Name: 棘阿米巴属的定量运动性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 了解如何使用显微镜和高内涵图像分析技术定量分析棘阿米巴的运动性。该方法有助于研究棘阿米巴角膜炎的发病机制并改进隐形眼镜卫生管理策略。

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本工作由 Alcon Research, LLC 资助。

1. Acanthamoeba 的制备
注意：本方案已验证适用于ATCC 50655、30872、50702、30010、30461、50370、50703、30137、PRA-115和PRA-411。该病原体属于生物安全等级2级（BSL2），应在BSL2级生物安全柜及相应实验室环境中操作。
<ol>
	<li>取一个样品小瓶或制备好的菌块，将其内容物无菌接种至装有 30 mL AC6 培养基的 T75 培养瓶中，制备主培养物20。将培养瓶在 26–30 °C 条件下培养 3–5 天，直至培养瓶底部 50% 至 80% 被细胞覆盖。</li>
	<li>在需要使用细胞的前一天进行传代，以获得均一的滋养体群体。
	<ol>
		<li>根据菌株特性，轻轻振荡并快速敲击主培养瓶 2 次，使贴壁的滋养体脱落。</li>
		<li>向一个 T75 培养瓶中加入 30 mL AC6 培养基，并接种 2 mL 主培养物进行传代。将培养瓶在 26–30 °C 条件下培养 18–24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获前，在显微镜下以 4 倍物镜观察滋养体群体，确认滋养体贴壁良好且形态均一。</li>
	<li>快速敲击培养瓶 2 次，使贴壁滋养体脱落。将瓶内液体倒入一个 50 mL 圆底离心管中。</li>
	<li>将离心管在平衡好的离心机中以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀阿米巴细胞。倾去或用移液器吸除上清培养基并弃去。用 2–10 mL 的 ¼ 林格液重悬沉淀。</li>
	<li>涡旋混匀样品。取 10 µL 样品加入一次性血细胞计数板，计数 Acanthamoeba 的 CFU/mL。</li>
	<li>根据血细胞计数板的计数结果，用 ¼ 林格液将阿米巴沉淀稀释至浓度为 7.5 × 103 个细胞/mL。</li>
	<li>将阿米巴接种至不同表面，表面材质可为玻璃、塑料或非营养琼脂，孔板形状可根据实验需求选择，如下所述：
	<ol>
		<li>96 孔板：每孔接种 200 µL Acanthamoeba 悬液，并盖上盖子。</li>
		<li>48 孔板：每孔接种 1 mL Acanthamoeba 悬液，并盖上盖子。</li>
		<li>流动池：通过无菌铝制流动池的无菌接口缓慢加入 4 mL Acanthamoeba 悬液，避免反应室内产生气泡。加样完成后封闭接口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像前，需让阿米巴在表面贴附至少 30 分钟，再开始显微记录。</li>
</ol>
2. 观察与记录 Acanthamoeba
<ol>
	<li>在明场下以 4 倍物镜放大观察变形虫。背景应呈浅灰色，变形虫应为黑色。调节光线和焦距，使变形虫呈现为实心深色圆圈而非半透明状（即略微离焦状态，图 1）。 
	注意：出于多种原因，4 倍物镜是追踪变形虫的最佳放大倍数：在追踪过程中离开或进入视野的变形虫不应纳入数据分析，因此较低放大倍数可在一定时间内使最多数量的变形虫被包含在分析中。为将变形虫转换为二值图像以进行追踪分析，其在明场下应表现为实心黑色圆圈。这一点在较低放大倍数下更容易实现，因为较高倍数会清晰显示变形虫的半透明特性和内部结构。通常情况下，较低放大倍数可在单个视野中捕获更多的变形虫，从而支持更可靠的数据分析。</li>
	<li>在成像软件中设置录制程序，以固定时间间隔拍摄图像以追踪变形虫。为实现准确追踪，图像之间的最长时间间隔为 30 秒；建议在文件大小与追踪细节之间取得平衡的时间间隔为 12 秒或 24 秒。</li>
	<li>可对变形虫进行持续数天的追踪，但需注意此类录制所产生的文件体积，以及处理极大文件时的固有困难。为避免此问题，可按特定时间间隔分段录制。例如，每 12 小时录制 1 小时，持续 5 天。</li>
	<li>若显微镜和程序允许，可利用培养板孔位或流动池多个位置的 XY 坐标，在单次实验中同时记录多个孔位。如有需要，可将同一孔位或流动池的多个区域图像拼接，以在 4 倍物镜下获得更大的视野。 
	注意：可记录位置数量的唯一限制因素是显微镜载物台在图像采集时间间隔内（例如每 12 秒、24 秒等）从一个位置移动到另一个位置的速度。然而，此功能并非必需，即使仅从单一位置生成的追踪视频仍可获得足够数量的轨迹，用于可靠的统计分析。本研究使用了 Nikon Eclipse Ti-U 显微镜，并利用其自动可移动载物台同时在多个孔位采集图像。但任何具备可编程录制功能的显微镜均可使用。显微镜必须能够连接计算机，并能将图像记录至程序或硬盘中。</li>
</ol>
3. 变形虫大小分析
<ol>
	<li>在成像软件中打开显微镜文件。将弹出Bio-formats导入选项。在对话框中，确保以下设置正确：堆栈查看；查看方式：选择-超堆栈；内存管理：勾选 使用虚拟堆栈；颜色模式：默认。</li>
	<li>确保未激活其他任何下拉菜单或复选框。单击 好的.</li>
	<li>打开生物格式系列选项。选择所需的系列。如果每次仅记录一个位置，则此处可能只有一个选项。点击 好的.</li>
	<li>选择 图像 &#62; 重复 通过仅选择一个C通道和一个Z通道，来复制当前正在操作的单个孔。</li>
	<li>从此时起，仅对复制的图像进行操作和分析，而非原始图像。选择 图像 &#62; 类型 &#62; 8位. 选择 过程 &#62; 减去背景.</li>
	<li>将滚珠设为10.0。检查 浅色背景检查 滑动抛物面.</li>
	<li>选择 过程 &#62; 增强对比度将滋养体的饱和像素设置为0.1%，细胞群和聚集体则设置为0.3%。</li>
	<li>选择 图像 &#62; 调整 &#62; 阈值（默认） &#62; B&amp;#38;W. 将打开二进制处理窗口。选择 默认，并检查 黑色背景（二值掩膜）.</li>
	<li>选择较严格的阈值，使大部分背景斑点不可见，但每只变形虫的部分区域仍可见。</li>
	<li>如果成像软件反转了图像，背景为白色，而变形虫为黑色，则执行以下操作 编辑 &#62; 倒置 将其固定在黑色背景和白色变形虫上。</li>
	<li>选择 过程&#62; 二元的 &#62; 关闭，以防细胞因失焦或细胞运动导致外膜出现微小间隙。</li>
	<li>选择 过程 &#62; 二元 &#62; 填补孔洞. 使用绘图工具去除非阿米巴类杂质 编辑 &#62; 填充如果此时背景为白色而变形虫为黑色，则选择 编辑 &#62; 倒置此时，图像应表示二值图像 图2.</li>
	<li>为记录每个变形虫的大小，选择 分析 &#62; 分析颗粒设置大小：10-无穷，圆形度：0-1，显示：无。勾选 仅显示结果并进行总结.</li>
	<li>保存出现的 CSV 文件。选择 文件 &#62; 另存为 &#62; Tiff 并根据所需规格编辑名称。</li>
</ol>
4. 用于追踪的显微镜文件制备（运动性分析）
<ol>
	<li>在成像软件中打开显微镜文件，将弹出Bio-Formats导入选项。</li>
	<li>在对话框中，确保以下设置正确：堆栈查看；查看方式：选择-超堆栈。为便于内存管理，请勾选 使用虚拟堆栈点击 好的.</li>
	<li>Bio-Formats 系列选项将打开。选择所需的系列。如果每次仅记录一个位置，则此处可能只有一个选项。点击 好的.</li>
	<li>选择 图像 &#62; 重复从此时起，仅对视频的副本部分进行操作，而非原始文件。 
	注意：复制当前正在追踪的视频片段。为此，需要知道与实验所需分钟数相对应的帧数。例如，如果要追踪第1分钟的视频st 小时，每24秒拍摄一次图像，共应有150帧st 小时。因此，1st 小时将对应第1-150帧，第2nd 小时将为151-300，依此类推。</li>
	<li>选择 图像 &#62; 类型 &#62; 8位选择 过程 &#62; 减去背景将滚珠设为10.0。</li>
	<li>检查 浅色背景检查 滑动抛物面选择 过程 &#62; 增强对比度 并将其设定为 0.1%。</li>
	<li>检查 所有 x# 切片 （例如，所有150个切片）。取消勾选 标准化选择 图像 &#62; 调节 &#62; 阈值（默认） &#62; B&amp;#38;W.</li>
	<li>二进制处理程序将打开。选择 默认. 检查 黑色背景 （二值掩膜）</li>
	<li>阈值化处理需较为激进，使大部分背景斑点不可见，但阿米巴虫的部分区域仍可见。此步骤中，若背景为白色而阿米巴虫为黑色，则选择 编辑 &#62; 倒置背景应为黑色，变形虫应为白色。</li>
	<li>选择 过程 &#62; 二元的 &#62; 关闭选择 过程 &#62; 二元的 &#62; 填补孔洞选择 文件 &#62; 另存为 &#62; Tiff 并根据所需规格编辑名称。文件现已准备就绪，可用于追踪。</li>
</ol>
5. 通过追踪分析运动性
<ol>
	<li>在需要用于追踪的 tiff 文件所对应的成像软件中，进入 Plugins &#62; Tracking &#62; Trackmate。此时将打开 Trackmate 的界面。</li>
	<li>选择 下一步。在检测器下拉菜单中选择 LoG 检测器。设置估计的斑点直径为：35.0 微米，阈值为 1.0。取消勾选 使用中值滤波 和 进行亚像素定位。</li>
	<li>在第一、中间和末尾的切片上点击 预览。确保所有阿米巴虫均被紫色圆圈标记，且背景缺陷或伪影未被包含在内。</li>
	<li>提示后选择 下一步。系统将开始处理，此步骤可能需要几分钟时间。屏幕顶部的检测进度条将显示处理完成的比例。</li>
	<li>提示后选择 下一步。在初始阈值设定中，不选择任何选项，直接再次选择 下一步。选择视图时，选择 Hyperstack 显示器，然后选择 下一步。</li>
	<li>设置斑点过滤器，并在不选择任何选项的情况下选择 下一步。选择一个追踪器；为此，请选择 LAP 追踪器（而非 Simple LAP 追踪器）。然后选择 下一步。</li>
	<li>在帧间连接设置中，将最大距离设为 40 µm。在轨迹片段间隙闭合选项中，勾选 允许间隙闭合，并将最大距离设为 100 µm，最大帧间隙设为 4。不要对轨迹片段分裂或轨迹片段合并进行任何选择。</li>
	<li>选择 下一步。追踪过程可能需要较长时间执行。完成后，窗口底部将显示“追踪完成，耗时 x 秒”。此时选择 下一步。</li>
	<li>追踪完成后再次选择 下一步。设置轨迹过滤器：在左下角点击 + 号，添加“轨迹中斑点数量”的过滤条件。将过滤器设置为“高于”，至少覆盖 93% 的帧数（例如，150 帧需至少包含 140 个斑点）。 
	注意：某些版本的软件可能需要选择相反的等效设置，例如“低于 7%”，可通过左右拖动滑块达到所需数值。</li>
	<li>选择 下一步。将出现显示选项。在保存 Trackmate XML 文件或 Tracks CSV 文件之前，请确保每一帧中的轨迹未发生形变或出现异常运动模式。</li>
	<li>若需删除某条轨迹，请点击 TrackScheme。TrackScheme 将显示所有帧中阿米巴虫的全部轨迹及其接触点。 
	注意：可能需要删除轨迹的情况包括：在记录过程中阿米巴虫移出或移入视野、轨迹形状与阿米巴虫实际路径明显不符，或根据实验参数判断该轨迹或阿米巴虫属于数据中的异常值等。</li>
	<li>点击目标阿米巴虫，使其在屏幕上以绿色高亮显示；在 Trackscheme 中，该斑点周围将出现绿色方框。这将指示需要删除的轨迹或斑点。</li>
	<li>右键点击需要删除的轨迹，选择 整条轨迹，然后按下 删除 按钮。</li>
	<li>检查完所有轨迹后，点击追踪软件弹窗左下角的 保存 按钮以保存追踪文件。使用视频名称保存 XML 文件。点击 恢复 返回追踪软件弹窗界面。</li>
	<li>点击 轨迹，并在左侧选择 轨迹。点击 导出为 CSV 并保存 CSV 文件。</li>
	<li>如果电子表格无法识别生成的 CSV 文件，请执行以下步骤：
	<ol>
		<li>在记事本中打开已保存的 CSV 文件。按 Ctrl + A 和 Ctrl + C 复制全部内容。</li>
		<li>打开电子表格软件，按 Ctrl + V 将内容粘贴进去。所有数据将位于单个单元格中。</li>
		<li>选中包含数据的单元格后，进入 数据 &#62; 分列。选择 分隔符号 &#62; 下一步，然后选择 逗号 &#62; 下一步 &#62; 完成。将此文件另存为新的 CSV 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>追踪生成的 CSV 文件将包含多个可用于分析的参数（图 3）。将所需的参数复制并粘贴到新的 CSV 文件中进行分析（图 4）。此处使用的参数描述如下：
	<ol>
		<li>总移动距离：阿米巴虫移动的总距离，单位为 µm。</li>
		<li>最大移动距离：阿米巴虫从起点出发在其路径上达到的最远距离——该点不一定是终点。 
		<img alt="方程 1" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		其中 dij 表示轨迹上任意斑点 i 到任意斑点 j 的距离。</li>
		<li>限制比：限制比反映阿米巴虫远离起点的效率：若其沿直线远离起点，则值接近 1；若其基本停留在起点附近，则值接近 0。 
		<img alt="方程 2" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq02.jpg" style="margin: auto;" /></li>
		<li>轨迹平均速度：阿米巴虫在总移动距离上的平均速度，单位为微米每秒（µm/s）。 
		<img alt="方程 3" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq03.jpg" style="margin: auto;" /></li>
		<li>轨迹位移：阿米巴虫起点与终点之间的直线距离，单位为微米（µm）。 
		注意：所有成像软件分析参数及其定义均可在此处查阅：https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/。请注意，每个保存的文件均为当时分析轨迹的汇总结果。为获得可靠的统计分析结果，需根据数据特点适当整合多个重复实验、不同时间点等的结果（图 5 和 图 6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Long-Term Tracking and Quantification of Acanthamoeba Species Motility

<ol><li>Randag, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rising+incidence+of+Acanthamoeba+keratitis%3A+A+7-year+nationwide+survey+and+clinical+assessment+of+risk+factors+and+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes.</a> PLoS One. 14 (9), e0222092(2019).</li>
<li>Szentmary, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis+-+Clinical+signs%2C+differential+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Curr+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis - Clinical signs, differential diagnosis and treatment.</a> J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).</li>
<li>Carnt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis%3A+confirmation+of+the+UK+outbreak+and+a+prospective+case-control+study+identifying+contributing+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors.</a> Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).</li>
<li>Verani, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+outbreak+of+Acanthamoeba+keratitis+associated+with+use+of+a+contact+lens+solution%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States.</a> Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).</li>
<li>Tu, E. Y., Joslin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+outbreaks+of+atypical+contact+lens-related+keratitis%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608 (2010).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISO+14729%3A2001%2FA1.+Ophthalmic+optics-Contact+lens+care+products-Microbiological+requirements+and+test+methods+for+products+and+regimens+for+hygienic+management+of+contact+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+for+Standardization%22%5BJournal%5D)">ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses.</a> International Organization for Standardization. , Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>ASC Z80, Parent Committee Meeting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf">https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf</a> (2023).</li>
<li>Rayamajhee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba%2C+an+environmental+phagocyte+enhancing+survival+and+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens.</a> Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).</li>
<li>Reverey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superdiffusion+dominates+intracellular+particle+motion+in+the+supercrowded+cytoplasm+of+pathogenic+Acanthamoeba+castellanii%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii.</a> Sci Rep. 5, 11690(2015).</li>
<li>Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+superdiffusion+of+polydisperse+vacuoles+in+highly+motile+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells.</a> J Chem Phys. 150 (14), 144901(2019).</li>
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<li>Fukaya, S., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+Acanthamoeba+castellanii+infected+with+giant+viruses+quantitatively+revealed+process+of+morphological+and+behavioral+changes+in+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells.</a> Microbiol Spectr. 9 (1), 0036821(2021).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+for+cell+and+particle+tracking+on+microscopy+images+using+algorithms+and+deep+learning+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+J%22%5BJournal%5D)">A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies.</a> Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).</li>
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<li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+time-lapse+imaging+and+single-cell+tracking+of+in+vitro+cultured+neural+stem+cells+-+Tools+for+analyzing+dynamics+of+cell+cycle%2C+migration%2C+and+lineage+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells - Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection.</a> Methods. 133, 81-90 (2018).</li>
<li>Campolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+real-time+motility+analysis+of+Acanthamoeba+reveals+sustained+movement+in+absence+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients.</a> Pathogens. 10 (8), 995(2021).</li>
<li>Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+recovery+of+Acanthamoeba+motility+among+surviving+organisms+after+contact+lens+care+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection.</a> Microorganisms. 11 (2), 299(2023).</li>
<li>Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+affecting+the+recovery+of+Acanthamoeba+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites.</a> Pathogens. 10 (2), 221(2021).</li>
<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

所有作者均为爱尔康研究中心有限责任公司员工。

能够追踪并量化棘阿米巴（Acanthamoeba）等阿米巴原虫的运动能力，对于研究这类不受低速布朗运动影响的贴壁性微生物具有重要意义9,10,&#160;可提供大量有关阿米巴行为的信息，并显著促进对阿米巴角膜炎（AK）预防方法的理解。该实验方案已在近期发表的文献中详细描述，相关数据也已通过其他类似的数据分析得到验证或整合18,19。需要指出的是，采用本方法测得的阿米巴运动速度与其它研究团队已发表的结果相近。本方案的一个显著优势在于其适用于几乎所有对光透明的表面或阿米巴处理条件；但需注意的是，尽管该方案未来可能经过修改后适用于其他生物体，但截至目前仅针对棘阿米巴（Acanthamoeba）进行了优化。上述方案在实验室中始终表现良好，但以下提供了为适应其他需求或解决困难情况而调整方法的若干建议。
确定追踪参数：在上述方案中，已列出帧间连接、间隙闭合、最大帧间隙以及每条轨迹上的点数，这些参数在近期的文献中最为常用。然而，其他参数可能更适用于不同的研究需求。此外，可能还存在其他研究者希望使用但本文未采用的参数（例如轨迹筛选器中的最大轨迹距离）。有关每个参数及其描述的更多信息，可在此网站上获取（参见参考文献21）。在确定哪些参数和筛选条件对其他实验最为相关以及如何设置时，应考虑特定项目在统计学上的合理性；例如，是否希望保留阿米巴原虫移出视野后又返回视野所产生的数据？或者，是否希望保留那些几乎未发生移动但仍被识别为轨迹的阿米巴原虫的数据？此外，还应结合图像采集时的帧数以及帧间时间间隔，思考其合理范围。
改变团块大小：我们发现，基于当前标准实验室可用的技术和软件，无论使用何种软件或显微镜设置，准确追踪随时间变化的聚集物中变形虫数量都极为困难。如果需要追踪团块的大小，并尝试将该大小与其中生物体的数量相关联，可使用经过多次实验建立的标准曲线，通过数学方法预测聚集物的大小。例如，可通过在孔中接种不同数量的变形虫（如每孔8、16、32、125、250、500、1,000和2,000个细胞）来形成聚集物。对每个孔在24小时内不同时间点生成延时图像。对每个已知细胞数量的球状体进行二维面积分析，并建立变形虫数量与球状体大小随时间变化的标准曲线。该实验至少重复三次，以获得所生成曲线的适当标准差。
确定变形虫的运动方向性：尽管在某些研究中可能并不需要此步骤，但了解变形虫的方向性仍然具有重要意义，有助于分析处理或实验对细胞趋化性的影响。这些数据可用于生成可视化（图形）和定量分析结果。可通过“趋化性与迁移分析工具”（Chemotaxis and Migration Tool）实现该功能，该工具是成像软件的一个免费插件，可在网站上获取，同时提供应用指南、示例图像和视频（参见材料表）。
详细的运动动态：其他研究团队已采用远超本文讨论范围的先进统计分析方法，对扩散动态和扩散轨迹进行了研究9,10,22。用户可根据自身需求考虑采用这些方法。
与任何成功的方法一样，本文所述方案经过多轮排错优化，以实现结果的一致性。虽然通过每秒采集一次图像（或显微镜所能达到的最快速度，可能短于一秒）可以获得高质量、可追踪的视频，但这会产生极为庞大的文件，难以处理。这种方法仅适用于持续几分钟的极短期视频录制。相反，我们发现每隔数秒采集一次图像，仍可根据该物种的运动速度有效追踪变形虫行为，并能够生成持续数小时甚至数天的可用视频。我们发现图像间最长的时间间隔为30秒，这是成像软件准确追踪变形虫所需的最长时间。用户选择时间间隔时，应综合考虑显微镜成像速度的限制、每个孔所需采集的图像数量，以及每次采集时同时记录的孔数。同样，本方案中提到的参数，如最大位移、允许的帧间断、所需的最少帧数等，均通过本实验室反复试验确定，旨在生成包含最完整变形虫轨迹的追踪数据，同时排除由不完整轨迹、视频中途进入或离开视野的变形虫，以及成像软件误判（例如两个变形虫在运动过程中相遇后分离）所导致的噪声。在长时间（数小时至数天）记录持续相互作用的微观生物体时，此类错误和不完整轨迹的数量较高是可预期的，因此必须舍弃大量错误轨迹。值得注意的是，根据本实验室的经验，方案中的“填补空洞”步骤对于减少成像软件在追踪变形虫过程中的误差至关重要。通过确保每个变形虫呈现为实心圆，而非有时出现的环状或C形，软件成功追踪每个变形虫的可能性将显著提高。
此外，如前所述，用户可用于分析图像或视频的参数有很多。根据实验需求，我们始终发现分析总移动距离、最大距离、速度和位移这四个参数带来的益处最大。这些参数已在先前的出版物中进行了深入讨论（包括使用不同菌株和不同表面的情况），并配有图示解释18,19。这四个参数使用户能够推断变形虫沿直线移动的能力及其所需时间，从而有助于理解其与隐形眼镜污染相关的行为特征。获取并分析这些参数是一项繁重的工作，如本文图示所示。在处理来自成像软件输出的大量且多样的电子表格时，我们通过创建具有自动计算所有必要分析结果功能的锁定式电子表格模板，来减少无意错误的发生。然而，对该方法可能的改进方向是编写一个能够处理、分类和分析此类数据的脚本程序。
综上所述，本文介绍了一种可在多种不同条件下简便且准确地测量Acanthamoeba大小和运动能力的方法。我们已证明该方法适用于多种不同的阿米巴菌株，并指出尽管获取运动性信息可能存在简单的参数，但该实验设置可根据任何特定需求进行高度定制。

Acanthamoeba 研究近年来显著增加，主要原因在于 Acanthamoeba 角膜炎（AK）的发病率不断上升，这是一种由 Acanthamoeba 附着于角膜后引发的寄生虫感染1。尽管 AK 疫情暴发可归因于不当的隐形眼镜护理或低效的隐形眼镜护理液2,3,4,5，但目前市场上尚无任何产品被强制要求证明其对 Acanthamoeba 具有消毒功效。然而，科学界及标准制定机构正在积极努力，以评估用于量化隐形眼镜护理产品消毒效果所必需的实验方案6,7。此外，由于 Acanthamoeba 在细胞结构和功能方面与人类巨噬细胞具有相似性，除其自身致病性外，还被认为在携带和传播其他人类病原体方面具有重要作用8。
近年来已有研究描述了能够定量分析Acanthamoeba运动能力的技术——该原虫通常不易受布朗运动影响9,10，可用于评估其致细胞病变效应或在电场暴露不足条件下的行为9,11，以及利用Acanthamoeba作为可追踪的病毒载体在巨型病毒研究中推进运动性分析的进展12,13。在过去20年中，随着新型软件（如本研究所用成像软件）、新算法及深度学习技术的发展，细胞与颗粒追踪技术也持续取得显著进步14。然而，针对台式实验研究、临床应用及工业标准而言，该领域仍属相对新兴且不断发展的方向，目前关于可视化并追踪该阿米巴原虫的方法学报道仍十分有限，尤其是用于量化其在黏附隐形眼镜后、或在隐形眼镜消毒过程中及之后行为变化的研究尤为缺乏。其他致力于长期视觉监测的领域为此类研究提供了支持15,16,17。由于Acanthamoeba本身具有诸多挑战性特征——包括对质粒普遍具有抗性（而质粒可赋予荧光标记）、阿米巴能够摄取并破坏常规细胞染料，以及其独特的外层蛋白质结构导致抗体标记困难——使得其他细胞常用的、可在明场成像以外条件下实现可视化的技术在该生物体中无法应用。因此，对这种阿米巴运动能力的定量分析已显著推动了该领域的发展。通过本研究所述方法，我们已确认阿米巴在无营养条件下仍可保持运动能力至少12小时18，且经消毒处理后运动能力暂时丧失的阿米巴，只要未被完全裂解，便可在消毒结束后恢复其运动性19。
本方案详细介绍了如何在显微镜下直观追踪并定量分析变形虫的运动能力。主要步骤包括：在明场条件下以适当的焦距和图像采集时间间隔记录变形虫的运动；利用图像处理软件将图像转换为二值图像；然后使用图像软件的追踪插件设定实验参数，逐个追踪每只变形虫，以获取速度、移动距离和限制性等所需测量参数。在此基础上，可进一步定量分析单个变形虫或变形虫群体的趋化性，以确定其运动方向性。该方法的关键贡献在于能够可视化并量化变形虫在不同营养支持状态、表面黏附性、消毒剂刺激或与其他环境变化（如与哺乳动物细胞共培养）条件下的行为表现。

<table><tbody><tr><td>&amp;frac14; Ringer&amp;rsquo;s 溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BR0052G</td><td>Oxoid Ringers 溶液片剂。按说明配制四分之一浓度而非全浓度 Ringers 溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf Research</td><td>3123000039</td><td>2 &amp;micro;L–20 &amp;micro;L 单通道</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Neptune Scientific, San Diego, CA, USA</td><td>BT10.N</td><td>10 &amp;micro;L 通用屏障吸头</td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Millipore Sigma,&amp;nbsp;</td><td>CLS3548</td><td>Corning Costar 细胞培养处理多孔板：聚苯乙烯板，平底孔，无菌，带盖</td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管（每个样品 1 支，每传代 2 次的样品 1 支）</td><td>Fisher Scientific</td><td>Falcon 352098</td><td>Falcon 50 mL 高透明度圆底离心管，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>CLS3596</td><td>Corning Costar 细胞培养处理多孔板：聚苯乙烯板，平底孔，无菌，带盖</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Acanthamoeba&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC 30461</td><td>本实验方案已验证适用于 ATCC 50655、30872、50702、30010、30461、50370、50703、30137、PRA-115 和 PRA-411</td></tr><tr><td>无菌培养基（AC6）</td><td>实验室自配</td><td>n/a</td><td>每升去离子蒸馏水中含 20 g 生物蛋白胨、5 g 葡萄糖、0.3 g KH2PO4、10 &amp;micro;g 维生素 B12 和 1 玻璃5 mg&amp;nbsp;L-甲硫氨酸。用 1 M NaOH 调节 pH 至 6.6–6.95，121 &amp;deg;C 高压灭菌 20 分钟，室温保存不超过 3 个月。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心机及相应转子</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Sorvall ST 40R</td><td>任何可离心 50 mL 圆底离心管、500 × g 离心 5 分钟的等效离心机和转子均可接受</td></tr><tr><td>趋化性与迁移分析工具</td><td></td><td></td><td>基于 ImageJ 的免费软件，可从 https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html 获取</td></tr><tr><td>一次性血细胞计数板</td><td>Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA</td><td>DHC-N01</td><td>Neubauer 改良型双计数室一次性血细胞计数板，独立包装，无热原</td></tr><tr><td>ImageJ 软件（含 Trackmate 插件，本实验方案基于 Trackmate 版本 6.0.2）</td><td></td><td></td><td>美国国立卫生研究院开发的免费软件，可从 imagej.net 获取。Trackmate 插件可从 https://imagej.net/plugins/trackmate/ 下载</td></tr><tr><td>显微镜，建议配备自动移动载物台</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td></td><td>本研究使用 Nikon Eclipse Ti-U 显微镜，并利用自动移动载物台实现同时在多个孔中采集图像。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NIS-Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刻度移液管</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>BrandTech 26331</td><td>BrandTech accu-jet pro 移液控制器</td></tr><tr><td>刻度移液管吸头</td><td>VWR</td><td>5 mL: 76201-710&lt;br/&gt; 10 mL: 170356&lt;br/&gt; 25 mL: 89130-900&lt;br/&gt; 50 mL: 75816-088</td><td>VWR 刻度移液管，无热原</td></tr><tr><td>无菌铝制透射式流动池</td><td>Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA</td><td>FC 81-AL</td><td>阳极氧化铝单通道透射式流动池，适配 96 孔板尺寸，用于倒置显微镜</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>734-2316</td><td>VWR 组织培养瓶，182.5 cm²，表面处理，插口密封盖，无菌</td></tr></tbody></table>

棘阿米巴 spp. 运动性的定量分析

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba 角膜炎是一种严重的感染性眼病，治疗困难，可能导致失明。尽管这种病原体分布广泛，且在接触水后可能污染隐形眼镜，但其自然行为仍不明确。了解 Acanthamoeba 的运动模式有助于揭示其如何在隐形眼镜上定植并污染患者角膜。幸运的是，Acanthamoeba spp. 在4倍明场显微镜下即可被观察到。此前已有技术用于量化 Acanthamoeba 的运动性，例如结合细胞病变效应或在电场暴露不足条件下的研究。本文介绍一种可长期（数小时至数天）追踪并量化 Acanthamoeba spp. 运动性的方法，该方案适用于多种阿米巴菌株、不同表面以及不同营养状态的阿米巴。该实验流程可用于获取多种核心运动参数，如移动距离、速度、限制性及方向性，这些参数对于监测感染、增殖或行为变化的不同阶段至关重要。

要成功使用此方法，需考虑几个关键的总体要素。首先是变形虫与显微镜的物理设置，其次是成像软件的正确使用，第三是以有意义的方式导出和分析成像数据。
在开始显微记录之前，必须确保变形虫在显微镜载物台上已正确聚焦（图1）。此时不应将变形虫调整至最清晰的Z平面以观察其细节，而应使其略微失焦，从而呈现为实心黑色圆点，而非在清晰状态下所见的半透明形态。采用这种方式观察，可在图像文件转换为二值图像时，使成像软件和追踪软件更轻松地识别每一个变形虫（图2）。了解成像软件的目标——即每个变形虫应显示为边界清晰的白色圆形，有助于读者在明场下拍摄原始图像时找到合适的焦平面。当每个圆形轮廓清晰后，追踪软件便能够准确追踪每个变形虫的运动，并获取其各自的运动参数。
在按照上述协议中关于成像软件和追踪软件的逐步操作说明，并参考相关视频以协助完成成像软件使用的关键初始步骤后，现在可以导出成像软件的数据以进行定量和数据分析。追踪软件生成的原始输出将类似于图3所示内容。此时，重要的是要检查导出轨迹中的斑点数量是否符合预期要求（例如，若设定每条轨迹中需包含93%的帧数，且视频总帧数为100帧，则每条导出的轨迹应包含不少于93个斑点）。如果斑点数量不符合要求，则可能需要返回追踪软件的操作步骤，确认相关参数是否已正确设置。
从原始导出数据开始构建数据分析表（图4）。需要牢记的是，每条轨迹代表一个重复实验中的单个变形虫。因此，如图4、图5和图6所示，必须对每帧集合或时间点的所有轨迹进行平均（图4），并且该过程需针对整个序列中的每一帧集合或时间点重复进行（例如，若总共采集了3小时的视频数据，并按小时划分数据点，则每个重复实验将包含三个帧集合/小时用于分析，图5）。最后，将每个重复实验中各帧集合的平均数据进一步整合到同一空间中，以便对多个重复实验的数据进行综合分析，从而确定每个时间点的真实平均值和标准差（图6）。
每个重复组的平均值将用于数据分析，所有重复组的合并平均值及标准差或标准误将用于图表展示（如图7中的示例所示）。如果按照本文所述的方式分析数据，即对多个样本在多个时间点进行追踪，最合适的方法是采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated measures ANOVA），并结合事后Tukey检验。该方法可帮助我们确定每个时间点不同样本之间的差异，同时也能评估每个样本随时间变化的差异。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg" /> 
图1：在明场显微镜下，变形虫呈现为不透明的暗色形态。4倍放大倍数下变形虫的代表性放大图像，略微失焦以呈现为实心暗色圆圈。比例尺 = 500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg" /> 
图2：通过明场显微镜成像的变形虫经二值化处理并实现追踪。4倍放大倍数下的变形虫明场图像（左），经处理后去除伪影并转换为二值图像（中），以及追踪后显示部分轨迹的结果（右）。上排：通过拼接4幅图像获得的完整孔板图像，比例尺 = 1000 µm。下排：拼接前单幅图像的范围，比例尺 = 500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg" /> 
图3：成像与追踪软件的即时数据分析输出包含多种类型的数据。 追踪分析的代表性输出如图2所示，该图为单个视频。注意轨迹编号（红色箭头）存在跳号现象，表明追踪软件已正确剔除不符合参数设定的轨迹。在此示例中，共识别出5385条轨迹，但仅有71条符合设定参数。鉴于参数设定较为严格，该比例属正常范围。此轨迹数量也与本实验方案所用的阿米巴数量相符（例如，若在96孔板中每孔接种200 µL、浓度为7.5 x 103 CFU/mL的阿米巴，则每孔预计约有1,500个阿米巴，而在4拼接视野中可见的数量也大致相当。由于阿米巴会进出视野范围，从而产生新的轨迹，因此轨迹总数通常会多于实际阿米巴数量）。这一轨迹数量在图2中再次得到体现，图中可见的轨迹数量远少于斑点数量。请始终检查轨迹中的斑点数量（红色框），以确保仅包含符合要求的轨迹长度。例如，本例中我们纳入了超过93%的帧，该片段共包含127帧，因此所有轨迹的斑点数量均应高于118。以黄色高亮显示的是本实验方案中提及的各项测量参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg" /> 
图4：根据初始数据输出结果按需重新整理数据。 导出后所需数据的组织方式。A) 从追踪软件导出的数据中复制了用于量化的相关测量值（图3）并粘贴到新的电子表格中。(B在将所需测量数据整理至新电子表格后，应计算每条轨迹的平均值。因此，在此代表性示例中，该单个视频中所有可用轨迹的总移动距离、最大移动距离、限制性系数、平均速度和位移均已分别计算为每个测量参数的单一数值。需再次注意，共有71条轨迹符合第1至127帧的参数要求。由于各视频或帧集合的分析结果不同，符合条件的轨迹数量可能各异，这一点在后续结果中显而易见。 图5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg" /> 
图5：用于分析整套图像序列或视频的连续帧分段设置。 本图展示了将连续视频添加至数据分析的代表性示例。假设第1–127帧构成视频的第一个小时（此处1小时为每28秒采集一次图像所得），第128–254帧为视频的第二小时，第255–381帧为视频的第三小时。将所有小时段导出的数据（如图3中所示导出）合并至同一工作表中，以便统一处理。如同在图4中所进行的操作，每个帧集合/小时所有可用轨迹的数据将被取平均值。图5中的所有数据均来自一个重复实验或一个样本。若有3个重复实验，则将有3个布局完全相同的独立工作表标签页，这些数据将被整合至一个新的标签页中，如图6所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg" /> 
图6：来自每组图像帧中所有变形虫的合并数据，用于表示一个重复样本。（A）需要将图5中每组图像帧的所有平均值汇总到一个中心位置，以便完成最终的数据分析。在此代表性图像中，显示了前三个图像帧组（或小时）的总距离平均值。此过程必须针对每个正在运行的样本/条件/重复样本重复进行。然后，需对每个图像帧组中各样本的平均值再次取平均（黄色框）。该值即为最终数据点，可据此计算标准差和标准误。每个样本在各图像帧组中的单个平均值（此处，总距离样本1对应B3、B4和B5中的数值；总距离样本2对应C3、C4和C5中的数值，依此类推）将用于进行统计分析。此过程需对所有必需的测量参数重复进行（最大距离、限制性、平均速度、位移等）。（B）为量化结果生成图形表示时，使用黄色框中的数值作为最终图表的数据点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg" /> 
图7：ATCC 30461 和 ATCC 50370 的原始运动性数据。 原始数据（此处以每小时的均值 ± 标准误表示）为先前研究中收集但未发表的数据18,19。该运动性定量结果表明，这两种变形虫在玻璃表面的¼林格液中，前6小时的运动行为相似（通过每小时内移动的总距离，单位为微米来衡量）。每个时间点包含三个独立的重复实验，每个重复由20–200条变形虫轨迹组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案描述了如何对Acanthamoeba spp.的运动性进行可视化、追踪和定量分析。

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我们的研究深入探讨了在自然界中人类不可避免地与棘阿米巴相遇时，棘阿米巴所表现出的自然行为。基于这一基础，我们能够推断出棘阿米巴在不同环境和表面（无论是角膜还是隐形眼镜）中的相互作用方式，从而制定针对性策略，以预防棘阿米巴角膜炎并改善隐形眼镜的卫生实践。历史上，棘阿米巴研究领域在采用遗传学和高内涵图像分析等前沿技术方面进展缓慢。然而，目前越来越多的趋势是常规利用这些工具来揭示阿米巴感染的遗传基础，并通过高通量含量分析促进药物开发。关于棘阿米巴感染在患者体内的演化过程，仍存在诸多未解问题。我们目前的研究重点是开发用于体外模拟棘阿米巴感染的可视化和可量化工具，特别是随着三维角膜模型变得越来越易于获取。这些模型使我们能够探究棘阿米巴在棘阿米巴角膜炎初期感染阶段以及潜在复发阶段的行为特征。首先，向T75培养瓶中加入30毫升AC6培养基。无菌操作将含有棘阿米巴的样品小瓶内容物加入培养瓶中。将培养物在26至30摄氏度下培养三到五天，直至培养瓶达到50%至80%融合度。在需要细胞的前一天，轻轻摇动并快速敲击主培养瓶两次，以使贴壁的滋养体脱落。向一个新的T75培养瓶中加入30毫升AC6培养基。然后将两毫升主培养物转移至锥形瓶中。在26至30摄氏度下培养18至24小时。收获前，使用设置为4倍放大倍数的显微镜目视检查滋养体群体的贴壁情况和均一性。快速敲击锥形瓶两次，以脱落贴壁的滋养体。随后将内容物倒入50毫升的锥形管中。在500 g离心5分钟，使阿米巴形成沉淀。弃去上清液后，将沉淀重悬于 2 至 10 毫升的 1/4 林格溶液中。涡旋振荡重悬的样品，以确保充分混匀。然后取 10 微升样品加入一次性血细胞计数板中。计数每毫升的菌落形成单位。加入林格氏液，将阿米巴虫沉淀稀释至所需浓度。随后，将阿米巴虫接种到孔板中。将悬浮液缓慢通过无菌铝制流动池的无菌端口加入4毫升，以接种阿米巴原虫。然后夹紧端口。开始时，将棘阿米巴菌株置于明场显微镜下观察。在4倍放大倍数下观察变形虫，此时背景呈浅灰色，变形虫为深色。调节显微镜光源并调焦，确保变形虫呈现为实心的深色圆斑。随后设置成像软件以定期采集图像，相邻图像之间最大时间间隔不超过30秒，以实现准确追踪。连续多天追踪变形虫，每12小时记录一次，每次记录时长为1小时，共持续5天。如果显微镜和软件支持，可利用XY坐标在单次实验中同步记录多个孔或流动池位置。如有需要，可在4倍放大倍数下将来自同一孔或流动池的多个区域图像拼接，以获得更广阔的视野。在成像软件中打开显微镜文件。此时将显示 Bio-Formats 导入选项对话框。在该对话框中，启用堆栈视图模式。将视图设置为选择 Hyperstack。然后在内存管理下勾选使用虚拟堆栈，并将颜色模式设置为默认。现在打开 Bio-Format 系列选项，并选择所需的系列。然后按“确定”。导航至“图像”菜单，选择“复制”以仅复制单个孔的图像，方法是仅选择一个C通道和一个Z通道。后续操作仅在复制后的图像上进行。单击“图像”，然后选择“类型”→“8位”以转换图像。然后选择“处理”，接着选择“减去背景”。将滚动球半径设置为10。勾选“亮背景”选项，并选择“滑动抛物面”。现在导航至“处理”（Process），然后选择“增强对比度”（Enhanced Contrast）。针对单个滋养体，将饱和像素设置调整为0.1%；针对细胞群和聚集体，则调整为0.3%。随后依次点击“图像”（Image）、“调整”（Adjust）、“阈值”（Threshold）。默认值大于黑白。这将打开二值化处理设置。选择默认值，并勾选二值掩膜的黑色背景。调整阈值以最大程度减少背景噪声，同时确保每个变形虫部分可见。如果软件将颜色反转，使背景为白色而变形虫为黑色，请转到“编辑”菜单，点击“反转”，将其切换为黑色背景和白色变形虫。接下来依次点击“处理”、“二值化”和“闭合”，以连接细胞外膜上的微小间隙。通过点击“Process”（处理）、“Binary”（二值化），然后选择“Fill Holes”（填充孔洞）来填充所有剩余的孔洞。接着使用“Shape Drawing Tool”（形状绘制工具），依次点击“Edit”（编辑）和“Fill”（填充），以去除任何非阿米巴原虫的伪影。如有必要，再次反转图像以完成最终的二值化表示。为记录每个变形虫的大小，依次点击“Analyze”和“Analyze Particles”。然后将大小设置为10-Infinity，圆度（Circularity）设置为0到1之间，Show设置为Nothing。勾选“Only display results”和“Summarize”选项，以获得分析结果而不显示额外的图像。将结果保存为 CSV 文件，然后依次点击“文件”、“另存为”，并选择 Tiff 格式以将图像保存为 Tiff 文件。根据需要编辑文件名。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8...

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

本方案描述了如何使用市售蛋白质组分在微珠表面产生肌动蛋白彗尾结构。此类系统可模拟细胞中的突出结构，能够以简化的方式研究力生成的生理机制。...

使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

本方案介绍了一种快速高效的方法，用于鉴定铜绿假单胞菌中参与多种运动类型的遗传因子。...

高通量观察运动表型的方法 铜绿假单胞菌

了解如何使用显微镜和高内涵图像分析技术定量分析棘阿米巴的运动性。该方法有助于研究棘阿米巴角膜炎的发病机制并改进隐形眼镜卫生管理策略。

棘阿米巴 spp. 运动性的定量分析

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