用于人干细胞维持与肠道类器官生成的基底膜基质比较研究

我们的研究旨在将体外模型与计算机模拟模型相结合，以指导药物发现与开发的早期阶段。简而言之，我们结合干细胞技术、类器官和微流控技术，研究药物与疾病之间的相互作用、膜完整性，并预测药物吸收和药物代谢。在本领域中，前沿技术包括基于生理学的计算机模拟模型，以及与先进体外系统（如微电生理系统、器官芯片和类器官）的结合应用。

此外，目前正在探索利用3D生物打印技术，以最大限度地提高这些更复杂的体外模型的可扩展性。当前的实验挑战包括增强这些体外模型的组织微环境和生理保真度，减少实验变异性，并优化高通量能力。同时，还需建立符合药物开发监管标准的标准化操作流程。

为了降低实验变异性、更好地模拟组织微环境，并遵循人类药物开发的监管指南，本方案描述了利用无异源成分、成分可控且机械性能可控的水凝胶系统，对类器官的生成及其培养体系进行优化的过程。我们的研究致力于开发微生理系统，用于模拟在临床试验中代表性不足的特殊人群（例如唐氏综合征患者）的ADMETox（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）。本实验室还在致力于将基于肿瘤免疫治疗的新方法拓展应用于胃肠道肿瘤和肺癌等新的治疗场景。

首先，将装有25毫升预冷的高级DMEM/F-12培养基的离心管置于冰上。向每根离心管中加入解冻后的基质。混匀悬浮液，确保不形成团块。

现在将250微升稀释后的基质液加入24孔板的每个孔中。倾斜培养板使包被液均匀铺展。孵育后，使用血清移液管轻轻吸除多余的液体，注意不要刮伤包被表面。

立即向每个孔中加入250微升温热的完全干细胞培养基。为使用Matrix 4无异源成分水凝胶包被组织培养板，首先将水凝胶恢复至室温。取两份体积的水凝胶加入含有一份体积3倍浓度干细胞培养基的离心管中。

用移液器反复吹打溶液以充分混匀。将250 µL水凝胶转移至24孔组织培养板的孔中。然后倾斜培养板，使水凝胶均匀铺展。

10 到 15 分钟后，包被好的培养板即可用于诱导多能干细胞的培养。首先，用移液器将一到两毫升的抗黏附冲洗液加入一个 15 毫升的锥形管中，轻轻旋转管子以润洗其内表面。

随后，在去除抗黏附溶液后，将五毫升 DPBS 溶液移液至试管中。将包被好的试管盖上盖子，待用。用移液枪吸出含有人类肠道类器官穹顶的培养板中的任何培养基。

用1毫升移液器向穹顶结构直接加入1毫升冷的DMEM/F-12培养基，以使其从培养板上脱落。再用1毫升培养基吹打以收集任何残留的类器官。将悬液转移至包被的15毫升锥形管中。

用移液器将悬浮液上下吹打，使类器官充分分散，直至形成大小均匀且符合预期的类器官片段悬浮液。随后，吸取部分悬浮液用于细胞计数。将剩余悬浮液置于冰上保存。

在平底96孔板每个孔的底部绘制一个XY网格。用移液器向孔中加入50 µL DPBS。将5 µL分装液转移至每个孔中。

人工计数直径在 50 至 200 微米范围内的类器官总数。然后使用给定的公式计算类器官悬液的体积。计数完成后，从含有剩余聚集团悬液的离心管中移除上清液和浑浊层。

然后将两毫升冷的DMEM/F-12直接用移液管加到沉淀上。在室温下以200 ×g离心悬浮液5分钟。对于动物来源的体系，向类器官沉淀中加入40 µL冷的动物来源基质。

用移液器将类器官上下吹打，使其均匀分散于基质中。轻柔地将基质-类器官混合物转移至无菌预热的24孔细胞培养板中央。于37摄氏度孵育30分钟，以确保形成圆顶状凝胶。

接下来，用移液器将0.5毫升温热的肠道类器官生长培养基沿孔壁缓慢加入，注意不要扰动类器官形成的半球状结构，随后进行培养。对于Matrix 4无异源类器官系统，向球状体沉淀中加入50微升3倍浓度的类器官生长培养基。然后，向悬浮液中加入100微升选定的Matrix 4无异源类器官基质。

向24孔组织培养板的中央加入40微升水凝胶类器官混合物。将培养板在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，沿孔壁用移液器加入0.5毫升类器官生长培养基。

然后在37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度条件下再次孵育培养板。