Name: 基于聚合酶链反应的乙型肝炎病毒DNA实时检测和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: 学习使用实时聚合酶链反应技术检测和定量乙型肝炎病毒DNA的方法。该方案具有高灵敏度和特异性，适用于临床诊断和病毒载量监测，为HBV感染研究提供可靠工具。

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我们感谢 Praveen、Kusum、Chandan、Isha、Rashmi、Babli、Shivani、Ankita 和 Shikha 提供的技术协助。

本研究未涉及任何人类受试者或临床样本。所使用的唯一生物材料是4th WHO乙型肝炎病毒DNA核酸检测国际标准品（NIBSC编号10/266）。该标准品为公开可用的参考物质，不包含任何个人身份信息或可识别数据，因此本研究无需伦理审批。
1. DNA 提取
<ol>
	<li>从人血清或血浆样本中提取病毒DNA。将提取的DNA在-20 °C下保存，直至后续用于PCR。
	 
	&#8203;注意：推荐用于DNA提取的血清或血浆体积为500 µL，洗脱体积为50 µL。本研究中使用病毒核酸提取试剂盒（材料表）进行病毒DNA提取。</li>
</ol>
2. 实时荧光定量PCR
<ol>
	<li>解冻所有试剂（表1实时荧光定量 PCR 试剂盒在室温（RT；15–25 °C）下解冻后，短暂涡旋振荡 10 秒（中等速度）混匀各组分，并在 8,000 × g 在室温下持续15秒。将所有解冻的组分置于冷却块上保存。</li>
	<li>反应准备
	<ol>
		<li>按照以下步骤配制PCR反应混合液 表2根据样本、标准品和无模板对照的数量计算需添加的试剂体积。 
		注意：配制PCR反应体系时，每种试剂应至少多加10%的额外体积（例如，若需要10个反应，则按11个反应进行计算）。</li>
		<li>将上述配制好的PCR混合液各15 µL加入每个PCR管中。然后，向各管中加入15 µL提取的样本DNA。作为检测HBV DNA的阳性对照（PC），需加入至少一种HBV标准品（HBV Standard 1–5）各15 µL；同时以15 µL PCR级无核酸酶水作为阴性对照（NC）。为建立HBV DNA定量所需的标准曲线，每次PCR扩增均应使用试剂盒提供的全部5种定量标准品（HBV Standard 1–5）。</li>
		<li>盖上管盖，中等速度脉冲振荡10秒以混匀组分，然后在8,000 × g 室温下静置15秒，然后转入热循环仪。确保反应体系中无气泡，以免干扰荧光检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>程序设置
	<ol>
		<li>使用热循环仪时，按照推荐的循环条件进行程序设置 表3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通道/荧光染料选择
	<ol>
		<li>选择常用于实时 PCR 平台的荧光染料，如文中所述 表4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>运行结束后，在线性刻度下分析扩增曲线。</li>
		<li>阈值设置
		<ol>
			<li>在PCR反应的指数扩增阶段设置阈值。该试剂盒推荐的阈值参数已在文中提及。 表5. 保持阈值设置的一致性。一旦确定了该检测的最佳阈值，应针对特定的PCR仪器对所有样本始终使用相同的阈值。这有助于确保结果的准确性和可重复性。 
			&#8203;注意：如果阈值设置过低，信号可能低于噪声水平，导致Ct值不可靠。如果阈值设置过高，信号可能处于扩增反应的平台期，此时扩增效率下降，Ct值可能不准确。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>临界值
		<ol>
			<li>运行试剂盒共40个扩增循环。任何超过38个循环的扩增均不应纳入结果判读。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定性结果分析
		<ol>
			<li>使用该试剂盒定性检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA。以标准品2作为阳性对照（PC），HBV的预期Ct值为20 ± 2，内标（IC）的预期Ct值为24 ± 3。</li>
			<li>确保无模板对照（NTC）在HBV和内参对照（IC）靶标中均未出现任何扩增。若NTC反应中发生扩增反应，则可能发生了样本污染。</li>
			<li>由于检测的阈值为38，因此HBV靶标在38 Ct之前出现扩增的样本均视为HBV阳性样本。当所有对照均符合上述要求时，应根据前述解释对样本进行判定。 表6.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定量结果分析
		<ol>
			<li>使用一组已知浓度的乙型肝炎病毒（HBV）特异性DNA定量标准品，该标准品系列共5个，已根据第四代世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA国际标准品对核酸扩增技术（NAT）进行校准。20 (表7).</li>
			<li>采用这些标准品绘制标准曲线。利用标准曲线定量未知样本中的HBV DNA。 
			注意：实时 PCR 软件将利用 5 个标准品中 HBV 目标序列的 Ct 值及其对应的国际单位每微升（IU/µL）浓度，生成标准曲线。</li>
			<li>只有当标准品的斜率在 -3.1 至 -3.6 之间，且 R 值满足条件时，才对未知样品的数值进行解读2 值介于0.99至1.0之间，PCR扩增效率为90%-110%（0.9-1.1），阴性对照中无扩增产物。</li>
			<li>软件将计算每个乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本的浓度，单位为国际单位每微升（IU/µL）。为计算病毒载量（将IU/µL转换为国际单位每毫升 [IU/mL]），请使用以下公式： 
			结果（IU/mL）=（结果 [IU/µL] × 洗脱体积 [µL]）/ 样品体积 (mL) 
			注意：第4th 世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA国际标准品（NIBSC编号10/266）从0.5 mL血浆中提取病毒DNA，将纯化的病毒DNA洗脱至50 µL洗脱缓冲液中，并作为参考样本与5种HBV标准品及无模板对照（NTC）一同用于PCR试剂盒检测。参考样本（NIBSC编号10/266）的HBV病毒载量计算如下：(6659 IU/µL × 50 µL)/0.5 mL = 665,900 IU/mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA in Human Serum

<ol><li>Ryu, W. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyu%2C+W-S+%22Molecular+Virology+of+Human+Pathogenic+Viruses%22">Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses</a>. , Elsevier, Academic Press. (2016).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+b+virus+infection+in+the+Asia-Pacific+region+and+Africa%3A+Review+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).</li>
<li>Iloeje, U. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+cirrhosis+risk+based+on+the+level+of+circulating+Hepatitis+B+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load.</a> Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).</li>
<li>Huang, Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+risk+and+sex+difference+of+hepatocellular+carcinoma+among+patients+with+chronic+Hepatitis+B+and+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C.</a> Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643(2011).</li>
<li>World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).</li>
<li>Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+assay+of+hepatitis+b+virus+DNA+in+human+serum+and+plasma+by+fully+automated+genetic+analyzer+mutaswako+g1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1.</a> PLoS One. 18 (2), e0278143(2023).</li>
<li>Chan, H. L. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+genotype+and+Hepatitis+B+virus+DNA+levels+are+correlated+with+histological+liver+damage+in+HBeAg-negative+chronic+Hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection.</a> The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).</li>
<li>Liu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+factors+correlate+with+Hepatitis+B+e+antigen+seroconverson+in+patients+with+chronic+Hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B.</a> Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).</li>
<li>Liu, C. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hepatitis+B+viral+load+and+basal+core+promoter+mutation+in+hepatocellular+carcinoma+in+Hepatitis+B+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers.</a> The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).</li>
<li>Yeo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+viral+load+predicts+survival+of+HCC+patients+undergoing+systemic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy.</a> Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).</li>
<li>Yim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levels+of+Hepatitis+B+virus+%28HBV%29+replication+during+the+nonreplicative+phase%3A+HBV+quantification+by+real-time+PCR+in+korea%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea.</a> Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).</li>
<li>Noh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+impact+of+viral+load+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+and+liver-related+mortality+in+patients+with+hepatitis+c+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231(2016).</li>
<li>Mendy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+viral+load+and+risk+for+liver+cirrhosis+and+hepatocellular+carcinoma+in+the+Gambia%2C+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).</li>
<li>Abe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Hepatitis+B+virus+genomic+DNA+by+real-time+detection+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).</li>
<li>Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+real-time+detection+assay+for+Hepatitis+B+virus+DNA+and+comparison+with+two+commercial+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).</li>
<li>Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+cobas+ampliprep-total+nucleic+acid+isolation-cobas+Taqman+Hepatitis+B+Virus+%28HBV%29+quantitative+test+and+comparison+to+the+versant+HBV+DNA+3.0+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).</li>
<li>Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+cobas+taqman%E2%84%A2+HBV+test+with+the+cobas+amplicor+monitor%E2%84%A2+test+for+measurement+of+Hepatitis+B+virus+DNA+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum.</a> Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).</li>
<li>Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+TRUPCR%C2%AE+HBV+real-time+PCR+assay+for+Hepatitis+B+virus+DNA+quantification+in+clinical+samples%3A+Report+from+a+tertiary+care+liver+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Virusdisease%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre.</a> Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).</li>
<li>Garg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+entry+receptors+and+viral+markers+suggest+a+low+level+of+placental+replication+of+Hepatitis+B+virus+in+a+proportion+of+pregnant+women+infected+with+chronic+Hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B.</a> Scientific Reports. 12 (1), 17795(2022).</li>
<li>NIBSC-Code:10/266. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Standard+for+Hepatitis+B+Virus+%28Hbv%29+DNA+for+Nucleic+Acid+Amplification+Techniques+%28NAT%29%22">Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT)</a>. , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).</li>
<li>Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+cobas+HBV+real-time+PCR+assay+on+Roche+cobas+4800+system+in+comparison+with+cobas+Ampliprep%2Fcobas+Taqman+HBV+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).</li>
<li>Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+the+artus+HBV+QS-RGQ+and+the+CAP%2FCTM+HBV+v2.0+assays+regarding+HEPATITIS+B+virus+DNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification.</a> BioMed Research International. 2020, 4159189(2020).</li>
<li>Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At:
 HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 <a target="_blank" href="https://www.nibsc.org/">https://www.nibsc.org/</a> (2023).</li>
<li>Guvenir, M., Arikan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus%3A+From+diagnosis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Polish+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment.</a> Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).</li>
</ol>

作者与本研究中所用乙型肝炎病毒载量检测试剂盒的生产商Kilpest India Limited有关联。

根据供应商提供的信息，NIBSC 编码 10/266 在用 0.5 mL 无核酸酶水中重悬后，其赋值为 9,55,000 IU/mL21。该样本可视为高载量的乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本。本研究所用病毒载量检测试剂盒测定的 HBV 病毒载量为 6,65,900 IU/mL（图 4）。由于任何DNA提取试剂盒的提取效率均无法达到100%，在纯化过程中通常会损失部分DNA。尽管试剂盒测定的病毒载量略低于试剂（NIBSC 编码 10/266）供应商提供的赋值，但数据仍属满意，因为两者之间的 log10 差值仅为 0.157，低于临界值（0.5）22。
本方案中使用的病毒载量检测试剂盒具有高度的稳健性，并能提供可重复的数据，如图7所示。在本实验中，5个标准品和无模板对照（NTC）均设置三个重复，其Ct值、平均值、标准偏差以及变异系数（CV%）见表8</stro...

乙型肝炎病毒（HBV）是一种部分双链DNA病毒，属于Orthohepadnavirus属和Hepadnaviridae科1。该病毒可引发慢性感染，持续终生，可能导致肝硬化和肝细胞癌2,3,4。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2019年约有2.96亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年新增感染人数达150万5。
血清或血浆样本中乙型肝炎病毒（HBV）DNA的检测与定量是识别持续性乙型肝炎感染个体、评估抗病毒治疗效果以及预测治疗成功可能性的重要方法6,7,8,9,10,11。高病毒载量与肝脏疾病进展风险增加相关，包括肝硬化和肝癌12,13。因此，准确测定病毒载量对于监测HBV感染进展及指导治疗决策至关重要。
与传统PCR技术相比，定量实时PCR检测具有更高的灵敏度、更宽的动态范围以及对HBV DNA更准确的定量能力14,15,16,17。目前市场上已有多种基于实时PCR的商业化分子诊断试剂盒，可用于血清或血浆样本中HBV DNA的定量检测。本文介绍了一种使用市售的、具有IVD标志的实时PCR试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细操作流程。该试剂盒应用广泛18,19，成本较低，且具有高度灵敏性，其性能特征与其他市售的CE标志试剂盒相当18。除扩增HBV靶区域外，该试剂盒还包含一个内源性内参基因，用于验证样本质量、提取DNA的质量、PCR扩增效率以及是否存在PCR抑制。

<table><tbody><tr><td>4&lt;sup&gt;th&lt;/sup&gt; 乙型肝炎病毒DNA世界卫生组织国际标准品</td><td>NIBSC</td><td>NIBSC 编码：10/266</td><td>世界卫生组织第四代乙型肝炎病毒（HBV）DNA国际标准品，NIBSC编号10/266，旨在用于乙型肝炎病毒核酸扩增技术（NAT）中二级参考试剂的校准。</td></tr><tr><td>ABI 实时荧光定量 PCR 仪&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ABI 7500；QuantStudio 5</td><td>这是一台实时荧光定量PCR仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒多重检测 14/198</td><td>NIBSC</td><td>NIBSC 编码：14/198</td><td>这是一种用于HBV、HCV和人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）核酸检测（NAT）的极低阳性三联试剂</td></tr><tr><td>QIAGEN 实时荧光定量 PCR 仪</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Q</td><td>这是一台实时荧光定量PCR仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRUPCR HBV 病毒载量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Kilpest India Limited</td><td>3B294</td><td>本研究中用于HBV DNA检测和病毒载量测定的实时PCR试剂盒</td></tr><tr><td>TRUPCR 病毒核酸提取试剂盒</td><td>Kilpest India Limited</td><td>3B214</td><td>这是一种用于从NIBSC:10/266和NIBSC:14/198中提取HBV病毒DNA的DNA提取试剂盒</td></tr></tbody></table>

基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒dna检测与定量

Real-Time Polymerase Chain Reaction-Based Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA

乙型肝炎病毒（HBV）是全球范围内导致肝病的重要病因，可引起急性或慢性感染，使个体极易发展为致命性肝硬化和肝癌。准确检测和定量血液中的HBV DNA对于HBV感染的诊断与监测至关重要。目前最常用的HBV DNA检测方法是实时PCR，该方法可用于病毒检测及病毒载量评估，从而监测抗病毒治疗的疗效。本文介绍一种使用经IVD认证的基于实时PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细实验方案。该试剂盒采用针对HBV基因组高度保守的核心区域设计的引物和探针，能够准确量化所有HBV基因型（A、B、C、D、E、F、G、H、I和J）。试剂盒还包含内源性内参对照，用于监测可能发生的PCR抑制。本检测共进行40个循环，其临界值为38 Ct。为实现临床样本中HBV DNA的定量，试剂盒提供了一组5个定量标准品，这些标准品含有已知浓度的HBV特异性DNA，并以世界卫生组织国际标准进行校准th 世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA核酸检测国际标准品（NIBSC编号10/266）。该标准品用于验证针对乙型肝炎病毒特异性DNA扩增的检测功能，并建立标准曲线，从而实现对样本中乙型肝炎病毒DNA的定量检测。使用该PCR试剂盒可检测低至2.5 IU/mL的乙型肝炎病毒DNA。该试剂盒具有高灵敏度和良好重复性，是临床实验室中的有力工具，有助于医疗专业人员有效诊断和管理乙型肝炎病毒感染。

检测和定量人血浆/血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA 的工作流程示意图见图1。图2展示了标准品2（作为阳性对照）以及HBV和内参（IC）的无模板对照（NTC）的扩增图谱。图3显示了HBV阳性样本、HBV阴性样本以及存在PCR抑制的样本的扩增曲线。图4展示了NIBSC编码10/266样本的扩增曲线、HBV的Ct值以及测得的HBV浓度（以国际单位每微升，IU/µL表示）。试剂盒中全部5个HBV标准品的HBV靶标扩增曲线及其代表性标准曲线见图5。该标准曲线的斜率为-3.361，R2为0.99996，扩增效率为0.98。图6展示了全部5个HBV标准品的内参（IC）靶标的扩增曲线。
<p class="jove_content biglegend" fo:keep...

基于实时聚合酶链式反应（PCR）的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量是一种用于诊断和监测HBV感染的高灵敏度、高准确性方法。本文介绍了一种用于检测HBV DNA及测定样本中病毒载量的实验方案。

基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量

乙型肝炎病毒（HBV）是全球范围内导致肝病的重要原因。它可引起急性或慢性感染，使个体处于高度……

在本视频中，我们将向您展示使用经 IVD 批准的基于实时 PCR 的 true PCR HBV 病毒载量试剂盒检测 HBV DNA 并定量其病毒载量的逐步操作方案。HBV 诊断研究采用实时 PCR、数字 PCR、NGS 和血清学检测方法。实时 PCR 是 HBV DNA 检测和病毒载量定量的金标准。数字PCR可定量绝对病毒载量。NGS可鉴定新突变，血清学检测可检测抗原或抗体。在检测低病毒载量病例和隐匿性HBV感染方面存在多项实验挑战。某些检测方法在所有乙型肝炎病毒（HBV）基因型中的表现可能不佳，且新出现的突变可能导致假阴性结果。与其他技术相比，基于实时PCR的方案是目前可用于HBV检测的最敏感、最特异且可定量的方法。该技术相对快速，因此非常适合临床应用。首先，将实时PCR试剂盒中提供的所有试剂在室温下解冻。解冻后，以中等速度脉冲涡旋振荡各组分10秒以混匀。然后在室温下以8000G离心10秒。将解冻后的组分置于冷却块上保存。接下来，为乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本配制PCR反应体系，包括五个HBV标准品和一个无模板对照。轻轻吹打7到10次使加入的试剂充分混匀，然后短暂离心，在室温下以8000G离心10秒。然后将15 µL PCR反应混合液加入每个PCR管中。分别加入15 µL提取的DNA样本、五种HBV标准品以及无核酸酶水作为无模板对照。盖紧PCR管，短暂离心。将PCR管放入实时荧光定量PCR仪中。启动热循环仪软件，选择荧光染料，并设置实时荧光定量PCR的热循环程序。运行结束后，使用线性刻度分析扩增曲线。在指数扩增阶段内设定PCR反应的阈值。为确保准确性和可重复性，需保持阈值设置的一致性。在同一台PCR仪器上检测的所有样本应使用相同的阈值。根据检测的阈值，将CD值38之前出现扩增的样本视为乙型肝炎病毒（HBV）阳性。使用五种针对HBV特异性DNA的定量标准品，这些标准品已根据第四版世界卫生组织（WHO）HBV DNA国际标准进行校准。利用这些标准品生成标准曲线，以定量未知样本中的HBV DNA。仅当标准曲线斜率在-3.1至-3.6之间、R平方值在0.99至1.0之间、PCR扩增效率在90%至110%范围内，且阴性对照无扩增时，方可对未知样本的数值进行解释。

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基于聚合酶链反应的乙型肝炎病毒DNA实时检测和定量

来源：Ren, S., 等．丙型肝炎病毒复制分析方案．J. Vis. Exp. （2014）本视频演示了使用定量反转录 PCR 对感染细胞培养物中的丙型肝炎病毒 RNA...

使用定量逆转录聚合酶链式反应检测丙型肝炎病毒载量

丙型肝炎病毒（HCV）是一种导致肝脏疾病（包括肝硬化和肝癌）的重要人类病原体。HCV感染性细胞培养系统对于理解HCV复制的分子机制以及开发新的治疗方法至关重要。本文中，我们描述了一种用于研究HCV复制周期各个阶段的实验方案。...

丙型肝炎病毒复制分析方案

在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外...

开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

低拷贝数整合病毒DNA的检测方法 体外 乙型肝炎感染

本实验方案的目的是提供一份逐步操作指南，用于进行乙型肝炎病毒感染的3-D"肝脏芯片"实验。...

用于乙型肝炎病毒感染的原代肝细胞与库普弗细胞“肝脏芯片”培养

实时定量聚合酶链式反应结合逆转录（RT-qPCR）已广泛用于检测RNA病毒感染水平。本文介绍一种直接RT-qPCR检测方法，该方法无需RNA纯化步骤，可用于包括登革病毒在内的多种RNA病毒的定量分析。...

通过实时定量聚合酶链式反应检测感染细胞培养上清液中的登革病毒RNA

本文描述了一种在新型基因工程293T细胞（293T-NE-3NRs，表达人源NTCP、HNF4α、RXRα和PPARα）以及传统肝细胞（HepG2-NE，表达人源NTCP）中进行乙型肝炎病毒（HBV）感染的详细实验方案。...

在非肝源性293T-NE-3NRs细胞中建立乙型肝炎病毒感染模型

我们介绍了一种利用等温滴定量热法检测靶向乙肝病毒（HBV）进入宿主细胞前后生命周期阶段的抗病毒化合物的方案，该方法通过测定化合物与宿主钠-牛磺胆酸共转运多肽结合亲和力（KD）来评估其作用。抗病毒效果则通过检测病毒生命周期标志物（共价闭合环状DNA形成、转录及病毒组装）的抑制情况来确定。...

一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

我们提出了一种纳米光子学（量子点-荧光共振能量转移，QD-FRET）与微流控技术相结合的创新且强大的方法，用于研究聚电解质聚集体（polyplexes）的形成过程，该方法有望为未来基于核酸的治疗药物提供对聚集体更精确的控制，并实现均匀、可定制聚集体的合成。...

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测DNA纳米复合物的自组装过程

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。...

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

学习使用实时聚合酶链反应技术检测和定量乙型肝炎病毒DNA的方法。该方案具有高灵敏度和特异性，适用于临床诊断和病毒载量监测，为HBV感染研究提供可靠工具。

基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量

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