Name: 测量布氏活锥虫的动态糖体 pH 值变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学习使用pH生物传感器和流式细胞术监测布氏锥虫糖体pH动态变化的方法。该技术可实时追踪活寄生虫对营养波动的动态响应，为研究寄生虫代谢机制提供高通量筛选工具。

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pHluorin2-PTS1 由 Twist Bioscience 公司克隆至 pLEW100v5 载体中，该公司提供了该构建体的高拷贝克隆载体；pLEW100v5 载体由乔治·克罗斯博士（Dr. George Cross）惠赠。抗 T. brucei 醛缩酶的抗血清可应要求从克莱姆森大学梅雷迪思·T·莫里斯博士（Dr. Meredith T. Morris）处获得。JCM 和 KAC 实验室的工作部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，项目编号 R01AI156382）的资助。SSP 得到了 NIH 3R01AI156382 项目的资助。

Development of pHluorin2-Based Sensor for Glycosomal pH in Trypanosoma brucei

<ol><li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+the+African+trypanosome%3A+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).</li>
<li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938(2015).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018).</li>
<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139(2022).</li>
<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
<li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li>
<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

非洲锥虫对环境的感知与响应机制目前尚不明确。已知营养物质可用性的变化会触发该寄生虫产生多种响应，包括糖酵解体的酸化。本文中，我们描述了一种利用可遗传的蛋白质传感器pHluorin2结合流式细胞术，在活细胞中研究糖酵解体pH值对环境扰动响应的方法。
使用该传感器时有几个关键步骤。首先，对表达外源基因的转染寄生虫进行表征非常重要，因为不同细胞间的表达可能存在差异。某些外源基因的表达水平可能随时间推移而下降。尽管迄今为止尚未在携带pHluorin2的细胞中观察到这一现象，但如果传感器的响应性变得高度不稳定（例如，诱导后传感器信号较弱），则可能需要对培养物进行克隆筛选，因为群体中部分细胞可能比其他细胞表达更高水平的蛋白。或者，重新转染并进行筛选已被证明是生成具有更高（尽管可能是短暂的）表达水平新细胞系的有效方法。如果需要重新转染，我们建议对单个细胞系进行克隆分离，因为目标外源基因的表达可能会带来轻微的生长劣势，导致高表达细胞在培养过程中逐渐丢失。
此外，在检测过程中以及常规培养期间，监测寄生虫的存活能力至关重要。我们在检测中加入了PI...

与大多数生物一样，寄生性动基体类原生生物依赖葡萄糖作为中心碳代谢的基本组成部分。该类群包括具有重要医学意义的生物，例如非洲锥虫Trypanosoma brucei；美洲锥虫T. cruzi；以及利什曼原虫属（Leishmania）的寄生虫。在寄生虫致病生命周期阶段，葡萄糖代谢对其生长至关重要。例如，当缺乏葡萄糖时，非洲锥虫的血液形态（BSF）会迅速死亡。值得注意的是，在感染的这一阶段，糖酵解是ATP的唯一来源1。利什曼原虫&#160;寄生虫在人体宿主中同样依赖葡萄糖，其寄生于宿主巨噬细胞内的无鞭毛体生命周期阶段需要这种碳源以支持生长2。
尽管这些寄生虫具有涉及不同昆虫媒介的截然不同的生活方式，但它们在对葡萄糖的响应和摄取方面存在许多共同之处。例如，这些寄生虫将大多数糖酵解酶定位于一种称为糖酵体的修饰过氧化物酶体中。这种动质体特异性的细胞器在保守的生物合成机制和形态学上与哺乳动物的过氧化物酶体相关3,4,5,6。
大多数糖酵解途径酶被区室化于糖酵体中，这为寄生虫提供了特异性的代谢通路调控机制。我们利用一种化学pH探针发现，营养剥夺会触发克氏锥虫前循环型（procyclic form, PF）糖酵体的快速酸化，从而通过暴露关键糖酵解酶己糖激酶上的别构调节剂结合位点，改变其酶活性7,8。在我们之前的研究中，该化学探针需要持续给药才能发挥作用，限制了其在其他应用场景中的使用。此外，在血液型（BSF）阶段维持探针在糖酵体内的分布存在技术困难，因而限制了该方法在该生活周期阶段研究糖酵体pH的应用价值。
在本研究中，我们使用荧光蛋白生物传感器pHluorin2来监测布氏锥虫（T. brucei）血液形态（BSF）中糖酵解体pH值在环境刺激（包括葡萄糖饥饿）下的变化9（图1）。本研究结果表明，BSF T. brucei在饥饿条件下会迅速且可逆地酸化糖酵解体，这一反应与我们在前鞭毛体（PF）寄生虫中观察到的反应相似。我们预计该生物传感器将有助于加深对T. brucei及相关寄生虫中糖酵解调控机制的理解。

<table><tbody><tr><td>50 mL 组织培养瓶（未处理，无菌）</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶（未处理，无菌）</td><td>康宁</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &amp;micro;L型平底384孔板</td><td>BrandTech&amp;nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Human T Cell Nucleofector&amp;nbsp; 试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 流式细胞仪</td><td>赛默飞世尔科技旗下Invitrogen品牌</td><td>A24858</td><td>FlowJo 软件</td></tr><tr><td>BRANDplates 96孔平底板</td><td>默克密理博</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 的 Coloc 2 插件</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max 自动采样器</td><td>赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 公司</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 流式细胞仪</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences 16% 甲醛水溶液，电镜级，10 mL 安瓿</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>统计软件</td></tr><tr><td>尼日尔菌素（钠盐）</td><td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>已停产产品</td><td></td></tr><tr><td>OP2 液体处理仪</td><td>opentrons</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸，0.1%（w/v）溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma生命科学</td><td>CAS:25988-63-0</td><td>用于高通量筛选实验的移液机器人</td></tr><tr><td>噻唑红（TO-PRO-3）</td><td>Biotium</td><td>#40087</td><td>我们加工了一个定制的丙烯酸培养板支架，以便该品牌的培养板可在我们的 CytKick Max 自动进样器上被检测和使用</td></tr><tr><td>缬氨霉素</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>用于高通量筛选实验的移液机器人</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于pH校准</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于pH校准</td></tr></tbody></table>

测量活体中动态的糖体ph变化 布氏锥虫

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

葡萄糖代谢对非洲锥虫Trypanosoma brucei至关重要，既是其必需的代谢过程，也是寄生虫发育的调控机制。当环境中的葡萄糖水平发生变化时，细胞所产生的应答反应目前仍知之甚少。在血液型和前循环型（昆虫阶段）的寄生虫中，糖酵解的大部分过程发生在糖酵体中。这些细胞器在葡萄糖缺乏时会迅速酸化，这可能导致己糖激酶等糖酵解酶的变构调节。在以往的研究中，用于pH值测量的化学探针的定位存在困难，限制了其在其他应用中的实用性。
本文描述了表达定位于糖酵解体的pHluorin2（一种可遗传的蛋白质pH生物传感器）的寄生虫的构建与应用。pHluorin2是一种比率型pHluorin变体，在395 nm处的激发光强度随pH（酸性）降低而减弱，同时在475 nm处的激发光强度相应增强。通过将pHluorin2的开放阅读框克隆至锥虫表达载体pLEW100v5中，构建了转基因寄生虫，从而可在其生活周期的任一阶段诱导该蛋白的表达。采用免疫荧光技术验证pHluorin2生物传感器在糖酵解体中的定位，将其定位与糖酵解体固有蛋白醛缩酶的定位进行比较。为校准该传感器的响应特性，将细胞分别孵育于pH值从4到8的一系列缓冲液中（此前我们曾用此方法校准基于荧光素的pH传感器），在不同pH条件下进行标定。随后，利用流式细胞术在405 nm和488 nm处检测pHluorin2的荧光信号，以测定糖酵解体内的pH值。我们验证了活体转基因pHluorin2表达寄生虫的性能，监测了无葡萄糖条件下随时间变化的pH响应情况——这是已知可引发PF期寄生虫糖酵解体酸化的刺激因素。该工具具有多种潜在应用价值，包括可能用于高通量药物筛选。除糖酵解体pH外，该传感器还可被改造用于其他细胞器，或应用于其他动质体科原虫，以研究活细胞环境中的pH动态变化&#160;。

pHLuorin2-PTS1 在布氏锥虫（T. brucei）血液形态中的糖酵解体定位 
为评估 pHluorin2-PTS1 的亚细胞定位，对寄生虫进行了免疫荧光检测。转基因表达信号与针对糖酵解体驻留蛋白醛缩酶（TbAldolase）的抗血清信号共定位（图 2A）。抗 TbAldolase 抗体与 pHluorin2-PTS1 之间的平均 Pearson 相关系数为 0.895，表明 pHluorin2-PTS1 主要定位于糖酵解体。在确认 pHluorin2-PTS1 定位于糖酵解体后，我们进一步研究了 BF 阶段糖酵解体的 pH 值。
<img alt="显微镜下观察亲本株/pHL +TbAldo Ab中醛缩酶和pHL的免疫荧光；绘制pH与MFI的关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66279/66279fig02.jpg"...

我们描述了一种研究非洲锥虫血液形态中糖酵体的pH值如何响应环境刺激的方法。该方法结合了一种对pH敏感的可遗传蛋白传感器和流式细胞术，可用于测量pH动态变化，既可进行时间过程检测，也可用于高通量筛选。

测量活体中动态的糖体pH变化 布氏锥虫

葡萄糖代谢对非洲锥虫（Trypanosoma brucei）至关重要，既是其必需的代谢过程，也是寄生虫发育的调控机制。

葡萄糖代谢对布氏锥虫（Trypanosoma brucei）至关重要，但目前对细胞如何感知并响应环境中葡萄糖水平变化的机制仍知之甚少。我们已构建出表达pH生物传感器的寄生虫，使其能够在活体寄生虫中监测糖酵体内的pH变化，这将有助于理解寄生虫对营养波动的动态响应机制。本实验的一个挑战在于需要配备微孔板读板功能的流式细胞仪，以及用于检测生物传感器荧光信号的合适滤光片组。此外，布氏锥虫（T.brucei）属于第二类风险生物，因此流式细胞仪必须置于生物安全二级设施内。研究发现，糖酵解体内的 pH 值可影响糖酵解过程，因为己糖激酶和磷酸果糖激酶对 pH 敏感。然而，此前使用的 pH 探针未能准确靶向血液形态中的糖酵解体。为了研究该寄生虫生活阶段中糖酵解体pH值与糖酵解之间的关系，需要一种更理想的工具。pHluorin2-PTS1传感器在该生活阶段中比化学pH探针更能有效定位于糖酵解体。该工具使用便捷，只需在过夜期间诱导pH传感器的表达，细胞便会自行合成并将pHluorin2定位于糖酵解体。与显微镜技术相比，使用流式细胞术检测pHluorin2可提高通量并改善统计学测量结果。首先，取表达pHluorin的布氏锥虫细胞，加入四环素或强力霉素，并过夜孵育以诱导pHluorin表达。然后将每种培养物各3毫升转移至独立的15毫升离心管中。然后在室温下以1000 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。第四次离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于含不同浓度葡萄糖的PBS中。加入碘化丙啶或噻唑橙红以区分死细胞与活细胞。然后将每个样品转移至与流式细胞仪兼容的5毫升试管中。首先，启动流式细胞仪软件，新建一个实验。添加所需数量的样本并为其命名。然后设置 YL2-H 或 RL1-H 通道直方图、前向散射面积对侧向散射面积的点图、前向散射面积对前向散射高度图，以及 BL1-H 对 VL2-H 通道图。将未染色的野生型布氏锥虫对照细胞置于样本进样口，并调整载物台位置。为减小文件大小，取消勾选不打算记录的通道。从低流速开始，以便进行调整，然后点击“运行”以开始数据采集。微调 YL2 或 RL1 电压，使主峰位于相对荧光强度单位的 10³ 至 10⁴ 范围内。调整前向散射和侧向散射电压，确保超过90%的事件位于点图范围内。设置前向散射阈值，以排除碎片，同时不遗漏活细胞。调整VL2和BL1通道参数，使未染色的野生型对照的主要峰位于相对荧光强度10²至10⁴单位之间。点击“记录并测量”，至少采集 10,000 个事件。然后将第一个诱导表达 pHluorin 的布氏锥虫样品（用碘化丙啶或噻唑红染色）置于样品进样口。再次在冲洗后以低流速开始数据采集。监测每个图以确保正确捕获超过90%的事件，并且VL2-H和BL1-H通道未发生饱和。将每个样本的数据以FCS文件格式保存

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

测量布氏活锥虫的动态糖体 pH 值变化

利用电子显微镜和荧光显微镜等传统细胞生物学技术研究非洲锥虫中糖酵体的动态变化较为困难。为了观察细胞器的动态行为，已有研究结合使用荧光细胞器报告系统与流式细胞术，对活体寄生虫中糖酵体的实时动态进行监测。...

利用荧光蛋白监测非洲锥虫中糖酵体的动态变化

本文描述了利用一种生物发光的非洲锥虫株系来追踪晚期感染，并展示了如何 体内...

利用生物发光成像检测非洲锥虫病晚期感染

为蛋白质添加标签是深入了解其功能的有力方法。本文中，我们描述了一种可同时对数百个Trypanosoma...

高通量基因标记在Trypanosoma brucei中的应用

利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测Trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

这种从血液中分离锥虫的方法依赖于锥虫表面电荷的负电性低于哺乳动物血细胞。将感染的血液置于阴离子交换柱上进行处理。该方法是非洲锥虫病最适宜的诊断手段，可提供纯净的寄生虫，用于免疫学、生物学、生物化学、药物学和分子生物学研究。...

利用阴离子交换剂（二乙氨基乙基-纤维素柱）从血液中纯化细胞外锥虫（包括非洲锥虫）

我们描述了一种高通量比色法，用于检测引起恰加斯病的病原体——克氏锥虫（Trypanosoma...

体外药物筛选靶向表达β-半乳糖苷酶的克氏锥虫全生命周期阶段

端粒对于染色体稳定性至关重要，而端粒G端悬突结构对于端粒酶介导的端粒维持也必不可少。我们近期在Trypanosoma...

布氏锥虫中端粒G-突出结构的检测

本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。...

通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

流感病毒A型的并发感染是无症状携带Streptococcus...

利用生物发光成像研究协同作用 肺炎链球菌 以及流感病毒A在幼鼠中的研究

本文介绍了制备荧光标记的λ噬菌体、感染大肠杆菌（E.

追踪细胞命运 大肠杆菌 λ噬菌体感染后

学习使用pH生物传感器和流式细胞术监测布氏锥虫糖体pH动态变化的方法。该技术可实时追踪活寄生虫对营养波动的动态响应，为研究寄生虫代谢机制提供高通量筛选工具。

测量活体中动态的糖体pH变化布氏锥虫

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测量活体中动态的糖体pH变化 布氏锥虫

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