Name: 荧光微量移液器抽吸法研究红细胞机械传感 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 了解荧光微量移液器抽吸法研究红细胞机械传感机制。该方法结合荧光成像与机械刺激，揭示红细胞感知机械应力并通过钙离子通道响应的分子机制，为细胞力学生物学研究提供重要工具。

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我们感谢 Nurul Aisha Zainal Abidin 和 Laura Moldovan 在额外的供体招募、血液采集和采血支持方面提供的帮助。我们感谢 Tomas Anderson 和 Arian Nasser 在设备和试剂组织方面的工作。本研究由澳大利亚研究理事会（ARC）发现项目（DP200101970-L.A.J.）资助；澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC） Ideas 基金（APP2003904-L.A.J.）；NHMRC 设备基金-L.A.J.；新南威尔士州心血管能力建设计划（早期至中期职业研究人员基金-L.A.J.）；新南威尔士州 CVRN-VCCRI 研究创新基金；全球与研究合作办公室（悉尼-格拉斯哥合作奖-L.A.J.）提供支持。L.A.J. 是澳大利亚国家心脏基金会未来领袖研究员二级（105863）以及 Snow 医学研究基金会研究员（2022SF176）。

本方案遵循悉尼大学人类研究伦理委员会的指南，并已获得该委员会的批准。本研究已从供者处获得知情同意。
1. 人红细胞的分离
注意：第1.1步应由经过培训的采血技术人员使用已获机构审查委员会批准的方案进行操作。
<ol>
	<li>使用19 G蝶形针从肘正中静脉抽取5 mL血液。</li>
	<li>将采集的血液转移至含有1:200依诺肝素的15 mL离心管中，以防止凝血。</li>
	<li>将5 µL依诺肝素抗凝血液加入1 mL碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（C缓冲液，pH = 8.5–9；材料表）中进行稀释。</li>
	<li>将稀释后的血液样本在900 × g 条件下离心1分钟，使红细胞沉淀。小心倾去上清液，避免扰动沉淀物。</li>
	<li>用1 mL C缓冲液（材料表）对红细胞沉淀物进行两次洗涤，每次均在900 × g 条件下离心1分钟。</li>
	<li>随后，在相同离心条件下，用1 mL Tyrode's缓冲液洗涤红细胞沉淀物2次，最后将沉淀物重悬于1 mL Tyrode's缓冲液中，得到洗涤后的红细胞储备悬液。</li>
</ol>
2. 钙离子指示剂负载
<ol>
	<li>根据自动细胞计数仪（材料表）测得的细胞浓度，用 Tyrode's 缓冲液将洗涤后的红细胞悬液浓度调整至 10 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>加入 16.67 µM 的钙敏感性荧光染料 Cal-520 AM，在旋转管式混合器上振荡孵育 1 小时，以标记红细胞内的钙离子。</li>
	<li>将红细胞用含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的 Tyrode's 缓冲液按 1:50 比例稀释。此时细胞已准备好用于实验。</li>
</ol>
3. 微量移液器的制备
<ol>
	<li>将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1 mm × 内径 0.6 mm）安装到 P-1000 微量移液器拉制仪上，使用预设的拉制程序，在拉制位置生成两个尖端封闭的相应微量移液器。本实验设置采用以下拉制程序参数：加热 516，拉力 150，速度 75，时间 250，和 压力 500。 
	注意：拉制程序中设定的加热和拉制参数可根据实验设计需求进行调整12。检查点 （见 补充表 S1）。</li>
	<li>将拉制后获得的一个闭口微量移液器安装至微量移液器切割器上，打开其封闭尖端。将加热温度调节至约 50–60 °C。</li>
	<li>使用 10 倍目镜定位微量移液器。通过调节旋钮，将微量移液器移近硼硅酸盐玻璃珠。</li>
	<li>在将微量移液器尽可能靠近硼硅酸盐玻璃珠之前，将目镜更换为 30 倍，注意避免弯折移液器尖端。</li>
	<li>踩下加热踏板，利用热量软化硼硅酸盐玻璃珠。轻柔地将未处理的闭口微量移液器尖端插入软化的玻璃珠中，直至达到所需的终点，即目标开口直径。</li>
	<li>松开脚踏开关，使玻璃珠冷却。确保微量移液器尖端始终保留在玻璃珠内部。 
	注意：进一步插入尖端会导致更大的开口直径。</li>
	<li>轻柔地抽出微量移液器，使闭口微量移液器获得清晰的直线切口。确认毛细管最终直径为 1 µm。 
	​注意：检查点 （见 补充表 S1）</li>
</ol>
4. 细胞室的制备
<ol>
	<li>使用金刚石笔将一块标准的 40 mm × 22 mm × 0.17 mm 玻璃盖玻片均分为三条等宽的条带。</li>
	<li>用真空脂将其中一条切割后的玻璃盖玻片粘附于自制腔室支架的底部。 
	注意：该腔室支架由两个通过弯曲手柄连接的金属（铜/铝）方块组成。两个金属块之间的距离必须小于 40 mm，以便切割后的盖玻片能够粘附在支架上，形成平行腔室。</li>
	<li>用真空脂将第二条切割后的玻璃盖玻片粘附于自制腔室支架的顶部。 
	注意：CHECKPOINT （参见 补充表 S1）</li>
	<li>使用 200 µL 移液枪将 200 µL 标记的红细胞悬液注入两片盖玻片之间（图 1）。</li>
</ol>
<img alt="血流观察室示意图；腔室支架中盖玻片下的红细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：细胞腔室示意图。 使用凡士林将两片尺寸为 40 mm × 22 mm × 0.17 mm 的玻璃盖玻片固定在腔室支架上。在两片切割后的玻璃盖玻片之间，加入约 200 µL 悬浮于Tyrode缓冲液中的细胞溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 微吸管吸吮装置组装
<ol>
	<li>将细胞腔室安装到显微镜平台上的支架载物台上。调整位置，使细胞腔室正好位于物镜正上方（图2B）。</li>
	<li>将微移液管支架降至与其连接的储水槽液面以下。</li>
	<li>向制备好的微移液管中注入去离子水或Tyrode缓冲液，并使用连接34 G针头的注射器小心去除所有气泡（见材料表）。</li>
	<li>将微移液管支架末端拧松约一半，使液体从微移液管支架中滴出数秒钟。 
	注意：检查点 （见 补充表S1）</li>
	<li>将微移液管插入支架尖端，拧紧支架螺钉以确保微移液管固定牢固。</li>
	<li>将微移液管插入细胞腔室，在显微镜下定位微移液管和红细胞。使用显微操作器调整其位置。</li>
	<li>进一步降低微移液管尖端，确保其尖端与目标红细胞处于同一水平面。 
	注意：检查点 （见 补充表S1）</li>
	<li>通过调节储水槽的高度，将微移液管尖端的液压调至零。随后略微抬高储水槽，使尖端产生轻微的正压。</li>
</ol>
6. 进行荧光偶联的微吸管抽吸实验
<ol>
	<li>打开488 nm荧光激发光源。此阶段不要开启荧光快门，以避免光漂白图 2C开启荧光相机和透射光相机。 
	注意：两台相机均使用相应的软件进行操作（参见 材料表).</li>
	<li>设置所需的 曝光时间 (100 ms 对于本研究中的两台相机），感兴趣区域（ROI）， binning 大小（本研究中无），在软件中对两台相机进行设置。打开 多维度采集面板 设置 采集帧数，本研究为 2,000，以及保存目录。 
	注意：采集帧数取决于所需记录的吸液事件次数。对于1次吸液事件，采集次数范围应设置在100–500之间，约对应10–50秒。</li>
	<li>使用显微操作器在视野下找到微量移液器。</li>
	<li>打开气动压力夹，包括控制箱和夹紧系统（图2A）。确保 控制箱 在 EXTRNL 模式通过缓慢旋转旋钮来补偿系统内的任何偏置压力。</li>
	<li>打开控制气动夹具的独立软件。该软件配备一个电气控制面板，用于控制夹具系统的离散模拟输入。压力通过20 mV/mmHg的转换系数进行调控。</li>
	<li>将系统内的压力归零。小心地将微移液管移至红细胞附近。调节储水罐的位置，直至微移液管尖端出现轻微的正压。</li>
	<li>在相机操作软件中开始采集。打开 荧光快门.</li>
	<li>通过在控制面板中输入计算出的电压值，以达到所需压力，从而吸取红细胞。 
	注意：吸取红细胞时的压力通常在 Δ 范围内p = -5 至 -40 mmHg 微移液管尖端内应能观察到明显的舌状延伸图 2D).</li>
	<li>保持压力至预设时间；然后释放压力。</li>
	<li>移动微量移液器以吸取下一个细胞，并重复实验。</li>
</ol>
7. 荧光强度分析
<ol>
	<li>将保存的荧光图像载入分析软件中。</li>
	<li>使用显示调节选项卡调整强度阈值。可通过手动输入数值或使用滑块，确保荧光图像在分析软件中呈现清晰的细胞对比度（参见补充文件1-补充图S1）。</li>
	<li>滚动至软件底部的时间轴，定位指定的吸液事件。</li>
	<li>点击添加新表面，定义分析感兴趣区域（ROI）。 
	注意：软件提供一个引导式的五步流程，用于调整并完成分割（参见补充文件1-补充图S2和补充图S3）。 
	注意：应尽可能缩小ROI范围，以节省计算资源。</li>
	<li>使用背景减除滑块，并通过滑块调节分割阈值，以获得最佳的分割效果。 
	注意：这意味着除吸液事件外，背景应被尽可能准确地分割（参见补充文件1-补充图S4和补充图S5）。</li>
	<li>添加面积滤波器以排除背景噪声（参见补充文件1-补充图S6）。 
	注意：此步骤在后期处理阶段完成。</li>
	<li>选择统计选项卡 | 详细选项卡 | 平均值选项卡，滚动查找并选择强度均值（参见补充文件1-补充图S7）。</li>
	<li>将随时间变化的荧光信号轨迹导出为.csv文件。</li>
	<li>打开导出的csv文件，从所有测量值中减去背景信号Fb。</li>
	<li>使用公式（1）计算钙强度变化ΔFmax： 
	<img alt="用于教学的静态平衡公式 ΔFmax 方程。" src="/files/ftp_upload/66265/66265eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">     (1) 
	其中ΔFmax为最大钙强度变化，Fb为背景强度，F0为静息强度。</li>
</ol>
<img alt="用于微操作的倒置显微镜装置；红细胞分析的明场与荧光示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：荧光耦合微吸管抽吸装置。（A）fMPA 硬件系统的整体示意图，包含结合了明场和荧光相机的倒置显微镜。图像左侧展示了自制的水压计和控制盒，可用于精确调节气动压力泵的压力。（B）显微镜载物台，显示实验用细胞腔室和配备单根微吸管的微操作仪系统。（C）fMPA 系统设置的示意图。通过两个二向色镜同时成像明场（黄色）和荧光信号（蓝色发射，绿色激发），将来自荧光光源（蓝色）的光路引导至目标，再传至相机进行成像（绿色）。（D）上排显示明场图像，下排显示荧光图像。左侧为红细胞处于静息状态时微吸管抽吸前的位置；中间一列表示红细胞受到 -40 mmHg 负压时的抽吸过程；右侧显示细胞在经历负压抽吸后的形态变化。比例尺 = 5 µm。缩写：fMPA = 荧光耦合微吸管抽吸；DM = 二向色镜；RBC = 红细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

Single-Cell Mechanobiology Using Fluorescence Micropipette Aspiration

<ol><li>González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+micropipette+aspiration%3A+applications+in+cell+biomechanics%2C+models%2C+and+extended+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies.</a> Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).</li>
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<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+F-BAR+protein+CIP4+reduces+platelet+production+by+impairing+membrane-cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling.</a> Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).</li>
<li>Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-II+inhibition+and+soft+2D+matrix+maximize+multinucleation+and+cellular+projections+typical+of+platelet-producing+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).</li>
<li>Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+traverse+through+thin+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Red cell traverse through thin glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).</li>
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<li>Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+biomechanical+characteristics+of+human+red+blood+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease.</a> MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).</li>
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<li>Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf">https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370(2015).</li>
<li>Sforna, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+controls+cell+volume+and+migration+by+modulating+swelling-activated+chloride+current+through+Ca2%2B+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx.</a> Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).</li>
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<li>Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf">https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf</a> (2020).</li>
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<li>Biro, M., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Dual+pipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+studying+intercellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion.</a> Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).</li>
</ol>

作者声明，他们对本研究无任何竞争利益需要报告。

微吸管吸吮实验是一种精细的方法，通过施加显著的压力调节、精确的空间控制以及可靠的时序分辨，深入探究细胞生物力学的复杂特性。本研究特别强调使用荧光微吸管吸吮技术（fMPA）作为揭示红细胞（RBCs）在不同刺激下所展现的细微力学敏感反应的关键工具。通过同时利用明场和荧光信号，实现了对细胞现象的多维度观察，推进了对细胞内钙离子实时流入的监测与检测。该方法为理解红细胞复杂的力学感知反应提供了综合性的洞察。
重要的是，fMPA 技术的应用不仅限于红细胞，还可用于其他具有较高机械敏感性的细胞类型，如血小板和神经元9。此外，由于 fMPA 在实验操作过程中对细胞完整性影响极小，能够有效保持细胞的天然状态，因此特别适用于原代细胞的研究1。进一步地，fMPA 方法通过可调节的微吸管几何构型提供了良好的实验灵活性，可针对特定的科学问题设计多样化的实验方案，并有效探索多种力学条件。
此外，随着光学通路的改进，多荧光成像的同步使用得以增强，fMPA 系统能够在吸液过程中实时检测细胞内钙离子浓度。这一能力为研究钙相关分子（例如可感知外界机械信号的机械敏感性离子通道 PIEZO1）提供了新的机会，已有研究表明 PIEZO1 可介导并感知来自外部环境的机械刺激7,14。近期文献指出，膜张力的增加是刺激 PIEZO1 通道活性的重要因素，进而促进 Ca2+ 内流6。这凸显了 fMPA 的一项关键应用，即探究膜张力、PIEZO1 与钙离子内流之间的相互作用，有助于揭示细胞内复杂的机械感知过程。
从技术角度来看，值得指出的是，fMPA 系统的两个主要组成部分——分别负责产生吸力（机械刺激）和进行实时荧光成像——分别为气动压力泵和荧光相机。系统中泵和相机的选择应基于所研究的特定细胞类型和生物学过程。本系统所采用的泵可在 ±200 mmHg 的稳态压力范围内运行，并能响应高达 ±200 mmHg 的压力变化指令。对于 20 mmHg 的阶跃变化，压力上升时间和下降时间不应超过 6–8 ms；对于 200 mmHg 的阶跃变化，则不应超过 15–20 ms。为确保力的分辨率，HSPC 系统的噪声水平应低于 ±0.5 mmHg（峰峰值）。本实验装置满足上述要求；然而，对于该实验方案而言，±40 mmHg 的压力范围已足以引发响应15。关于荧光相机，我们选用的型号具有 95% 的量子效率和 11 µm × 11 µm 的像素尺寸芯片。这种高灵敏度的传感器配置可高效地高速捕获荧光信号。此外，在成像过程中，保持 1.6e- 的中值读出噪声对于获得足够的信噪比至关重要16。
从操作角度来看，执行 fMPA 需要具备一系列高级技能。例如，使用微电极拉制仪制作微移液管时，需要精确的技巧和灵巧性，同时对温度和位置进行细致的控制。将&#160;微移液管置于显微镜视野内&#160;需要极为细致的操作，以避免损坏微移液管尖端和细胞腔室。此外，荧光成像中一个常见的挑战是光漂白。为减轻这一问题，重要的是尽量减少样品暴露于照明系统的时间。根据“荧光偶联微移液管吸吮实验”方案，在通过相机操作软件输入所有参数且吸吮系统准备好进行实验之前，激发光源的荧光快门应保持关闭状态。只有在完成上述步骤后，才打开荧光快门以开始成像。为进一步减少光漂白，建议使用能够产生足够荧光信号的最低光源强度。
此外，目前fMPA检测所需的手动操作使得该技术劳动强度较大。因此，该检测中可能出现的不一致性主要源于操作者依赖性变量，以及纤维预热和毛细玻璃管特性差异相关的因素。未来，优化该技术的性能需要考虑潜在的串联应用。例如，当与微流控装置结合时，微吸管抽吸技术可转变为高通量平台，使实验通量从每小时约20个细胞显著提升至每小时约1,000个细胞17,18。这种整合还可提高数据的可重复性。此外，已有研究成功探索了引入自动化和图像分析系统的途径19。值得注意的是，有限元分析（FEA）是一种常用于模拟微吸管抽吸实验的计算工具。FEA能够预测细胞对机械刺激的响应，并表征其力学特性，有望用于优化微吸管设计并进一步验证实验结果19。
综上所述，fMPA 方法为红细胞在响应机械刺激时的力学敏感行为提供了有价值的见解。本研究为今后探索红细胞内及更广泛生物系统中力传导机制的复杂过程建立了基础框架。此类研究有望推动我们对这些机制的理解，并揭示其在多种生理环境中的广泛意义。

细胞行为研究领域的不断深入揭示了机械刺激（如张力、流体剪切应力、压缩力和基质刚度）在调控细胞黏附、迁移和分化等动态细胞活动中的关键作用。这些力学-生物学特性对于阐明细胞如何与其生理环境相互作用并作出响应至关重要，影响着多种生物学过程1,2。
在过去十年中，基于微移液管的吸吮实验已成为研究细胞对机械刺激多种响应的多功能工具。该技术可在单细胞水平上提供关于活细胞内在力学特性的宝贵信息，包括细胞弹性模量、刚度和皮层张力&#160;张力。这些检测方法能够测量多种力学参数，例如细胞膜&#160;张力、细胞膜所受的压力以及皮层张力（总结于 表1）。对牵引力的研究加深了我们对其如何影响细胞功能和过程的理解，特别是在膜动力学领域，包括膜的断裂、伸长和出芽3,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>力学参数</td>
			<td>描述</td>
			<td>经典研究方法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞刚度</td>
			<td>测量细胞的机械刚性和弹性。</td>
			<td>对细胞膜施加负压并分析其变形响应20,21。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>黏附强度</td>
			<td>评估细胞与表面黏附的牢固程度。</td>
			<td>施加可控吸力使黏附细胞从基底上脱离2,22。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膜张力</td>
			<td>评估细胞膜内部的张力或应力。</td>
			<td>测量细胞膜在施加压力下的变形情况23,24。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>黏弹性特性</td>
			<td>表征细胞黏性与弹性行为的综合特征。</td>
			<td>分析细胞在微管吸吮作用下随时间变化的变形响应23,25。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可变形性</td>
			<td>确定细胞形状改变的难易程度。</td>
			<td>在可控吸力下评估细胞变形的程度20,24。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>表面张力</td>
			<td>测量细胞表面的张力。</td>
			<td>评估形成微管膜突起所需的压力26。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞-材料相互作用</td>
			<td>研究细胞与材料或基底之间的相互作用。</td>
			<td>对接触不同材料的细胞进行吸吮，并观察其相互作用2,24。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞-细胞相互作用</td>
			<td>考察相邻细胞之间的相互作用。</td>
			<td>吸吮一组细胞并分析其细胞间作用力27。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：微吸管抽吸实验测定的力学参数。
基于微移液管的吸吮技术已广泛用于研究红细胞（RBCs），以评估其变形能力及多种力学特性，这对于理解红细胞在循环系统中的功能至关重要。红细胞表现出显著的适应性，在通过复杂的毛细血管网络和内皮细胞间裂隙时，能够保持其力学上的可变性5,6。在此过程中，红细胞必须穿过窄至0.5–1.0 µm的通道，承受包括张力和压缩在内的多种机械力作用7,8,9。它们对血液循环中血流产生的剪切应力也具有高度敏感性10。这些过程可促进涉及钙离子内流的调控机制的激活，而钙信号是细胞响应机械刺激的关键信号事件，其作用已有充分研究证实11,12。由钙介导的机械感知所涉及的复杂机制仍是当前研究的重要课题。
在此背景下，功能性微吸管分析法（fMPA）是一种有效的方法，可用于揭示在精确控制的机械力作用下钙离子动员的程度，同时实现机械调控（利用微吸管吸吮系统）和钙信号强度的可视化（使用荧光指示剂）。该方法特别模拟了红细胞在通过狭窄血管时的生理情境。值得注意的是，我们开发的fMPA系统能够产生分辨率为1 mmHg的压力。所采用的高速相机可实现100 ms的时间分辨率和亚微米级的空间分辨率。这些配置确保了对活细胞施加精确的机械力，并同时捕捉由此产生的细胞信号响应。此外，由于该装置具有集成化工程设计的特点，微吸管吸吮实验可方便地与其他设备或技术联用，从而进一步探究细胞力学的复杂机制。这种多功能性是该方法的另一项优势。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;经理</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>版本 2.0.0</td></tr><tr><td>1 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Terumo</td><td>210320D</td><td>与 Microfil 合作&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L型移液管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>3123000055</td><td>红细胞制备</td></tr><tr><td>22 x 40 mm 盖玻片</td><td>克尼特尔玻璃&amp;nbsp;</td><td>MS0014</td><td>细胞室组装</td></tr><tr><td>50 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Terumo</td><td>220617E</td><td>连接至水塔</td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>特赖德氏&amp;nbsp; 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最终 pH = 7.2</td></tr><tr><td>Centrifuge 5425</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5405000280</td><td>红细胞制备</td></tr><tr><td>Clexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1235820</td><td>为防止采集的血液凝固。10,000 U/mL</td></tr><tr><td>DAQami</td><td>严谨</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>CoolLED</td><td>pE-300</td><td>微流控移液管吸吮硬件系统</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Narishige</td><td>G-1</td><td>微移液管的制备</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>特赖德氏&amp;nbsp; 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，并添加 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最终 pH = 7.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>特赖德氏&amp;nbsp; 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，并添加 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最终 pH = 7.2</td></tr><tr><td>高速GigE相机</td><td>曼塔</td><td>G-040B</td><td>微流控移液管吸吮硬件系统</td></tr><tr><td>高速压力钳制</td><td>科学仪器</td><td>HSPC-2-SB</td><td>与压力泵协同工作</td></tr><tr><td>高速压力钳制载物台&amp;nbsp;</td><td>科学仪器</td><td>HSPC-2-SB</td><td>与压力泵协同工作</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>奥林巴斯&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX83</td><td>微流控移液管吸吮硬件系统</td></tr><tr><td>微丝&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>MF34G-5</td><td>34 G（67 mm 长）&lt;br/&gt; 去除切割后微移液管中的气泡，并检测移液管尖端的开口情况&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter仪器</td><td>P1000</td><td>微移液管的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Milli Q EQ 7000 超纯水净化系统</td><td>默克密理博</td><td>ZEQ7000T0C</td><td>碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 &amp;以及 Tyrode 缓冲液的配制</td></tr><tr><td>移液管微加工仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>微移液管的制备</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>特赖德氏&amp;nbsp; 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最终 pH = 7.2</td></tr><tr><td>压力泵&amp;nbsp;</td><td>科学仪器</td><td>PV-PUMP</td><td>在实验过程中施加可控压力</td></tr><tr><td>Prime 95B 相机&amp;nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B sCMOS</td><td>荧光成像</td></tr><tr><td>旋转轮远程单元&amp;nbsp;</td><td>Sensapex&amp;nbsp;</td><td>uM-RM3</td><td>微移液管位置调节控制面板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scepter 3.0 手持式细胞计数器</td><td>默克密理博</td><td>PHCC340KIT</td><td>自动细胞计数器</td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (NaHCO₃)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制——2.65 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 含 2.1 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 在250 mL的Mili Q水中 - 最终pH = 8-9。</td></tr><tr><td>碳酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;二氧化碳&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制 - 2.65 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 含 2.1 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 在250 mL的Mili Q水中 - 最终pH = 8-9。</td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>特赖德氏&amp;nbsp; 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最终 pH = 7.2</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠&lt;br/&gt; 一水合物（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>特赖奥德&amp;nbsp; 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最终 pH = 7.2</td></tr><tr><td>触摸屏控制单元&amp;nbsp;</td><td>Sensapex&amp;nbsp;</td><td>微米级张力传感细胞</td><td>微移液管位置调节控制面板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>X 干镜物镜&amp;nbsp;</td><td>奥林巴斯&amp;nbsp;</td><td>奥林巴斯 60x/0.70 LUCPlanFL</td><td>微流控移液管吸吮硬件系统</td></tr></tbody></table>

荧光微管吸吮法检测红细胞机械感知

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

微移液管吸吮实验长期以来一直是研究活细胞力学特性的基石，可揭示细胞对机械应力的响应。本文详细介绍了一种荧光偶联微移液管吸吮（fMPA）实验的创新性改进方法。fMPA实验能够在施加精确机械力的同时，实时监测由离子通道介导的活细胞力传导过程。该先进系统包含一个精密制造的硼硅酸盐玻璃微移液管，连接至一个精细调控的水浴储液器和气动吸吮系统，可实现精确控制的压力施加，调节精度高达±1 mmHg。其中一项重要改进是整合了落射荧光成像技术，可在吸吮过程中同步观察并量化细胞形态变化及细胞内钙离子通量。fMPA实验通过将落射荧光成像与微移液管吸吮技术协同结合，在机械环境复杂的条件下为细胞力感知研究设立了新标准。该多维度方法可适用于多种实验配置，为单细胞力感知机制提供关键性见解。

为了建立微管吸吮实验，我们首先构建了一个定制的细胞腔室，该腔室由两个通过手柄连接的金属方块（铜/铝）组成。将两片切去三分之一的玻璃盖玻片（40 mm × 7 mm × 0.17 mm）固定在一起，形成一个可容纳200 µL悬浮于Tyrode缓冲液中的红细胞（RBC）的腔室。将红细胞引入腔室后，将特制的硼硅酸盐微管固定在持针器上，并使用显微操作仪小心地将其置入腔室内。随后，将微管逐渐靠近以捕获目标红细胞。
在细胞吸吮实验中，采用气动高速压力钳来精确调节负压吸吮压力。随后进行荧光成像，以研究在不同负压吸吮压力下钙离子动员的情况。
通过使用fMPA研究红细胞（RBC）对不同负压抽吸力的响应，我们的研究结果表明，施加的负压与被抽吸红细胞中的钙离子内流之间存在明显的正比关系。为确定钙离子强度的变化，将单个被抽吸细胞的最大荧光强度（Fmax）减去背景强度（Fb），再除以静息状态下的荧光强度（F0）减去背景强度（Fb）。当负压从-10 mmHg逐步增加至-40 mmHg时，红细胞内钙离子的内流相应增强（图3A）至（图3D）。这表明红细胞具备感知其机械环境变化的能力，并可通过快速激活特异性的钙离子通道作出响应14,15。
<img alt="压力变化和强度图的钙流荧光成像示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：以归一化强度随时间变化的图形表示进行荧光成像。 水平方向显示红细胞在静息状态（左）和人红细胞被微移液管吸吮时的荧光快照（中）。右侧展示了红细胞在多个负吸吮压力（Δp）下被吸吮的代表性曲线。负吸吮压力逐步增加，分别为（A）Δp = -10 mmHg，（B）Δp = -20 mmHg，（C）Δp = -30 mmHg，以及（D）Δp = -40 mmHg。当红细胞舌状部分在吸吮过程中被拉长时，可观察到显著的钙离子动员，表现为Cal-520 AM信号倍数变化的增加。F/F0用于研究吸吮红细胞内部的钙离子动员。从上述曲线可以看出，Cal-520 AM信号随施加的负吸吮压力增加而呈比例上升。比例尺 = 5 µm。缩写：RBCs = 红细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 S1：fMPA 制备方案中关键步骤的检查点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supplementary%20File%20-%20Table%20S1%20-%20JoVE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：调整和执行分割的指导流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supp%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

在机械应力下探索细胞行为对于细胞力学和力学生物学的进步至关重要。我们介绍荧光微吸管抽吸（fMPA）技术，这是一种将可控的机械刺激与单细胞内信号通路的全面分析相结合的新型方法。该技术可推动活细胞力学生物学的深入研究。

微流控移液管抽吸实验长期以来一直是活细胞力学研究的基石，可提供细胞对……的响应机制的深入见解

我们的研究范围聚焦于生活方式相关的力学生物学，特别是施加机械应力条件下细胞的行为。我们正在研究单个细胞内的信号转导过程。所提出的FMPA系统利用荧光成像结合机械刺激技术。这就是抽吸压力。目前已有进一步的技术进展，尝试将微抽吸装置与微流控技术或图像分析软件等两种以上的方法结合使用。当前的实验挑战在于该装置操作较为耗时，且依赖于人工操作。由于该系统为手动操作，某些步骤会出现不一致的情况，例如纤维预热。研究结果表明，当压力从10毫米汞柱逐步增加到40毫米汞柱时，钙离子流入红细胞（RBCs）的量相应增加。这表明红细胞具有感知其机械环境变化的能力，并可通过快速的钙相关通道活动作出响应。本研究特别强调将FMPA作为一种关键工具，用于揭示红细胞（RBCs）在不同刺激下所表现出的细微机械敏感性反应。首先，将硼硅酸盐毛细管安装到P1000移液器拉制仪上。使用预设程序，加热温度设为516，拉速设为75，时间设为250，压力设为500。将一支封闭末端的微量移液管安装到微量移液管切割器上，以打开封闭的尖端。调节加热温度至约 50 至 60 摄氏度。使用 10 倍目镜定位微量移液管。使用调节旋钮将微量移液器移近硼硅酸盐玻璃珠。将目镜更换为30倍。然后将微量移液器尽可能靠近玻璃珠，但不要弯曲移液器尖端。踩下加热踏板，利用热量软化玻璃珠。将未经处理的封闭式微电极尖端轻轻插入软化的玻璃珠中，直至达到所需直径。松开脚踏开关，使玻璃珠冷却。然后轻轻取出一支直径为1微米、尖端具有清晰直线切口的微移液管。首先，使用金刚石笔将标准玻璃盖玻片分割成三条等宽的条带。用真空脂将一条盖玻片条带粘附在自制腔室支架的底部。同样，将盖玻片条的第二部分粘贴到腔室支架的顶部。接着，使用移液枪将 200 µL 标记的红细胞悬液注入两片盖玻片之间。为组装微吸管 aspiration 装置，需将细胞腔室安装在显微镜平台的支架载物台上。调整腔室的位置，直至其位于物镜正下方。现在降低持针器，使其低于连接的水储液罐的液面。将去离子水注入微移液管中。然后使用装有34号针头的注射器去除所有气泡。将显微注射针持针器末端拧松一半，使水从持针器末端滴落数秒钟。接着，将装有悬浮液的显微注射针插入持针器尖端，并拧紧持针器的固定螺丝。将微量移液器放入细胞室中，然后在显微镜下找到移液器和红细胞。降低移液器尖端，确保其与定位的红细胞处于同一水平面。调节储水罐高度，使尖端处的液压为零。随后略微抬高储水罐，产生轻微的正压。打开488纳米荧光激发光源。打开荧光相机和透射光相机。在相应软件中为两台相机输入曝光时间、兴趣区域和像素合并大小。然后在多维采集面板中将采集数量设置为2000。选择所需的保存目录。接下来，借助显微操作器定位微量移液器。打开气压压力钳，并确保控制箱处于外部模式。缓慢旋转旋钮，以补偿系统内部的任何偏移压力。启动控制气动夹具的软件。使用电气控制面板，通过20毫伏每毫米汞柱的转换系数来保持压力控制。现在将系统内的压力归零。然后小心地将微移液管移至红细胞（RBCs）附近。调节水储液器的位置，以在微移液管尖端产生轻微的正压。在相机软件中启动采集并打开荧光快门。在控制面板中输入计算出的电压值，以达到所需压力并吸住一个红细胞。保持该压力一段预设时间，然后释放压力。类似地，在进行后续分析之前，对下一个红细胞重复该实验。压力的逐步增加导致钙离子向红细胞内的动员增加。

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Research

科研

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Biology

生物学

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