-101</td><td></td></tr><tr><td>温控电热垫&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICRYL RAPIDE（聚乳酸-乙醇酸共聚物910）可吸收缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>W9918</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪&amp;nbsp;</td><td>Alfasan International b.v</td><td>2110333-10</td><td></td></tr></tbody></table>

建立子宫内膜异位囊肿小鼠实验模型以研究其相关不孕症

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

子宫内膜异位囊肿（OMA）是子宫内膜异位症的一种亚型，其特征是在卵巢中形成子宫内膜异位囊肿，影响约17%-44%被诊断为子宫内膜异位症的患者。患有OMA的女性常伴有生育力下降，但OMA相关不孕的具体机制尚不明确。值得注意的是，现有的动物模型主要模拟腹膜浅层子宫内膜异位症（SUP）和深部浸润型子宫内膜异位症（DIE），在针对OMA的研究方面存在显著空白。为弥补这一知识缺口，本文介绍了一种开创性的模拟OMA的小鼠模型，并全面描述了该模型所采用的技术与操作流程。该模型成功率高达83%，且具有卵巢病变特异性，在深化对OMA尤其是其不孕机制的理解方面具有重要意义。该模型为开展针对OMA相关生育障碍的定向研究提供了有价值的平台，有望推动生殖医学领域在诊断和治疗策略方面的进步。

OMA 成功建立 
在接受移植方案的 12 只小鼠中，有 10 只在大体解剖和组织学水平上均表现出典型的 OMA 病变，成功率为 83%。大体检查发现卵巢表面附着充满液体的病灶，类似于临床 OMA 的表现形式（图 2）。如 图 3 所示，组织病理学观察证实异位子宫内膜组织已成功植入。此外，子宫内膜异位病灶的浸润导致邻近植入部位的卵泡发生广泛闭锁，表明其对卵巢微环境产生了干扰。
模型特异性 
该模型对卵巢子宫内膜异位症具有特异性，这是其有效性的重要基础。经过全面检查，在任何其他盆腔或腹腔器官中均未发现额外的子宫内膜异位病灶，这凸显了该模型的精确性及其作为研究子宫内膜异位囊肿及相关不孕症的可靠工具的潜力。
<img alt="胚胎植入过程；示意图；生殖生物学；供体植入；小鼠实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：子宫内膜异位囊肿模型的建立。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卵巢组织对比；假手术组与子宫内膜异位囊肿组，示意图显示研究中的形态学差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：子宫内膜异位囊肿的大体解剖学特征。 与假手术对照组相比，在移植后4周，OMA组可见异位子宫内膜囊性生长伴随卵巢形态改变。蓝色虚线轮廓：子宫内膜异位病灶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卵巢组织的组织学；假手术对照组与子宫内膜异位囊肿组；放大切片；显微分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠模型中子宫内膜病变的组织学染色切片。 与假手术对照组相比，在OMA组中，移植后4周组织学检查可见与卵巢相关的异位子宫内膜囊性生长。黑色箭头指示闭锁卵泡。比例尺 = 0.5 mm。缩写：OMA = 子宫内膜异位囊肿。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究介绍了一种专门设计用于模拟子宫内膜异位囊肿（一种具有重要临床意义的子宫内膜异位症亚型）的新型小鼠模型。该模型采用C57BL/6J小鼠，旨在阐明与子宫内膜异位囊肿相关不孕的病理生理机制，为填补生殖医学领域当前的知识空白提供一种优化的研究工具。

子宫内膜异位囊肿（OMA）是子宫内膜异位症的一种亚型，其特征是在卵巢中形成子宫内膜异位性囊肿，影响17-44%的个体……

我们的研究范围集中在了解子宫内膜异位症相关不孕症的潜在机制。我们的目标是通过开发模拟子宫内膜异位症的小鼠模型并研究其对生育能力的影响来弥补知识差距。在子宫内膜异位症研究领域，最近的发展包括了解子宫内膜异位症的分子机制、识别用于诊断和治疗的新标志物以及开发研究子宫内膜异位症等特定亚型的创新模型。这些发展有助于提高子宫内膜异位症的知识和潜在的治疗策略。目前子宫内膜异位症研究的实验挑战包括缺乏可靠的动物模型、对发病机制和生育影响的了解有限，以及需要复发研究和诊断测试。子宫内膜异位症小鼠模型和研究结果的结合解决了这些挑战并推动了该领域的发展。与其他技术相比，我们的协议具有明显的优势。它特别专注于模拟子宫内膜异位症，而尚未通过这种方法建立其他亚型。凭借很高的成功率，它可以进行基因改造并复制与人类相似的生殖特征，使其成为研究子宫内膜异位症相关不孕症的宝贵工具。我们的发现为子宫内膜异位症研究的新时代铺平了道路。通过填补长期存在的空白，我们的模型有望带来变革性的见解，彻底改变我们对子宫内膜异位症的理解、治疗和潜在的预防。通过整合复发和诊断研究的结果，我们的研究增强了子宫内膜异位症研究和患者护理的更广泛背景。[旁白]收集含有雄性信息素的垫料后，将它们引入雌性小鼠笼中48小时。将 10 毫升 PBS 倒入培养皿中，然后将棉签的一端浸入其中以吸收液体。轻轻地从笼子里取出一只老鼠，然后把它放在盖子上。将湿润的棉签轻轻插入阴道，然后将棉签轻轻旋转 45 度，绕动物身体的长轴。从阴道发光壁收集细胞后，小心地取出拭子。在干净的预标记载玻片上轻轻滚动拭子尖端，以转移收集的细胞。在显微镜下检查载玻片是否存在表明发情期的角化上皮细胞。首先，用70%乙醇对供体安乐死发情期雌性小鼠的腹部区域进行消毒。使用无菌手术剪刀沿腹膜中线切开一厘米的切口，露出肌肉层。然后，使用另一把剪刀剪开肌肉层并露出骨盆腔。关闭镊子的尖端，用钝的中央部分轻轻提起肠道。找到子宫后，无菌解剖整个子宫角，确保切除两个子宫角。将切除的组织放入含有PBS的培养皿中，去除多余的脂肪组织。使用无菌手术刀，将组织细微地解剖成一毫米的立方体。定期添加PBS以保持组织湿润。将麻醉的受体小鼠置于无菌手术板上的仰卧位。通过轻轻纵后腿来识别手术部位，以感觉皮肤下的骨质突出。用 70% 乙醇拭子消毒手术区域，然后用 Betadine 消毒。在所选部位，在三到五毫米之间做一个精确的侧切口。用非惯用手镊子稳定卵巢，并将 100 微升 PBS 注射到卵巢滑囊中，观察轻微分离。在滑囊上做一个小缝，并使用微型镊子移植一毫米立方的子宫组织碎片。手术后，用可吸收缝合线缝合肌肉层，用不可吸收缝合线缝合皮肤。四个星期后，将移植的受体小鼠从外壳中取出。在安乐死的受体小鼠上做一个中线切口，露出腹腔进行器官检查。彻底检查腹腔是否有外来子宫内膜异位症病变。然后，取出有可见病变的卵巢进行摄影。用10%中性缓冲福尔马林固定有病变的卵巢。将组织切片切片并安装在载玻片上后，放置载玻片二甲苯溶液以去除石蜡。通过将载玻片置于一系列降低的乙醇浓度中来重新水化组织切片。在室温下用 1% 过碘酸处理组织切片 5 至 10 分钟。然后，用蒸馏水彻底冲洗载玻片，以去除任何残留的过碘酸。现在，用移位溶液染色组织切片 15 分钟。用热自来水冲洗载玻片以去除多余的污渍，然后用蒸馏水冲洗。用梅耶苏木精复染组织切片两到三分钟。在涂抹发蓝试剂 30 秒之前，用流动的自来水冲洗载片。用蒸馏水冲洗载玻片后，在增加乙醇浓度的情况下对切片进行脱水。将切片浸入二甲苯中，使其透明。在切片上涂抹封固剂，然后轻轻放置盖玻片，避免气泡。干燥后，在光学显微镜下检查载玻片是否存在子宫内膜腺体、基质和出血性囊肿，以确认卵巢中存在子宫内膜异位症。与假对照组相比，子宫内膜组在移植后 4 周可以看到异位子宫内膜囊性生长与卵巢形态相关。进一步的组织病理学检查证实了异位子宫内膜组织在子宫内膜组中成功植入。

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