荧光微管吸吮法检测红细胞机械感知

我们的研究范围聚焦于生活方式相关的力学生物学，特别是施加机械应力条件下细胞的行为。我们正在研究单个细胞内的信号转导过程。所提出的FMPA系统利用荧光成像结合机械刺激技术。

这就是抽吸压力。目前已有进一步的技术进展，尝试将微抽吸装置与微流控技术或图像分析软件等两种以上的方法结合使用。当前的实验挑战在于该装置操作较为耗时，且依赖于人工操作。

由于该系统为手动操作，某些步骤会出现不一致的情况，例如纤维预热。研究结果表明，当压力从10毫米汞柱逐步增加到40毫米汞柱时，钙离子流入红细胞（RBCs）的量相应增加。这表明红细胞具有感知其机械环境变化的能力，并可通过快速的钙相关通道活动作出响应。

本研究特别强调将FMPA作为一种关键工具，用于揭示红细胞（RBCs）在不同刺激下所表现出的细微机械敏感性反应。首先，将硼硅酸盐毛细管安装到P1000移液器拉制仪上。使用预设程序，加热温度设为516，拉速设为75，时间设为250，压力设为500。

将一支封闭末端的微量移液管安装到微量移液管切割器上，以打开封闭的尖端。调节加热温度至约 50 至 60 摄氏度。使用 10 倍目镜定位微量移液管。

使用调节旋钮将微量移液器移近硼硅酸盐玻璃珠。将目镜更换为30倍。然后将微量移液器尽可能靠近玻璃珠，但不要弯曲移液器尖端。

踩下加热踏板，利用热量软化玻璃珠。将未经处理的封闭式微电极尖端轻轻插入软化的玻璃珠中，直至达到所需直径。松开脚踏开关，使玻璃珠冷却。

然后轻轻取出一支直径为1微米、尖端具有清晰直线切口的微移液管。首先，使用金刚石笔将标准玻璃盖玻片分割成三条等宽的条带。用真空脂将一条盖玻片条带粘附在自制腔室支架的底部。

同样，将盖玻片条的第二部分粘贴到腔室支架的顶部。接着，使用移液枪将 200 µL 标记的红细胞悬液注入两片盖玻片之间。为组装微吸管 aspiration 装置，需将细胞腔室安装在显微镜平台的支架载物台上。

调整腔室的位置，直至其位于物镜正下方。现在降低持针器，使其低于连接的水储液罐的液面。将去离子水注入微移液管中。

然后使用装有34号针头的注射器去除所有气泡。将显微注射针持针器末端拧松一半，使水从持针器末端滴落数秒钟。接着，将装有悬浮液的显微注射针插入持针器尖端，并拧紧持针器的固定螺丝。

将微量移液器放入细胞室中，然后在显微镜下找到移液器和红细胞。降低移液器尖端，确保其与定位的红细胞处于同一水平面。

调节储水罐高度，使尖端处的液压为零。随后略微抬高储水罐，产生轻微的正压。打开488纳米荧光激发光源。

打开荧光相机和透射光相机。在相应软件中为两台相机输入曝光时间、兴趣区域和像素合并大小。然后在多维采集面板中将采集数量设置为2000。

选择所需的保存目录。接下来，借助显微操作器定位微量移液器。打开气压压力钳，并确保控制箱处于外部模式。

缓慢旋转旋钮，以补偿系统内部的任何偏移压力。启动控制气动夹具的软件。使用电气控制面板，通过20毫伏每毫米汞柱的转换系数来保持压力控制。

现在将系统内的压力归零。然后小心地将微移液管移至红细胞（RBCs）附近。调节水储液器的位置，以在微移液管尖端产生轻微的正压。

在相机软件中启动采集并打开荧光快门。在控制面板中输入计算出的电压值，以达到所需压力并吸住一个红细胞。保持该压力一段预设时间，然后释放压力。

类似地，在进行后续分析之前，对下一个红细胞重复该实验。压力的逐步增加导致钙离子向红细胞内的动员增加。