Name: 基底膜基质用于人类干细胞维持和肠道类器官生成的比较研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 探索体外与计算模型整合用于药物发现的方法，结合干细胞技术、类器官和微流控技术。该方案优化了无动物源水凝胶系统中类器官的生成与维持，为疾病建模和药物测试提供更准确的体外模型。

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作者感谢Christina Pacak博士、Silveli Susuki-Hatano博士和Russell D'Souza博士在启动hiPSC和类器官研究方面提供的前期培训和一般性建议。他们感谢Chelsey Simmons博士在使用水凝胶系统方面的指导 体外 细胞培养工作。此外，作者感谢STEMCELL Technologies公司的Christine Rodriguez博士和Thomas Allison博士在hiPSC培养方面的指导。作者还感谢TheWell Bioscience公司承担了出版费用。

Matrix Comparison for Efficient Human Intestinal Organoid Generation from iPSCs

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Bidirectional%2C+allosteric+signaling+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).</li>
<li>Hinz, B., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis%3A+Recent+advances+in+myofibroblast+biology+and+new+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives.</a> F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).</li>
<li>Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+modulates+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer.</a> EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).</li>
<li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis%3A+A+dynamic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li>
<li>Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+control+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix control of stem cell fate.</a> Cell. 126 (4), 645-647 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Tran, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+extracellular+matrix+directs+trans-differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+and+formation+of+salivary+gland-like+organoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+drives+deterministic+organoid+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry drives deterministic organoid patterning.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+extracellular+matrix+for+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Engineering the extracellular matrix for organoid culture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Matrigel+and+gelatin+substrata+for+feeder-free+culture+of+undifferentiated+mouse+embryonic+stem+cells+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing.</a> Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).</li>
<li>Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf</a> (2024).</li>
<li>biotechne R&D Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultrex+Stem+Cell+Qualified+Reduced+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22biotechne+R%26D+Systems%22%5BJournal%5D)">Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor.</a> biotechne R&D Systems. , (2024).</li>
<li>VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thewellbio.com/video-protocols">https://www.thewellbio.com/video-protocols</a> (2024).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Henderson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+human+embryos+and+embryonic+stem+cells+show+comparable+expression+of+stage-specific+embryonic+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens.</a> Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).</li>
<li>Haruna, N. F., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dynamic+biophysical+properties+of+a+tunable+hydrogel+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol+Tissue+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture.</a> J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+VitroGel+ORGANOID-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Stewart, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+intestinal+stiffness+and+associations+with+fibrosis+in+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease.</a> PLoS One. 13, e0200377(2018).</li>
<li>Hernandez-Gordillo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+synthetic+matrices+for+in+vitro+culture+of+primary+human+intestinal+enteroids+and+endometrial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids.</a> Biomaterials. 254, 120125(2020).</li>
<li>Broguiere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+epithelial+organoids+in+a+defined+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel.</a> Adv Mater. 30, 1801621(2018).</li>
<li>Barthes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microenvironment+engineering+and+monitoring+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+The+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances.</a> BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

John Huang 博士是 TheWell Bioscience 的创始人兼首席执行官。

选择干细胞和类器官研究的最佳微环境是在广泛应用这些平台时至关重要的初始步骤。我们的代表性结果表明，Matrix 4-XFO3 与较高浓度的生长因子联合使用可产生更大的类器官，提示可利用无异源成分水凝胶的物理特性，通过这些系统优化类器官的生成。已有研究证实，细胞外基质（ECM）的独特特性与类器官内细胞的身份密切相关12由于细胞通过整合素及其他受体感知外部力学信号，细胞外基质（ECM）的力学特性对干细胞具有深远影响，而干细胞亦可相应地产生内部力学作用12干细胞与其微环境之间的相互作用在启动多种信号通路中起关键作用12此外，已有研究表明，细胞外基质（ECM）可作为储存和释放生长因子及其他影响细胞行为的信号分子的储库。因此，我们的代表性结果及数十年的研究均强调，在选择基质系统时，必须考虑天然细胞微环境及组织特性的生化与物理因素。 体外 研究29,30.
本方案中解释了若干关键步骤和建议，以提醒使用者注意潜在问题及其规避方法。然而，本方法中存在两个对成功实施该方案至关重要的关键步骤。首先，检测与干细胞群体相关的特异性标志物对于确定最佳包被体系至关重要，该体系可维持干细胞群体处于适合高效可控分化的状态。同样，确认各分化阶段相关标志物的表达情况，是决定何时进入下一阶段的关键依据。本方案提供了每个阶段所需最短时间的一般性指导原则。然而，不同细胞系和实验条件（如基因型、基质刚度）下，各阶段的最佳时间可能有所不同。因此，对多个阶段特异性标志物进行表征，是提高人源类器官（hIO）生成效率的最佳策略。
第二个关键步骤是在使用无异源成分的Matrix 4-XF体系时加入更高浓度的生长因子，这一点至关重要。无异源成分生物材料体系常被指出的一个局限性是缺乏生长因子31。然而，这一缺点也可转化为优势：通过对体系中生长因子的完全控制，提高实验的可重复性。尽管本方案描述的是使用 commercially available 培养基和生长因子添加试剂盒，但若使用单独组分在实验室内部配制完全培养基，也可遵循相同的原理。水凝胶与培养基的特定体积比决定了生长因子所需提高的浓度；例如，2:1的比例可能需要将生长因子浓度提高至原来的3倍，才能达到标准完全培养基中的代表性浓度。对体系中生长因子的全面控制，有助于解答机制性科学问题，并在许多应用中避免监管方面的障碍。
步骤3中描述的图像处理过程受限于图像的质量和所采集图像的类型。可能需要根据每种图像类型和质量的具体要求进行优化调整。然而，该流程的整体步骤以及从明场图像进行类器官大小分析的基本框架的MATLAB代码示例，有助于建立一个可进一步优化和扩展的工作流程。此外，明场显微镜的可及性比其他类型的显微镜更为普遍。尽管缺乏对MATLAB的使用条件或熟悉程度可能会限制该代码的应用，但该流程的一般步骤可与ImageJ的开源软件Fiji兼容。仅以类器官大小作为评估其成熟度的指标并不推荐；建议进一步检测能够代表目标器官的特异性标志物；部分适用于肠道组织的标志物见表4。图6展示了使用上皮细胞黏附分子（EpCAM）对完整类器官进行免疫荧光染色的示例，EpCAM定位于类器官的外表面（基底外侧）。尽管在所有ECM系统中培养的类器官均能观察到EpCAM信号，但这些类器官在大小上存在差异。因此，类器官大小的相关信息有助于优化培养条件。此外，在药物反应研究中，类器官大小可作为评估待测化合物反应的指标；大小的变化可能反映待测化合物的有效性或毒性。重要的是，目前领域内面临的一个挑战是生成具有标准化大小的多批次类器官，但这一指标对于实验可重复性至关重要，以便能够在不同实验或不同实验室之间进行结果比较。综上所述，一种能够从明场图像中自动提取类器官重要信息的工作流程，为众多研究人员提供了一种有益的工具。
动物来源基质和无异源成分水凝胶这两种系统各有优缺点。Matrix 2-AB 在类器官形成（MH）阶段导致的类球体释放数量少于其他动物来源基质，这可能是由于批次间差异所致，而批次间差异是 commercially available 动物来源基质广为人知的特性。需要注意的是， commercially available ECM 系统的浓度各不相同；例如，产品说明书中的稀释倍数被用于配制包被溶液，这可能导致动物来源基质的实际浓度存在轻微差异。这些蛋白质浓度的差异可能显著影响细胞分化，从而在使用不同批次的相同产品时导致分化效率的差异。在选择系统时，应考虑具体实验目标、伦理考量以及监管要求等因素。例如，在将体外（in vitro）实验结果与小鼠动物模型进行比较以回答肿瘤和癌症生物学问题时，使用来自 Engelbreth-Holm Swarm EHS 小鼠的基质可能是一个理想选择。此外，由于 Matrigel 等产品已被使用数十年，已有大量现成的实验方案、数据和参考文献可供参考。然而，当研究问题涉及人类疾病或治疗方法时，使用成分明确、可定制物理和化学特性的无异源成分基质可能是更合适的选择。此外，大多数无异源成分水凝胶系统在设计时即符合监管标准，因此适用于需要符合药品生产质量管理规范（GMP）或其他监管指南的研究。
总之，尽管动物来源的基质因子因其良好的生物相容性已被广泛用于诱导多能干细胞的维持和类器官的生成，但无异源成分的水凝胶系统在可重复性、成本效益、法规合规性以及伦理考量方面具有优势。两者之间的选择取决于特定研究或临床应用的具体需求。无异源成分的水凝胶系统正日益成为一种更灵活且可持续的替代方案，可支持利用类器官和微生理系统对治疗候选药物进行临床前初筛。该应用可显著改善早期药物开发，并有助于应对当前制药行业中临床转化所面临的挑战。

细胞外基质（ECM）是组织中一种动态且具有多种功能的组分，在调控细胞行为和发育过程中发挥核心作用。作为一种复杂的网络结构，它可提供结构支持以及细胞黏附配体1以及储存调控细胞信号传导的生长因子和细胞因子。例如，在伤口愈合过程中，细胞外基质（ECM）可作为迁移细胞的支架，同时作为参与组织修复的生长因子的储存库2同样，细胞外基质（ECM）的失调可能导致多种疾病（如纤维化和癌症）的严重程度增加。3,4在胚胎发育过程中，细胞外基质（ECM）引导组织形态发生。例如，在心脏发育过程中，ECM组分在形成心脏组织的正确结构和功能中发挥重要作用。5十多年的研究所表明，仅微环境的硬度6,7 可以调控干细胞谱系特化。因此，在此期间 体外 细胞分化，细胞外基质通过提供分化信号影响干细胞命运。
类器官可以从诱导性多能干细胞（iPSCs）生成。成功生成类器官的前提是使用经过充分表征的iPSC细胞系。然而，传统细胞培养材料中缺乏生理相关的信号，阻碍了iPSC的有效分化和类器官的生成。此外，近期研究强调了细胞外基质（ECM）的组成、细胞与ECM之间的相互作用8，以及机械和几何信号9,10,11在类器官扩增与分化过程中的重要性12。通过引入组织特异性的物理和化学信号，有望提升类器官技术的可重复性，从而推动其发展。
类器官旨在生理相似的微环境中重现天然组织的特性。选择一种能紧密模拟天然组织细胞外基质（ECM）的系统，对于实现细胞行为、功能及对刺激反应的生理相关性至关重要13。ECM组分的选择可影响干细胞在类器官内向特定细胞类型的分化。不同的ECM蛋白及其组合可提供引导细胞命运的信号线索14。例如，已有研究表明，使用特定的ECM组分可促进肠干细胞向成熟肠细胞类型分化，从而获得具有生理相关性的肠类器官15。尽管类器官在疾病建模和药物筛选中是一种有价值的工具，但选择合适的ECM系统对该应用至关重要。合适的ECM系统可通过构建类似于病变组织的微环境，提高疾病建模的准确性16。此外，组织特异性的ECM有助于生成更真实地重现疾病相关表型和药物反应的类器官17。优化用于类器官分化的ECM系统，对于实现理想的分化结果至关重要。
来源于动物细胞外基质（ECM）的市售基底膜系统（例如 Matrigel、Cultrex）以及无异源成分的水凝胶（例如 VitroGel）在诱导多能干细胞（iPSC）和类器官研究中被广泛使用。多年来，相关产品开发商和使用者已针对其特定产品和应用发布了大量操作说明，其中许多说明为本实验方案的制定提供了指导。此外，这些材料因其内在特性所带来的优势与局限性也已被众多研究者分别记录18,19,20,21。然而，目前尚缺乏系统性的操作流程来指导研究者为iPSC和类器官工作选择最优的基质系统。本文提供了一种系统评估不同来源ECM系统在iPSC和类器官实验中等效性的操作流程。该研究比较了两种不同的人诱导多能干细胞系（hiPSC）的维持培养以及人肠类器官（hIO）在四种不同基质中的生成情况：Matrigel（基质1-AB）、Geltrex（基质2-AB）、Cultrex（基质3-AB）和VitroGel（基质4-XF）。在类器官培养中，使用了四种此前已针对类器官培养优化过的无异源成分基质VitroGel版本：ORGANOID 1（基质4-O1）、ORGANOID 2（基质4-O2）、ORGANOID 3（基质4-O3）、ORGANOID 4（基质4-O4）。同时，也使用了针对类器官优化的动物源性基质：高浓度Matrigel（基质1-ABO）和Cultrex Type 2（基质3-ABO）。实验中采用市售干细胞培养基（mTeSR Plus）和类器官分化试剂盒（STEMdiff intestinal organoid kit）。本实验方案结合了各产品制造商提供的操作说明与实验室实践经验，旨在指导读者针对其特定的iPSC和类器官研究实现ECM条件的成功优化。总体而言，本方案及代表性结果强调了为干细胞研究和类器官分化选择最佳微环境的重要性。

<table><tbody><tr><td>24孔板（经培养处理，无菌）</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>抗黏附冲洗液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜（BSC）</td><td>Labconco&amp;nbsp;</td><td>Logic</td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜</td><td>Echo Rebel</td><td>REB-01-E2</td><td></td></tr><tr><td>BXS0116</td><td>ATCC</td><td>ACS-1030</td><td></td></tr><tr><td>带温度控制的离心机（可维持4 &amp;deg;C）</td><td>ThermoScientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>锥形管，15 mL，无菌</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>锥形管，50 mL，无菌</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME，2型</td><td>Bio-techne</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 干细胞认证 RGF BME&amp;nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>3434-010-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free，hESC认证，生长因子减量</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>A14133-02</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Guava Muse 细胞分析仪或其他流式细胞仪设备（可选）</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Heralcell Vios 细胞培养孵育箱（37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>51033775</td><td></td></tr><tr><td>JMP 软件</td><td>SAS Institute</td><td>JMP 16</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc</td><td>R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减量（GFR）基底膜基质，LDEV-free</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 高浓度（HC）基质，生长因子减量（GFR），LDEV-free</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>354263</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 表面处理 24孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 CD326（EpCAM）</td><td>BD Pharmingen</td><td>566841</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 CDX2&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>563428</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 FOXA2</td><td>BD Pharmingen</td><td>561589</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 小鼠抗人 SSEA4&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561565</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>SCTi003-A</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0510</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（10 mL）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（5 mL）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 肠类器官生长培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5145</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 肠类器官试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5140</td><td></td></tr><tr><td>Vitrogel 水凝胶基质</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM01</td><td></td></tr><tr><td>VitroGel ORGANOID 发现试剂盒</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM04-K</td><td></td></tr></tbody></table>

用于人干细胞维持与肠道类器官生成的基底膜基质比较研究

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

细胞外基质（ECM）在细胞行为和发育过程中发挥着关键作用。由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成的类器官目前受到多个研究领域的广泛关注。然而，传统细胞培养材料缺乏生理相关信号，限制了hiPSC的有效分化。将市售的细胞外基质引入干细胞培养体系，可为细胞维持提供有益的物理和化学信号。来源于动物的市售基底膜产品含有支持细胞维持的ECM蛋白和生长因子。由于ECM具有组织特异性，能够调控细胞命运，因此无异源成分（xeno-free）基质被用于促进向临床研究的转化。尽管市售基质已广泛应用于hiPSC和类器官研究，但这些基质之间的等效性尚未得到评估。本研究对四种不同基质——Matrigel（基质1-AB）、Geltrex（基质2-AB）、Cultrex（基质3-AB）和VitroGel（基质4-XF）——在hiPSC维持及人肠类器官（hIO）生成中的表现进行了比较。尽管细胞集落未呈现完美的圆形形态，但自发分化程度较低，超过85%的细胞表达干细胞标志物SSEA-4。使用基质4-XF可促进形成三维圆形细胞团。此外，提高用于制备基质4-XF水凝胶溶液的培养基中补充物和生长因子的浓度，可使hiPSC的SSEA-4表达水平提高1.3倍。在中/后肠阶段，基于基质2-AB维持的hiPSC分化过程中产生的球状体释放数量少于其他动物来源的基底膜组。与其他基质相比，无异源成分类器官基质（基质4-O3）可生成更大且更成熟的hIO，表明无异源水凝胶的物理特性可用于优化类器官的生成。综上所述，结果表明不同基质的组成差异会影响肠类器官分化的各个阶段。本研究强调了市售基质之间的差异，并为hiPSC和类器官研究中的基质优化提供了指导。

根据本方案，成功利用市售的基底膜和一种无异源成分的水凝胶系统培养了人诱导多能干细胞（hiPSC），并将其分化为人肠道类器官（hIO）。这些实验的主要目标是系统评估不同来源基质在hiPSC和hIO研究中的等效性。本方案的第一部分重点介绍了健康iPSC培养物的维持与鉴定，以实现高效的肠道类器官生成。文中描述并比较了使用动物来源基质Matrix 1-AB、Matrix 2-AB和Matrix 3-AB包被培养器皿的方法，以及与无异源成分的水凝胶系统Matrix 4-XF的对比。
如图3A所示，来源于CD34+细胞的hiPSC系BXS 0116在三种动物源性基质上培养时表现出相似的形态。然而，将BXS 0116细胞系与来源于PBMC的SCTi003-A细胞系在Matrix 1-AB包被孔板上的培养情况进行比较，可发现不同细胞系之间的内在差异（见表6）可能导致细胞增殖、分化及形态方面的差异。例如，SCTi003-A细胞系生成定型内胚层（DE）需要3天，而BXS0116细胞系则需要5天。此外，如图3B-C所示，在Matrix 4-XF无异源成分水凝胶系统中培养hiPSC时，细胞形成部分嵌入式的三维克隆结构，这与在Matrix 1-AB包被或类似体系的培养板上培养的hiPSC所呈现的扁平形态显著不同。同时，从这些实验中还需注意的一个关键点是：使用3倍浓度生长因子构建的无异源成分水凝胶系统可显著提高细胞活力及干细胞标志物的表达水平。总体而言，hiPSC在动物源性基质以及含3倍生长因子浓度的无异源成分Matrix 4-XF上培养时，均可实现相当水平的SSEA-4（干细胞标志物）表达22；然而，水凝胶系统更有利于形成部分嵌入式的三维克隆结构。
本方案的第二部分重点介绍将hiPSCs分化生成hIO的过程。此处使用了一种基于Spence等23研究开发的商业化试剂盒，依次分化为定型内胚层（DE），然后为中肠/后肠（MH），最终收集类球体并使其成熟为肠类器官（图4C）。为了高效生成hIO，在启动分化方案前，必须检查hiPSC培养物是否存在最小程度的自发分化。如图4A所示，启动DE分化时，干细胞标志物（如SSEA-4）的表达水平越低，整个分化过程的效率就越差（即MH标志物表达水平降低），进而导致hIO生成效果不佳。使用紧凑型台式流式细胞仪可快速获得流式细胞术结果，有助于在进入下一阶段前判断分化的质量。一个特殊的观察发现是，使用Matrix 2-AB维持培养的hiPSC在中肠/后肠阶段释放的类球体数量少于其他动物源性培养体系。另一个需要注意的关键点是，由于在Matrix 4-XF中维持的hiPSC集落从分化开始即已具备三维结构，因此这些体系会产生更大的类球体。
将类球体嵌入 Matrix 1-ABO、Matrix 3-ABO 和 Matrix 4-XFO1 至 Matrix 4-XFO4 中，并使用试剂盒将其成熟为人肠道类器官（hIO）。类球体成熟培养 7 天后，进行传代并重新嵌入相应的基质系统中。通过明场图像连续追踪每种系统上类器官的生长情况，为期 7 天。尽管培养起始时类器官大小相对一致，但在 5 天后，其尺寸随所嵌入基质的不同而出现差异（图 5）。在四种 Matrix 4-XFO 中，能够产生较大类器官的配方为 Matrix 4-XFO3。Matrix 4-XFO 系列基质含有不同的配体并具备不同的力学特性，可适用于多种应用需求24。具体而言，Matrix 4-XFO3 的刚度25 比其他 Matrix 4-XFO 配方更接近人类肠道组织的刚度26，这支持了近期关于细胞外基质（ECM）力学特性在类器官扩增中作用的研究结果12,27,28。本研究的代表性结果表明，Matrix 1-ABO 与 Matrix 3-ABO 在促进肠道类器官生长和扩增方面效果相当。
<img alt="iPSC 分化示意图和生长数据；显微镜图像和柱状图结果，比例尺为 200 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：选择用于 iPSC 维持的基质系统。（A）两种细胞系在三种不同动物来源基质系统包被的培养器皿上生长的代表性图像。（B）比较 Matrix 4-XF 在添加 1 倍与 3 倍生长因子条件下的使用情况，结果显示增加生长因子补充可提高 hiPSC 在 Matrix 4-XF 水凝胶上的存活率。（C）流式细胞术比较 Matrix 1-AB、Matrix 3-AB 和 Matrix 4-XF（3X）的 SSEA-4 表达水平，显示三者表达相当，而 Matrix 4-XF（1X）导致 SSEA-4 表达降低。柱状图表示 n = 5 的均值 ± 标准差；采用双因素方差分析，并通过非参数 Wilcoxon 方法进行事后检验以确定显著性差异。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分化阶段、hiPSC培养、流式细胞术数据、基质类型、内胚层分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：将iPSC分化为定型内胚层（DE）和中后肠（MH）。（A）从不同SSEA4标志物水平开始的iPSC向DE分化的代表性图像，突显了起始分化时应使用干细胞标志物高表达的hiPSC群体的重要性。红色箭头指示在启动DE分化前已发生自发分化的区域。（B）在开始分化前检测干细胞标志物SSEA4的表达，以及在DE分化3天后检测DE标志物FOXA2的表达的流式细胞术分析示例，左侧为较差的DE分化结果，右侧为良好的分化结果。每张图代表来自1个样本的细胞分析结果；建议至少对3次流式细胞术检测结果取平均值以进行统计分析。（C）iPSC在所有研究基质上分化为人肠道类器官（hIO）的代表性图像。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在不同硬度基质中类器官的生长；弹性模量与面积数据；示意图、图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5选择用于类球体包埋和人肠道类器官成熟的基质系统 (A嵌入Matrix 4-XFO 1-4中的人类肠道类器官（hIO）成熟过程的样本图像。Matrix 4-XFO体系的弹性模量约为50–300 Pa，其中Matrix 4-XFO3的弹性模量最高。 &gt; Matrix 4-XFO4 &gt; Matrix 4-XFO2 &gt; Matrix 4-XFO1。Matrix 1-ABO 和 Matrix 3-ABO 的刚度范围为 440–800 Pa，具体数值因批次而异。B嵌入当天（第0天）及培养1周后（第7天），人肠道类器官（hIO）在Matrix 1-ABO、Matrix 3-ABO和Matrix 4-XFO3中成熟的样本图像。C) 不同基质系统上成熟的 hIO 的尺寸比较数据。柱状图表示 n = 7 的均值 ± 标准差；采用双因素方差分析，事后检验使用非参数 Wilcoxon 方法进行显著性检验。比例尺 = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基质覆盖显微图像，DAPI和EpCAM染色，细胞鉴定，比例尺200 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：在不同基质中培养的肠道类器官的代表性免疫荧光图像证实了上皮细胞群体的存在。 在不同基质中培养的完整肠道类器官经固定后，使用上皮细胞黏附分子（EpCAM）（绿色）染色，并用DAPI复染细胞核（蓝色）。所有类器官均显示EpCAM阳性细胞，证实上皮细胞群体定位于类器官的外表面。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：用于iPSC培养器皿包被的基质的分装、储存和稀释总结。* 为获得准确的稀释倍数，请查阅每批次产品分析证书中推荐的稀释倍数和/或蛋白浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%201_Summary%20of%20aliquot%20preparation_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2： 每单位培养器皿表面积所需的包被溶液及mTeSR Plus培养基体积参考表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%202_Volume%20of%20coating%20solutions_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3： 每单位培养器皿表面积所需的Matrix 4-XF前体溶液体积及完全干细胞培养基的参考表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%203_Reference%20table%20of%20the%20volume%20of%20Matrix4-XF_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4： 建议用于在过程中表征人诱导多能干细胞（hiPSC）和人肠道类器官（hIO）的常用标志物列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%204_List%20of%20common%20markers_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表5：人诱导多能干细胞分化为肠类器官过程中所需培养基的汇总。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%205_Summary%20of%20media%20needed%20during%20hiPSC_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表6：本研究中使用的两个hiPSC细胞系的具体信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%206_iPSC%20lines%20information_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件 1：可根据特定图像类型进行修改的通用 MATLAB 代码。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Code%20image%20Processing_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

类器官已成为疾病建模的重要工具。在类器官生成过程中，细胞外基质（ECM）&#160;可引导细胞命运，使用与天然组织相似的系统能够提高模型的准确性。本研究比较了人诱导多能干细胞来源的肠类器官在动物源性细胞外基质与无异源成分水凝胶中的生成情况。

细胞外基质（ECM）在细胞行为和发育过程中发挥着关键作用。由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成的类器官……

我们的研究旨在将体外模型与计算机模拟模型相结合，以指导药物发现与开发的早期阶段。简而言之，我们结合干细胞技术、类器官和微流控技术，研究药物与疾病之间的相互作用、膜完整性，并预测药物吸收和药物代谢。在本领域中，前沿技术包括基于生理学的计算机模拟模型，以及与先进体外系统（如微电生理系统、器官芯片和类器官）的结合应用。此外，目前正在探索利用3D生物打印技术，以最大限度地提高这些更复杂的体外模型的可扩展性。当前的实验挑战包括增强这些体外模型的组织微环境和生理保真度，减少实验变异性，并优化高通量能力。同时，还需建立符合药物开发监管标准的标准化操作流程。为了降低实验变异性、更好地模拟组织微环境，并遵循人类药物开发的监管指南，本方案描述了利用无异源成分、成分可控且机械性能可控的水凝胶系统，对类器官的生成及其培养体系进行优化的过程。我们的研究致力于开发微生理系统，用于模拟在临床试验中代表性不足的特殊人群（例如唐氏综合征患者）的ADMETox（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）。本实验室还在致力于将基于肿瘤免疫治疗的新方法拓展应用于胃肠道肿瘤和肺癌等新的治疗场景。首先，将装有25毫升预冷的高级DMEM/F-12培养基的离心管置于冰上。向每根离心管中加入解冻后的基质。混匀悬浮液，确保不形成团块。现在将250微升稀释后的基质液加入24孔板的每个孔中。倾斜培养板使包被液均匀铺展。孵育后，使用血清移液管轻轻吸除多余的液体，注意不要刮伤包被表面。立即向每个孔中加入250微升温热的完全干细胞培养基。为使用Matrix 4无异源成分水凝胶包被组织培养板，首先将水凝胶恢复至室温。取两份体积的水凝胶加入含有一份体积3倍浓度干细胞培养基的离心管中。用移液器反复吹打溶液以充分混匀。将250 µL水凝胶转移至24孔组织培养板的孔中。然后倾斜培养板，使水凝胶均匀铺展。10 到 15 分钟后，包被好的培养板即可用于诱导多能干细胞的培养。首先，用移液器将一到两毫升的抗黏附冲洗液加入一个 15 毫升的锥形管中，轻轻旋转管子以润洗其内表面。随后，在去除抗黏附溶液后，将五毫升 DPBS 溶液移液至试管中。将包被好的试管盖上盖子，待用。用移液枪吸出含有人类肠道类器官穹顶的培养板中的任何培养基。用1毫升移液器向穹顶结构直接加入1毫升冷的DMEM/F-12培养基，以使其从培养板上脱落。再用1毫升培养基吹打以收集任何残留的类器官。将悬液转移至包被的15毫升锥形管中。用移液器将悬浮液上下吹打，使类器官充分分散，直至形成大小均匀且符合预期的类器官片段悬浮液。随后，吸取部分悬浮液用于细胞计数。将剩余悬浮液置于冰上保存。在平底96孔板每个孔的底部绘制一个XY网格。用移液器向孔中加入50 µL DPBS。将5 µL分装液转移至每个孔中。人工计数直径在 50 至 200 微米范围内的类器官总数。然后使用给定的公式计算类器官悬液的体积。计数完成后，从含有剩余聚集团悬液的离心管中移除上清液和浑浊层。然后将两毫升冷的DMEM/F-12直接用移液管加到沉淀上。在室温下以200 ×g离心悬浮液5分钟。对于动物来源的体系，向类器官沉淀中加入40 µL冷的动物来源基质。用移液器将类器官上下吹打，使其均匀分散于基质中。轻柔地将基质-类器官混合物转移至无菌预热的24孔细胞培养板中央。于37摄氏度孵育30分钟，以确保形成圆顶状凝胶。接下来，用移液器将0.5毫升温热的肠道类器官生长培养基沿孔壁缓慢加入，注意不要扰动类器官形成的半球状结构，随后进行培养。对于Matrix 4无异源类器官系统，向球状体沉淀中加入50微升3倍浓度的类器官生长培养基。然后，向悬浮液中加入100微升选定的Matrix 4无异源类器官基质。向24孔组织培养板的中央加入40微升水凝胶类器官混合物。将培养板在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，沿孔壁用移液器加入0.5毫升类器官生长培养基。然后在37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度条件下再次孵育培养板。

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