利用FRET技术评估活细胞中内在无序区域对高渗应激的结构敏感性
2024年1月12日
内在无序区域（IDRs）是一类能够响应环境变化而改变其构象的柔性蛋白质结构域。集合荧光共振能量转移（FRET）可用于在不同条件下估算蛋白质的尺寸。本文介绍了一种FRET方法，用于评估在高渗胁迫下活体酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中IDR的结构敏感性。
我们的目标是理解内在无序区域如何感知并响应环境理化性质的变化。我们结合生物物理、生物化学、遗传学和细胞生物学技术，监测无序区域在活细胞中结构集合的变化。目前，蛋白质生物物理技术被用于研究内在无序区域（IDRs）的构象。
这些技术包括核磁共振、圆二色光谱、小角X射线散射以及荧光共振能量转移。其中大多数技术仅可用于体外实验。在细胞环境中研究内在无序区（IDRs）的构象具有挑战性，相关技术成本高昂且耗时较长。
我们提供了一种克服这些挑战的替代方法。本方案能够以简便、快速且可重复的方式监测IDR的构象，从而补充其他体外研究方法。我们的研究结果揭示了在应激条件下IDR结构敏感性背后的分子机制。
这使得无序区域可作为体细胞生物传感器。对细胞环境的精确追踪将有助于更深入地理解光的基本过程。我们的研究引发了关于内在无序区域结构敏感性决定因素的问题。
其与IDR功能的相关性以及影响这些敏感性的环境因素。首先，在30摄氏度下，将选定的酵母转化子在3毫升SD尿嘧啶缺陷培养基中培养至饱和。在600纳米处测定培养物的光密度。
将2毫升过夜培养物在室温下以14,000 G离心。用移液器吸出上清液。用1毫升MES缓冲液重悬沉淀。
在室温下以 14,000 G 离心混合物。然后，移除上清液。再次用 MES 缓冲液洗涤细胞后，将细胞重悬于 2 毫升 MES 缓冲液中。
然后将全部体积倒入试剂储液槽中。接下来，设置酶标仪。点击管理的方案图标，然后将检测类型设置为荧光强度，读数模式设置为光谱扫描。
输入微孔板名称为 Granier 96 F-bottom，并设置底部光学模式。通过选择“发射光扫描设置”进入光学参数设置界面。将激发波长调整为 433 纳米，激发带宽设为 10 纳米。
将发射波长范围设置为460纳米至550纳米，发射带宽为10纳米，步长为1纳米。设定时间为0.1秒。现在，在96孔黑色透明底板的孔中配制不同浓度的氯化钠溶液。
将150微升MES缓冲液加入A行前三孔中。然后，从左至右依次加入150微升相应且浓度递增的渗透剂溶液。使用12通道微量移液器反复吹打洗涤后的酵母悬浮液，随后将50微升细胞悬浮液转移至各孔中。
反复吹打各孔中的溶液，确保充分混匀。立即测定荧光强度发射光谱。观察屏幕上显示的荧光发射光谱。
IDR 融合蛋白表现出 M Saru 三和 花青素发射光谱的组合。对于 AT Leah 45，高渗应激导致受体荧光强度增加，同时供体荧光强度降低。这种现象在白蛋白融合蛋白中未观察到。
概述
本研究探讨了蛋白质中内在无序区域（IDRs）在环境变化下的响应机制，特别是在活体酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞经受高渗胁迫条件下的行为。通过使用群体荧光共振能量转移（FRET）技术，研究评估了IDRs的结构敏感性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 细胞生物学
- 蛋白质化学
背景
- 内在无序区域（IDRs）是具有柔性的蛋白质结构域。
- 理解IDR的行为对于揭示蛋白质功能至关重要。
- 研究IDR的传统技术通常局限于体外条件。
- 细胞环境为IDR分析带来了独特的挑战。
研究目的
- 探究内在无序区（IDRs）如何感知其环境变化。
- 评估内在无序区（IDRs）在活细胞中的结构变化。
- 利用FRET技术对内在无序区（IDRs）进行实时分析。
使用的方法
- 群体荧光共振能量转移（FRET）。
- 包括核磁共振和圆二色光谱在内的生物物理技术。
- 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的遗传操作。
- 用于监测结构变化的细胞生物学技术。
主要结果
- 荧光共振能量转移（FRET）可有效测量内在无序区（IDR）在高渗胁迫下的尺寸。
- 内在无序区（IDR）的结构集合在不同环境条件下表现出显著变化。
- 该研究揭示了内在无序区（IDR）的灵活性与适应性。
- 研究结果强调了在细胞环境中研究内在无序区（IDR）的重要性。
结论
- FRET 是研究活细胞中内在无序区域（IDRs）的有力工具。
- 了解 IDR 的行为有助于阐明更广泛的生物学过程。
- 该发现增进了人们对蛋白质在应激条件下动态特性的认识。
常见问题
行业重要性概述
量化内在无序区域（IDRs）在高渗胁迫下的结构敏感性，有助于弥补当前对活细胞中蛋白质行为认知的关键空白。这种基于FRET的方法能够预测IDRs对环境扰动的响应，为早期靶点验证和机制性风险评估提供依据。该方法通过提供可重复、定量的IDR构象动态信息，支持与细胞应激反应相关的研究决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在应激条件下直接检测活细胞中IDR的构象变化。
- 通过揭示蛋白质结构域对环境的敏感性，支持作用机制的去风险化研究。
- 通过定量FRET测量，促进功能靶点的验证。
- 提高在复杂细胞环境中对IDR相关靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复、可扩展的工作流程，用于在高通量条件下监测IDR结构。
- 标准化定量读数，以实现不同IDR构建体之间的比较分析。
- 建立经过验证的生物系统，用于下游筛选调节剂或应激因子。
- 实现对化合物在IDR构象状态上作用的可靠评估。
转化与临床前研究
- 在适用情况下，将IDR结构敏感性与疾病相关的细胞应激模型相匹配。
- 通过在活细胞中追踪IDR响应，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 为靶向IDR项目的风险调整推进决策提供依据。
- 提供机制性见解，可指导转化生物标志物的开发。
流程与工作流整合
这种基于FRET的方法可融入从早期假设验证到临床前模型确证的整个发现过程，能够在生理相关应激条件下对IDR行为进行稳健评估。
- 发现生物学：支持对内在无序区（IDR）环境敏感性及通路参与的假设验证。
- 筛选：提供标准化、定量的FRET输出，用于评估检测方法的准备性和可重复性。
- 分析：提供经过处理的荧光测量数据，便于直接比较不同IDR构建体及其应激反应。
- 转化研究：将IDR构象变化与细胞应激适应相联系，支持临床前研究的连续性。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，用于在不同项目中评估多种IDR及应激条件。
运营与企业影响
- 科学价值：提高针对内在无序区（IDR）研究的预测可信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：在活细胞中提供标准化、可重复且可扩展的测量结果。
- 战略价值：通过明确IDR在应激条件下的功能相关性，指导项目推进或终止决策及资本配置。
- 组合影响：基于定量的结构敏感性数据，实现对以IDR为重点的资产进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备FRET、荧光光谱学以及酵母细胞操作方面的专业知识。
- 需要配备具有光谱扫描功能和适当荧光滤光片的微孔板读板仪。
- 要求跨团队对样品制备和数据处理脚本进行标准化。
- 可能需要根据不同的细胞类型或IDR构建体以及具体的生物学背景进行调整。
- 仅适用于可进行FRET标记且与酵母表达系统兼容的IDR。
