棘阿米巴 spp. 运动性的定量分析

我们的研究深入探讨了在自然界中人类不可避免地与棘阿米巴相遇时，棘阿米巴所表现出的自然行为。基于这一基础，我们能够推断出棘阿米巴在不同环境和表面（无论是角膜还是隐形眼镜）中的相互作用方式，从而制定针对性策略，以预防棘阿米巴角膜炎并改善隐形眼镜的卫生实践。历史上，棘阿米巴研究领域在采用遗传学和高内涵图像分析等前沿技术方面进展缓慢。

然而，目前越来越多的趋势是常规利用这些工具来揭示阿米巴感染的遗传基础，并通过高通量含量分析促进药物开发。关于棘阿米巴感染在患者体内的演化过程，仍存在诸多未解问题。我们目前的研究重点是开发用于体外模拟棘阿米巴感染的可视化和可量化工具，特别是随着三维角膜模型变得越来越易于获取。

这些模型使我们能够探究棘阿米巴在棘阿米巴角膜炎初期感染阶段以及潜在复发阶段的行为特征。首先，向T75培养瓶中加入30毫升AC6培养基。无菌操作将含有棘阿米巴的样品小瓶内容物加入培养瓶中。

将培养物在26至30摄氏度下培养三到五天，直至培养瓶达到50%至80%融合度。在需要细胞的前一天，轻轻摇动并快速敲击主培养瓶两次，以使贴壁的滋养体脱落。向一个新的T75培养瓶中加入30毫升AC6培养基。

然后将两毫升主培养物转移至锥形瓶中。在26至30摄氏度下培养18至24小时。收获前，使用设置为4倍放大倍数的显微镜目视检查滋养体群体的贴壁情况和均一性。

快速敲击锥形瓶两次，以脱落贴壁的滋养体。随后将内容物倒入50毫升的锥形管中。在500 g离心5分钟，使阿米巴形成沉淀。

弃去上清液后，将沉淀重悬于 2 至 10 毫升的 1/4 林格溶液中。涡旋振荡重悬的样品，以确保充分混匀。然后取 10 微升样品加入一次性血细胞计数板中。

计数每毫升的菌落形成单位。加入林格氏液，将阿米巴虫沉淀稀释至所需浓度。随后，将阿米巴虫接种到孔板中。

将悬浮液缓慢通过无菌铝制流动池的无菌端口加入4毫升，以接种阿米巴原虫。然后夹紧端口。开始时，将棘阿米巴菌株置于明场显微镜下观察。

在4倍放大倍数下观察变形虫，此时背景呈浅灰色，变形虫为深色。调节显微镜光源并调焦，确保变形虫呈现为实心的深色圆斑。随后设置成像软件以定期采集图像，相邻图像之间最大时间间隔不超过30秒，以实现准确追踪。

连续多天追踪变形虫，每12小时记录一次，每次记录时长为1小时，共持续5天。如果显微镜和软件支持，可利用XY坐标在单次实验中同步记录多个孔或流动池位置。如有需要，可在4倍放大倍数下将来自同一孔或流动池的多个区域图像拼接，以获得更广阔的视野。

在成像软件中打开显微镜文件。此时将显示 Bio-Formats 导入选项对话框。在该对话框中，启用堆栈视图模式。

将视图设置为选择 Hyperstack。然后在内存管理下勾选使用虚拟堆栈，并将颜色模式设置为默认。现在打开 Bio-Format 系列选项，并选择所需的系列。

然后按“确定”。导航至“图像”菜单，选择“复制”以仅复制单个孔的图像，方法是仅选择一个C通道和一个Z通道。后续操作仅在复制后的图像上进行。单击“图像”，然后选择“类型”→“8位”以转换图像。

然后选择“处理”，接着选择“减去背景”。将滚动球半径设置为10。勾选“亮背景”选项，并选择“滑动抛物面”。

现在导航至“处理”（Process），然后选择“增强对比度”（Enhanced Contrast）。针对单个滋养体，将饱和像素设置调整为0.1%；针对细胞群和聚集体，则调整为0.3%。随后依次点击“图像”（Image）、“调整”（Adjust）、“阈值”（Threshold）。

默认值大于黑白。这将打开二值化处理设置。选择默认值，并勾选二值掩膜的黑色背景。

调整阈值以最大程度减少背景噪声，同时确保每个变形虫部分可见。如果软件将颜色反转，使背景为白色而变形虫为黑色，请转到“编辑”菜单，点击“反转”，将其切换为黑色背景和白色变形虫。接下来依次点击“处理”、“二值化”和“闭合”，以连接细胞外膜上的微小间隙。

通过点击“Process”（处理）、“Binary”（二值化），然后选择“Fill Holes”（填充孔洞）来填充所有剩余的孔洞。接着使用“Shape Drawing Tool”（形状绘制工具），依次点击“Edit”（编辑）和“Fill”（填充），以去除任何非阿米巴原虫的伪影。如有必要，再次反转图像以完成最终的二值化表示。

为记录每个变形虫的大小，依次点击“Analyze”和“Analyze Particles”。然后将大小设置为10-Infinity，圆度（Circularity）设置为0到1之间，Show设置为Nothing。勾选“Only display results”和“Summarize”选项，以获得分析结果而不显示额外的图像。

将结果保存为 CSV 文件，然后依次点击“文件”、“另存为”，并选择 Tiff 格式以将图像保存为 Tiff 文件。根据需要编辑文件名。