通过冰冻切片法对立体定位注射坐标的初步验证

我们的研究主要集中在探究小鼠神经连接功能障碍背后的神经环路机制，在这些研究中我们经常采用脑立体定位技术。我们的目标是优化并加速通过染料标记来验证立体定位注射位点的流程，使其成为一种简单且快速的操作步骤。通过立体定位注射病毒，病毒策略已成为神经科学研究中的关键手段。

随后通过观察组织切片中的荧光标记来确认注射位点，该过程需要数周时间才能完成。与其它技术相比，本方案具有优势，可节省三天脱水时间，并采用一种成本较低的染料以更快地识别注射位点。与不进行初步验证的方法相比，该方案可能节省数周时间。

首先将无菌外科器械放置在工作台上。使用鼻夹夹住麻醉小鼠的上门齿，并用两个耳杆固定头部，将其固定在立体定位仪中。使用眼科剪在头皮上做一个0.5厘米的切口，暴露颅骨。

用浸有3%过氧化氢的棉签擦拭暴露的颅骨，以去除骨膜。让颅骨自然干燥。将钻头安装到立体定位仪上，并调节立体定位臂的旋钮。

借助放大镜，将钻头尖端精确定位于前囟。使用 LCD 数字显示屏记录前囟处的 Z 轴数值。然后将钻头尖端移至后囟，并记录 Z 轴数值。

调整鼻夹，以尽量减小两个Z值之间的差异。将钻孔装置移至X坐标为-5.2、Y坐标为+0.8的位置，测量背腹方向的Z轴值。随后将钻孔装置重新定位至X坐标为-5.2、Y坐标为-0.8的位置，再次测量Z轴值。

将耳杆调整至指定刻度。将钻孔装置对准前囟，在LCD数字显示器上将三个坐标设置为零。根据参考坐标，将钻孔装置定位到目标区域上方。

启动钻机，通过垂直臂逐渐下移，直至钻头穿透颅骨。使用棉签清除碎屑和血液。向一个200微升离心管中加入25微升含有溴酚蓝的SDS-PAGE上样缓冲液和50微升双蒸水。

用生理盐水浸湿的棉垫覆盖颅窗。将 0.3 µL 染料吸入微量注射器中。将注射器和电动立体定位微量注射仪连接至立体定位臂。

将注射器针尖置于前囟位置，并在 LCD 数字显示屏上将坐标设为零。根据参考坐标，调整针头至目标区域。设定注射速度为 0.1 微升每分钟，启动电动微量注射器，向目标区域注入 0.3 微升染料。

10分钟后，缓慢撤出注射器。首先，将注射了溴酚蓝染料的小鼠从立体定位仪中取出。麻醉后，用胶带将小鼠固定在泡沫板上。

在右心耳处做一个1至2毫米的切口。将灌注针插入左心室。先灌注20毫升预冷的生理盐水，随后灌注20毫升冰冻的4%多聚甲醛溶液。

现在从颈部沿中线切开至鼻部，以去除皮肤并暴露颅骨。使用镊子或剪刀清除颅骨上残留的肌肉组织。将精细剪刀的一侧刀尖置于枕骨大孔与脑组织之间，刀刃锐缘朝向中线矢状缝前端的骨面。

沿正中矢状缝轻轻滑动并切开颅骨。使用镊子移除颅骨，暴露脑组织。开启旋转式切片机冷冻恒温箱后，将箱内温度设置为负20摄氏度。

加入少量组织包埋剂（OCT 化合物），使其均匀覆盖在样品盘表面。将样品盘放入冷冻室，待 OCT 完全凝固后，将样品盘固定到样品头。

然后将刀片靠近组织块，修整OCT包埋块，使其形成一个与圆盘平行的平整平面。使用剃须刀片，在脑切片模具中从注射部位向冠状方向切割脑组织。将包含注射部位的脑组织切面朝下放置在OCT的平整平面上。

将OCT包埋剂倒入脑组织上，将样本放入冷冻舱中，使组织块凝固。修切组织块直至目标区域接近，从注射位点水平切出多个切片。用预冷的小号画笔收集冠状面脑切片，放入含室温PBS的六孔板中。

使用毛笔从六孔板中拾取脑切片，并将其放置在载玻片上。绘制完成后，肉眼观察脑切片中的注射区域。