基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量
2023年12月15日
基于实时聚合酶链式反应（PCR）的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量是一种用于诊断和监测HBV感染的高灵敏度、高准确性方法。本文介绍了一种用于检测HBV DNA及测定样本中病毒载量的实验方案。
在本视频中，我们将向您展示使用经 IVD 批准的基于实时 PCR 的 true PCR HBV 病毒载量试剂盒检测 HBV DNA 并定量其病毒载量的逐步操作方案。HBV 诊断研究采用实时 PCR、数字 PCR、NGS 和血清学检测方法。实时 PCR 是 HBV DNA 检测和病毒载量定量的金标准。
数字PCR可定量绝对病毒载量。NGS可鉴定新突变，血清学检测可检测抗原或抗体。在检测低病毒载量病例和隐匿性HBV感染方面存在多项实验挑战。
某些检测方法在所有乙型肝炎病毒（HBV）基因型中的表现可能不佳，且新出现的突变可能导致假阴性结果。与其他技术相比，基于实时PCR的方案是目前可用于HBV检测的最敏感、最特异且可定量的方法。该技术相对快速，因此非常适合临床应用。首先，将实时PCR试剂盒中提供的所有试剂在室温下解冻。
解冻后，以中等速度脉冲涡旋振荡各组分10秒以混匀。然后在室温下以8000G离心10秒。将解冻后的组分置于冷却块上保存。
接下来，为乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本配制PCR反应体系，包括五个HBV标准品和一个无模板对照。轻轻吹打7到10次使加入的试剂充分混匀，然后短暂离心，在室温下以8000G离心10秒。
然后将15 µL PCR反应混合液加入每个PCR管中。分别加入15 µL提取的DNA样本、五种HBV标准品以及无核酸酶水作为无模板对照。盖紧PCR管，短暂离心。
将PCR管放入实时荧光定量PCR仪中。启动热循环仪软件，选择荧光染料，并设置实时荧光定量PCR的热循环程序。运行结束后，使用线性刻度分析扩增曲线。
在指数扩增阶段内设定PCR反应的阈值。为确保准确性和可重复性，需保持阈值设置的一致性。在同一台PCR仪器上检测的所有样本应使用相同的阈值。
根据检测的阈值，将CD值38之前出现扩增的样本视为乙型肝炎病毒（HBV）阳性。使用五种针对HBV特异性DNA的定量标准品，这些标准品已根据第四版世界卫生组织（WHO）HBV DNA国际标准进行校准。利用这些标准品生成标准曲线，以定量未知样本中的HBV DNA。
仅当标准曲线斜率在-3.1至-3.6之间、R平方值在0.99至1.0之间、PCR扩增效率在90%至110%范围内，且阴性对照无扩增时，方可对未知样本的数值进行解释。
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概述
本研究介绍了一种基于实时PCR的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量方案，该方案对于乙型肝炎病毒感染的准确诊断和监测至关重要。由于该方法在识别HBV病毒载量方面具有高灵敏度和特异性，已被公认为金标准。
关键研究组成部分
研究领域
- 乙型肝炎病毒（HBV）检测
- 病毒载量定量
- 临床诊断
背景
- 准确检测乙型肝炎病毒（HBV）在临床环境中的重要性
- 识别低病毒载量和隐匿性感染所面临的挑战
- PCR与其他诊断技术的比较
使用的方法
- 实时聚合酶链式反应（PCR）
- 样本包括乙型肝炎病毒（HBV）阳性对照
- 使用世界卫生组织国际标准品进行校准
主要结果
- 利用标准曲线成功实现乙型肝炎病毒DNA的定量
- 鉴定出具有显著扩增效果的样本
- 参数校准确保高准确性和可重复性
结论
- 本研究提供了一种可靠的HBV DNA检测及病毒载量测定方案。
- 该方法具有高灵敏度，是乙型肝炎研究和临床诊断中的重要工具。
常见问题
行业重要性概述
基于实时 PCR 的 HBV DNA 检测与定量满足了传染病研究和临床诊断中对敏感、可重复的病毒载量测量的关键需求。该技术能够精确监测 HBV 感染状态，支持在抗病毒药物开发和转化研究的关键节点上做出以数据为依据的决策。该方法的标准化和定量严谨性为生物制药研发管线中的预测可信度和项目优先级排序提供了基础。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与疾病相关的系统中有效探究乙型肝炎病毒（HBV）复制与持续存在的机制。
- 通过定量检测病毒DNA的减少，支持抗病毒靶点的功能验证。
- 通过区分真实的生物学效应与检测假象，有助于实现机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的定量读数，用于评估化合物对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制效果。
- 确保在多种HBV基因型和样本类型中检测的可重复性和标准化。
- 具有高灵敏度，可检测低水平病毒载量，支持早期筛选和先导化合物的鉴定。
转化与临床前研究
- 通过将定量结果校准至世界卫生组织（WHO）国际参考标准，符合临床生物标志物标准。
- 通过标准化的病毒载量检测，实现在体外发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供用于疗效评估的定量终点指标，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该实时 PCR 方案贯穿早期发现至临床前研究阶段，能够实现病毒载量的稳定定量，并支持转化研究的连续性。
- Discovery Biology：通过在实验模型中定量检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA，促进假设验证和信号通路解析。
- 筛选：提供可重复的定量结果，用于化合物评价和检测方法的标准化。
- 分析：提供精确的Ct值、标准曲线校准及扩增效率指标，支持可靠的数据比较。
- 转化研究：确保与临床标准一致，支持基于生物标志物的决策制定。
- 企业级复用：提供可扩展、标准化的工作流程，适用于各类乙型肝炎病毒研究及抗病毒药物开发项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高乙型肝炎病毒靶点验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：实现高重复性、高灵敏度和跨基因型适用性，适用于可扩展的工作流程。
- 战略价值：支持科学的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持基于风险调整的抗病毒候选药物优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备分子病毒学和定量 PCR 分析的专业知识。
- 需要能够使用实时 PCR 仪器以及经过验证的校准标准品。
- 要求各实验团队之间对阈值和扩增效率参数进行严格统一标准化。
- 必须能够适应不同的乙型肝炎病毒（HBV）基因型和样本基质。
- 依赖于严格的质控措施，以避免假阴性结果并确保检测的完整性。
