Name: 将配体建模为源自电子冷冻显微镜的图谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解如何在冷冻电镜图谱中对小分子配体进行建模，以研究膜蛋白结构并促进药物发现。本方案详细介绍了使用单颗粒冷冻电镜技术进行三维重建和配体拟合的完整流程。

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SJ 是 DAE-TIFR 博士奖学金的获得者，特此致谢相关资助。KRV 感谢 DBT B-Life 项目（项目编号：DBT/PR12422/MED/31/287/2014）以及印度政府原子能部在项目编号 RTI4006 下提供的支持。

Modeling Small Molecule Ligands in CryoEM Maps of Macromolecules

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，显微镜硬件和软件的进步使得冷冻电镜（cryoEM）结构的数量显著增加。尽管目前单颗粒冷冻电镜所能达到的最高分辨率为1.2 Å57,58,59，但大多数结构的分辨率仍集中在3–4 Å范围内。在中等至低分辨率的密度图中构建配体模型具有挑战性，常常存在不确定性。鉴于冷冻电镜在学术界和制药行业广泛应用于转化研究和药物发现，确保配体模型的准确性与无歧义至关重要。因此，通过计算Q分数60来量化配体原子的可分辨性是合理且必要的做法，目前该指标已作为评估密度图质量和模型拟合度的参数，被整合至EMDB数据库和Chimera软件中。
在第一个示例中，使用 ChimeraX 计算结核分枝杆菌（M. tuberculosis）烯醇化酶中脱辅基状态与配体结合状态在实空间中的差异图。在较高阈值下出现的额外电子密度提示配体磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate）存在于活性位点，并且有 Mg2+ 与该配体结合。需要特别注意的是，本例中的结构分辨率为中等（3.2 Å），水分子无法被可靠地建模（图1）。该方法的局限性在于，仅当配体结合未引起蛋白质显著构象变化时方可适用。本例中未进行密度图归一化处理，因为脱辅基状态和配体结合状态的数据集均以相同的像素尺寸采集，并在 Relion 中使用完全相同的参数进行处理。然而值得注意的是，当比较由不同重构程序（如 Relion46,47&#160;和 CryoSparc61）或不同质量的数据生成的密度图时，在进行有意义的比较之前，必须对密度图进行归一化处理。
下一个例子是 mGlu5，其在激动剂结合后会发生显著的分子重排，这一点从冷冻电镜结构中可以明显看出51,62（图2）。在此情况下，由于未结合（apo）状态与配体结合状态受体之间的电子密度图存在显著差异，无法直接计算简单的差值图。因此采用了 Servalcat 方法，该方法以未锐化且未加权的半图作为输入，在倒易空间中进行结构精修，随后计算实验图与模型衍生图之间的差值图。在较高阈值下，可以观察到差异特征，从而为模型的修正与优化提供指导。在 mGlu5 的胞外区及跨膜区附近观察到多个未建模的电子密度团块，并以此为依据对配体进行了建模（图2）。
第三个示例展示了分辨率（2.3 Å）在β-半乳糖苷酶中片段大小抑制剂的电子密度图解析与建模中的关键作用。此处的挑战在于，需在Servalcat差值电子密度图中识别出一个非常小的配体（&#60;200 Da），并克服数据固有噪声的影响，实现其精确建模。除了通过傅里叶壳层相关（FSC）确定的高全局分辨率外，配体所在区域的局部分辨率也足够高，从而确保了配体手性中心的准确定位（图3）。在整个酶结构中，尤其是配体周围，在差值图中均观察到了溶剂分子的电子密度。分辨率对配体及溶剂原子建模的影响也在图中得以展示（图4）。在对水分子或溶剂分子进行建模时需格外谨慎，因为在较低阈值下，噪声有时可能呈现出类似水或溶剂分子的密度特征，从而导致潜在的误判。
另一个重要的考虑因素是，仅凭冷冻电镜图谱可能不足以准确识别金属离子。通常需要借助其他生物物理方法，如扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）或能量色散X射线光谱（EDX），以确认金属离子的存在及其种类。在烯醇酶和β-半乳糖苷酶这两种酶中，由于已有大量关于这些蛋白质的信息支持，因此建模时确定为Mg2+，并由此确认了金属离子的身份。此外，在这些案例中金属离子的配位特征——例如典型的八面体几何构型以及Mg2+接近理想值的配位距离——也为确定其身份提供了有力证据。
在对冷冻电镜图谱中的配体进行建模时，通常需要考虑几个重要的因素。首先，选择正确的图谱用于配体的识别与建模至关重要。在所有情况下，建议使用未经锐化和加权的图谱或半图谱来观察配体电子密度，而不建议使用经过锐化和加权的图谱，因为锐化和加权可能导致图谱中出现欠锐化或过锐化区域（由级数截断引起的噪声）。这可能造成配体密度显示不理想，因此在Coot中进行模型构建时，可采用不同的B因子锐化方法来评估电子密度。尽管使用锐化图谱识别冷冻电镜图谱中的配体存在一定风险，但未锐化的图谱可能无法充分展现配体密度的细节，仅可用于示意目的，如图1B、C所示。
应对模拟配体的构象进行验证，尤其是在数据质量较弱的情况下。以mGlu5为例，局部分辨率在冷冻电镜图谱中存在差异，这使得对配体进行无偏建模具有挑战性。Servalcat可作为检测蛋白质和配体建模中潜在误差的有力工具22。
在蛋白质-配体复合物中可能存在组成异质性，其中仅特定亚群含有配体（如果配体分子量较低，则分类步骤可能无法消除这种异质性）。然而，在进行配体建模之前，图像处理过程中应迭代执行三维分类63步骤，并验证配体密度是否得到改善。当存在多个蛋白质拷贝时，在初始模型生成和精修过程中若对整个电镜图施加对称性，需格外谨慎，因为这可能导致所有对称相关分子中的配体密度被平均化。只有在彻底检查电镜图并确认所有蛋白质链中均存在配体密度后，方可施加对称性。
根据原子所处的状态（晶体或溶液）和位置（埋藏或表面），其可能具有动态性，在模型精修中，这被称为原子位移参数（ADP）。结合差值电子密度图（可为模型中可能存在的误差提供视觉线索），ADP值可用于评估配体在精修后的准确性64,65,66,67。通常情况下，配体的ADP值应与周围残基相近，即表明其结合稳定且建模准确。然而，位于边缘区域的配体，或距离大分子较远的配体原子（如脂类），其ADP值可能较高。除了坐标精修外，Refmac33,34 和 Phenix 均支持对ADP值进行精修28,&#160;68。在Refmac中，采用Mott-Bethe近似法计算单个原子在电子密度图计算过程中的电子散射因子。在Phenix的最新版本中，已引入类似于晶体学中的个体B因子精修方法，以考虑原子的无序性。在源自冷冻电镜（cryoEM）的精修模型中，常常观察到较宽范围的ADP值（有时接近于零），甚至EMDB中用于评估模型与电子密度图拟合程度的Q-score，也依赖于所提交的原始电子密度图以及B因子锐化的方式60。在冷冻电镜模型构建过程中，通常会使用多个电子密度图，因此应在方法部分明确说明建模和精修所使用的图谱，因为在许多大分子中存在各向异性分辨率，单一图谱可能不足以解释所有细节。
在大分子中配体的建模过程中，冷冻电镜图谱（与晶体学类似）的主要局限之一是：如果配体结合位点的分辨率较低，或结合的配体具有动态性，则确定其正确构象可能十分困难。此外，大多数冷冻电镜结构的分辨率低于3 Å，图谱中水分子的呈现有限，使得评估水合作用在配体或药物结合中的作用变得困难（如文中烯醇化酶和mGluR的示例所示）。可将计算方法与冷冻电镜数据结合使用，以克服这些局限69。与晶体学不同，只有模型本身经历精修，而图谱不进行精修。目前，指示配体存在或确保建模准确性的唯一方法是生成省略图谱（使用如Servalcat等工具）。因此，尽管已有多种工具可帮助研究人员构建和评估模型，但在模型精修方面，未来仍有望出现新的方法或对现有方法的改进。
本文重点介绍了当前配体建模的方法，包括对配体电子密度的手动分析、生成配体几何文件，以及随后在冷冻电镜（cryoEM）密度图中进行配体建模。结构生物学与药物发现正处在一个令人振奋的时期，得益于具有更快帧率的直接电子探测器以及更快速的数据采集技术70，研究人员能够在相对较短的时间内获得多种大分子（通常结合有小分子配体）的高分辨率结构图（&#60;2.8 Å）。近期，Schrodinger 软件套件中的 GEMspot69 和 Rosetta 软件套件中的 EMERALD17 等自动化配体建模工具相继问世，这些工具在整合实验性冷冻电镜数据的基础上，尝试确定配体最可能的结合构象，有望显著简化并实现该过程的自动化。类似于X射线晶体学，未来有望在一天内完成对一个甚至多个小分子配体结合模式的解析，这将逐渐成为现实可行的目标。

细胞通过同时且独立地进行无数化学反应来实现其功能，每个反应都受到精细调控，以确保细胞在响应环境信号时的生存与适应能力。这种调控通过分子识别实现，即生物分子（尤其是蛋白质）能够与其他大分子以及小分子或配体形成瞬时或稳定的复合物1。因此，蛋白质-配体相互作用是所有生物学过程的基础，包括蛋白质表达和活性的调控、酶对底物和辅因子的识别，以及细胞对信号的感知与传递1,2。深入理解蛋白质-配体复合物的动力学、热力学和结构特性，有助于揭示配体相互作用的分子机制，同时也可通过优化药物的结合能力与特异性，推动合理药物设计的发展。研究蛋白质-配体相互作用的一种经济且快速的方法是采用分子对接，这是一种计算方法，可对多种小分子进行虚拟筛选，并预测这些配体与靶标蛋白的结合模式和亲和力3。然而，来自X射线衍射（XRD）、核磁共振（NMR）或冷冻电子显微镜（cryoEM）测定的高分辨率结构的实验证据，为这些预测提供了必要的验证，并有助于开发针对特定靶标的新型且更有效的激活剂或抑制剂。本文使用缩写“cryoEM”，因为该技术通常如此称呼。然而，关于正确命名法的选择目前仍存在争议，最近有建议提出应使用低温样品电子显微镜（cryoEM）这一术语，以表明样品处于低温条件下并使用电子成像4。类似地，由cryoEM获得的图谱曾被称为电子势、静电势或库仑势，为简便起见，本文统一使用“cryoEM图谱”这一说法5,6,7,8,9,10。
尽管XRD一直是蛋白质-配体复合物高分辨率结构测定的金标准技术，但分辨率革命之后11 冷冻电镜技术已获得显著发展，这一点已有所体现&#160;由电子显微镜数据库（EMDB）中存储的库仑势能图或冷冻电镜图的激增12,13 在过去的几年中14由于样品制备、成像及数据处理方法的进步，蛋白质数据库（PDB）中的条目数量14 2010年至2020年间，采用冷冻电镜（cryoEM）解析的结构占比从0.7%上升至17%，其中约50%在2020年报道的结构分辨率达到3.5 Å或更高15,16冷冻电镜技术已被结构生物学界（包括制药行业）迅速采纳，因为它能够以接近原子级的分辨率研究具有柔性和非晶态特性的生物大分子，尤其是膜蛋白和多蛋白复合物，从而克服了X射线衍射（XRD）进行高分辨率结构解析所必需的结晶过程以及获得良好衍射晶体的难题。
在冷冻电镜图谱中精确地构建配体模型至关重要，因为这为蛋白质-配体复合物在分子水平上的结构提供了蓝图。X射线晶体学中使用了多种自动化的配体构建工具&#160;，这些工具依赖于配体电子密度的形状和拓扑特征，以将配体拟合或构建到电子密度中17,18,19,20。然而，当分辨率低于3 Å时，这些方法往往产生较差的结果，因为其所依赖用于识别和构建的拓扑特征变得不够清晰。在许多情况下，这些方法在将配体准确建模到冷冻电镜图谱中已被证明效果不佳，因为这些图谱通常处于中低分辨率范围，一般在3.5 Å–5 Å之间17。
通过冷冻电镜（cryoEM）测定蛋白质-配体复合物三维结构的第一步，是将配体与蛋白质共纯化（当配体对蛋白质具有高结合亲和力时），或在制备载网前将蛋白质溶液与配体孵育特定时间。随后，取少量样品滴加至经等离子体清洗的带孔透射电镜（TEM）载网上，迅速在液态乙烷中冷冻，最终使用冷冻透射电镜（cryo-TEM）进行成像。来自数十万至数百万个单颗粒的二维投影图像经平均处理后，重建出该大分子的三维（3D）库仑势图。在许多情况下，由于图谱中分辨率各向异性（即在整个大分子范围内分辨率不均一）、配体结合区域的柔性以及数据中的噪声等因素，识别并建模配体和溶剂分子仍面临重大挑战。许多原本为X射线衍射（XRD）开发的建模、精修和可视化工具，目前正被逐步适配用于冷冻电镜的相同目的18, 19, 20, 21。本文综述了当前用于识别配体、构建模型以及精修冷冻电镜所得坐标的各种方法和软件，并提供了一套逐步操作流程，以具体蛋白质-配体复合物为例，展示在不同分辨率和复杂程度下进行配体建模的过程。
在冷冻电镜图谱中对配体进行建模的第一步是识别图谱中的配体密度（非蛋白质部分）。如果配体结合未引起蛋白质发生任何构象变化，则通过计算蛋白-配体复合物与脱辅基蛋白之间的简单差值图谱，即可突出显示额外密度区域，从而提示配体的存在。此类差异可直接观察到，仅需两套图谱即可实现，甚至在三维精修过程中的中间图谱也可用于检测配体是否存在。此外，若分辨率足够高（&#60;3.0 Å），差值图谱还可提供与配体及蛋白质残基相互作用的水分子以及离子位置的信息。
在缺乏脱辅基蛋白（apo-protein）图谱的情况下，现在可以使用 Servalcat22，该工具既可作为独立程序使用，也已集成到 CCP-EM 软件套件23,24 中，作为 Refmac 精修程序的一部分，并包含在 CCP4 8.0 版本25,26 中。Servalcat 可利用未锐化处理的半图谱（half-maps）和脱辅基蛋白模型作为输入，计算 FSC 加权的差值图（Fo-Fc 图）。Fo-Fc 略过图（omit map）表示实验图谱（Fo）与模型衍生图谱（Fc）之间的差异。当模型中不存在配体时，Fo-Fc 图中与实验 EM 图谱重叠的正密度通常提示配体的存在。此处的假设是蛋白质主链在图谱中已得到良好拟合，因此残余的正密度指示了配体的位置。然而，必须仔细检查该正密度是否源于建模误差，例如蛋白质侧链构象（rotamer）错误所致。
第二步涉及利用现有的化学信息获取或构建具有明确定义几何结构的配体笛卡尔坐标文件。标准配体（例如 ATP 和 NADP+) 已在 CCP4 单体库中提供的组分，可通过获取其坐标文件和几何文件用于精修 通过 其单体入库代码。然而，对于未知或非标准配体，可使用多种工具生成几何文件。其中一些示例包括 eLBOW27 （电子配体构建与优化工作台）在 Phenix 中28Lidia — Coot 软件内置工具29, JLigand/ACEDRG30,31，CCP-EM23,24，Ligprep32- 使用 Schrodinger 套件中的 Glide 模块。随后，配体坐标文件在 Coot 中依据实验获得的冷冻电镜密度图和差值图进行拟合。接着在 Phenix 中进行实空间精修。28 或在 Refmac 中进行互易精修33一台配备高性能显卡和上述软件的Linux工作站或笔记本电脑是必需的。这些程序中的大多数包含在各种软件套件中。CCP-EM24&#160;和 Phenix28 可免费供学术用户使用，包含本文所用的多种工具，如 Coot、Refmac533,34,35,36、Servalcat、phenix.real_space_refine 等。同样地，&#160;嵌合体37，以及 ChimeraX38 为学术用户提供免费许可。

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>学术用户免费使用，包含 Coot 及为 X 射线晶体学开发的一系列工具</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>学术用户免费使用，包含 Coot、Relion 及其他多种软件</td></tr><tr><td>Coot&amp;nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td>通用的模型构建软件，也可作为上述其他软件套件的一部分使用</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Phenix 软件包中用于将模型对接到冷冻电镜图谱的工具</td></tr><tr><td>电子显微镜数据库&amp;nbsp;</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td><td>电子显微镜图谱的公共存储库</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>商业产品，Thermo Fisher 生产的相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phenix&amp;nbsp;</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>学术用户免费使用，包含 Coot</td></tr><tr><td>蛋白质数据库</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://rcsb.org</td><td>大分子结构的公共数据库</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td><td>分子可视化工具。教育版免费，但功能受限；完整版需支付少量费用获取。</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>用于冷冻电镜图像处理的软件，也可通过 CCP-EM 获取</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp;amp;&lt;br/&gt; gad_source=1&amp;amp;gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA&lt;br/&gt; AkZesWC4FYQSwIQRk&lt;br/&gt; ZApkj08MfYG040DtiiuL8&lt;br/&gt; RihoCebEQAvD_BwE</td><td>商业产品，Thermo Fisher 生产的冷冻透射电子显微镜</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>用于显示、分析等用途的通用软件</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td><td>用于显示、分析等用途的通用软件</td></tr></tbody></table>

将配体建模至电子冷冻显微镜解析的密度图中

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

解析大分子复合物中的蛋白质-配体相互作用对于理解分子机制、基本生物学过程以及药物开发至关重要。近年来，冷冻样品电子显微镜技术（cryoEM）已成为确定大分子结构并研究配体结合模式的一种强大手段，其分辨率可达到近原子级别。由于目标分子在不同方向上的分辨率各向异性以及数据本身固有的噪声，识别和建模cryoEM密度图中的非蛋白质分子通常具有挑战性。本文向读者介绍了当前用于配体识别、模型构建以及原子坐标精修的多种软件和方法，并以若干选定的大分子为例进行说明。以烯醇化酶为例，识别配体存在的最简单方法之一是将有配体与无配体状态下获得的两个密度图相减，配体的额外密度在差值图中即使在较高阈值下也往往清晰可见。然而，也存在无法生成此类简单差值图的情况，例如代谢型谷氨酸受体mGlu5的研究实例所示。近年来提出的一种Fo-Fc缺失图推导方法，可作为验证并展示配体存在性的有效工具。最后，以研究较为深入的β-半乳糖苷酶为例，分析了分辨率对在cryoEM密度图中建模配体及溶剂分子的影响，并展望了cryoEM在药物发现中的应用前景。

示例 1 
结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的烯醇化酶催化糖酵解的倒数第二步反应，将2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），而PEP是多种代谢途径中必需的中间产物44,45。对无配体烯醇化酶（apo-enolase）和PEP结合态烯醇化酶样品的冷冻电镜数据在相同的1.07 Å像素尺寸下采集，图像处理使用Relion 3.1软件完成46,47。无配体烯醇化酶和PEP结合态烯醇化酶结构的分辨率分别为3.1 Å和3.2 Å48。相关电子密度图和原子模型已存入EMDB和PDB数据库49,50（EMD-30988、EMD-30989、PDB-7e4x和PDB-7e51）。该酶的冷冻电镜图显示其在溶液中以八聚体形式存在（图1A）。为了识别PEP结合态烯醇化酶图谱中的配体密度，选取了无配体酶和PEP结合态酶的未锐化图谱，并在ChimeraX中通过从无配体酶图谱减去PEP结合态酶图谱的方式计算出差减图。在较高阈值下观察到明显的密度（绿色），提示存在配体（图1B）。在未锐化图谱中对蛋白链进行建模明确显示，额外的密度位于蛋白的活性位点内（图1C）。随后，在B因子锐化后的图谱中使用Coot软件对配体PEP进行建模，并利用Phenix软件在实空间中对蛋白-配体复合模型进行优化。在配体附近观察到的密度中还建模了两个Mg2+离子（图1D）。配体PEP的取向与其他烯醇化酶同源物中观察到的相似，多个活性位点残基（如Lys-386、Arg-364）与配体PEP形成氢键相互作用。Mg2+离子则与Asp-241、Glu-283、Asp-310以及PEP的磷酸基团形成金属配位键（图1D）。
示例 2 
在缺乏可用的脱辅基蛋白结构，或蛋白发生较大构象变化的情况下，无法按照上述方法计算差值图谱。2021年，剑桥分子生物学实验室的Garib Murshudov团队推出了Servalcat22，该工具采用Refmac实现了一套精修工作流程，并在精修后计算Fo-Fc差值图谱。Fo-Fc差值密度呈正峰提示存在在精修过程中未包含在模型中的分子或配体，本质上相当于一张缺失图（omit map）。然而，建议首先整体评估模型与图谱的拟合情况，然后再分析差值密度图谱。
为说明 Servalcat/Refmac 的使用，以 mGlu 为例5，选择了一种可结合神经递质L-谷氨酸的二聚体G蛋白偶联受体。当激动剂L-喹啉酸结合后，胞外结构域发生重排，进而引发七次跨膜区（7TM）的旋转，使其相互靠近以稳定激活状态。因此，在无配体结合状态/拮抗剂结合状态与激活状态之间可观察到显著的构象变化 与. 激动剂结合状态51 (图 2A 和 图2E）。激动剂（EMD-31536）和拮抗剂（EMD-31537）结合复合物的两个半图均来自EMDB，冷冻电镜图谱显示分子不同区域的分辨率存在差异，其中细胞外结构域的分辨率较高。随后，将这些半图与无配体蛋白（apo-protein）作为模型一起输入Servalcat，以计算每套数据的差值图（Fo-Fc图）。该图清晰显示了多种配体分子（非蛋白）的存在。根据FSC（傅里叶壳层相关系数）估计，激动剂和拮抗剂结合复合物的分辨率分别为3.8 Å和4.0 Å。在激动剂结合的mGlu5，Servalcat Fo-Fc 差值图显示了激动剂（L-quisqualate）的存在（图2B）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）（图 2C) 在受体的胞外域（ECD）中（由于跨膜域（TMD）分辨率较低，此处仅聚焦于ECD及TMD顶部）。可见Tyr-64、Trp-100、Ser-151和Thr-175等蛋白残基与激动剂发生相互作用。Asn-210残基附近的电子密度提示存在N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）图2C）。其密度与纯化 mGlu 过程中添加的胆固醇半琥珀酸酯一致5, 在跨膜螺旋1的顶端附近观察到图 2D）。由于分辨率适中，且配体L-quisqualate可呈现多种取向，因此参考了配体结合的胞外结构域先前结构（PDB-6N50）来对配体进行建模。拮抗剂的结合可稳定受体的开放态或静息态图2E)。在胞外域的Venus flytrap结构域的叶I和叶II的铰链区，观察到与拮抗剂LY341495密度一致的电子密度。该拮抗剂与类似于激动剂所结合的残基相互作用。叶II中的Tyr-223与拮抗剂之间的堆积相互作用使受体稳定在开放状态（图 2F）。与激动剂结构类似，在Asn-210附近也观察到糖基化或N-乙酰葡糖胺基团的存在（图 2G).
示例 3 
第三个示例阐明了在高分辨率冷冻电镜（CryoEM）图谱中对片段大小或小分子配体及溶剂分子进行建模的实验方案。基于片段的药物发现（Fragment-based Drug Discovery, FBDD）作为一种强大且创新的方法，已在多种疾病领域的靶向新药研发中崭露头角，成为制药行业极具前景的研究方向&amp;D52,53基于片段的药物发现（FBDD）始于对小分子片段的筛选与严格筛选，这些片段具有高溶解性、低分子量，并能结合特定的目标蛋白质或感兴趣的生物分子。测定这些蛋白质-片段复合物的结构可揭示片段的结合模式，从而为设计出对目标蛋白质具有更高亲和力和特异性的更大、更复杂的类药分子提供指导。54然而，该方法需要高分辨率的配体电子密度，以准确确定配体的构象并正确放置其官能团15.
β-半乳糖苷酶是首批通过冷冻电镜技术获得高分辨率结构的蛋白质之一，是一种被广泛研究的450 kDa同源四聚体酶，可催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖55。为展示冷冻电镜在片段筛选药物发现（FBDD）中的应用，英国Astex公司解析了β-半乳糖苷酶与一个片段大小的抑制剂——脱氧半乳糖-诺吉林霉素（DGN）结合于活性位点的结构（EMDB-10563，PDB:6tsh）56。该数据集用于说明如何在高分辨率电子密度图中明确地构建配体和溶剂分子的结构模型。为了展示分辨率对配体建模与可视化的影响，在Relion软件的后期处理步骤中，将密度图分别过滤至3.0 Å和3.5 Å分辨率。这突显了不同分辨率下电子密度图质量的差异，并强调了高分辨率对于准确构建配体和溶剂分子模型的重要性。
该酶在溶液中为具有 D2 对称性的四聚体（图 3A）。由 Servalcat 计算得到的差值电子密度图（图与模型之间的差值）显示，酶的活性位点中存在 DGN 及多个溶剂分子（图 3B）。在约 2.3 Å 分辨率下，电子密度呈现高分辨率特征，有助于在蛋白活性位点中精确建模抑制剂。观察到 DGN 与 Tyr-503 和 His-540 之间的相互作用（图 3C）。差值电子密度还提示存在与 DGN 及蛋白残基相互作用的溶剂分子。Mg2+ 和多个水分子被建模于电子密度中（图 3D）。观察到 Mg2+ 与 Glu-416、Glu-461 以及多个水分子之间的金属配位键（图 3D）。Mg2+ 通过一个水分子与 DGN 发生相互作用。
在3.5 Å和3.0 Å的较低分辨率下，配体的电子密度呈现为模糊的团块状，缺乏对配体进行精确建模所必需的高分辨率特征（图4A、B）。在此类分辨率下，水分子的密度几乎无法观察到。总之，随着分辨率的提高，特别是高于3.0 Å时，电子密度能够支持更多水分子的建模（图4C、D）。在约2.3 Å分辨率下，由于电子密度图中出现了清晰可辨的特征，能够准确确定配体手性中心的位置，同时也有助于水分子和Mg2+的定位与建模（图4C、D）。相比之下，Mg2+的电子密度在整个分辨率范围内均保持可识别（图4A–C）。
<img alt="冷冻电镜图示蛋白质复合物结构、肽结合位点及氨基酸相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66310/66310fig01v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在磷酸烯醇式丙酮酸配体的建模中 M. tuberculosis 烯醇化酶 (A) 显示了结合磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的烯醇化酶的B因子锐化图。该图表明烯醇化酶在溶液中呈八聚体状态，图中每个单体以不同颜色显示。B) 显示了无磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）结合的烯醇化酶（apo-Enolase）的未锐化冷冻电镜密度图（灰色），并叠加了PEP结合态与无配体态烯醇化酶未锐化密度图之间的差值图（绿色），提示配体PEP的存在。此图为用于展示配体存在的示范性密度图。C) 显示了烯醇化酶模型在未锐化的冷冻电镜图中的拟合情况，突出显示了差异密度相对于蛋白质的位置。蛋白质模型以卡通形式展示，并采用 Chainbow 着色。该图表明，额外的密度（绿色）存在于每个单体的活性位点中。D) 显示配体 PEP 被包裹在经 B 因子锐化处理的密度图中，呈蓝色。此外，还可见两个 Mg 的电子密度2+ 还观察到离子与多个活性位点残基（包括Ser-42、Asp-241、Glu-283、Asp-310）以及配体原子形成金属配位键。该配体与Lys-386、Lys-335和Arg-364形成氢键相互作用。蛋白质残基以棍状模型表示，Mg2+ 离子显示为紫色球体。图中各面板的图像（A-D）使用 PyMOL 生成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66310/66310fig01largev3.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白-配体复合物的结构生物学示意图；包含L-quisqualate、胆固醇和拮抗剂。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66310/66310fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：mGlu5受体中多种配体的鉴定、建模与可视化。 Fo-Fc缺失图谱使用Servalcat生成。（A）显示mGlu5受体二聚体结构（PDB-7fd8）的卡通表示，每个单体分别以青绿色和小麦色着色，并与激动剂L-quisqualate结合。所有在受体胞外区及跨膜区顶部鉴定出的配体均被包裹在Fo-Fc缺失图谱中，图谱呈绿色，等高线水平为6σ。（B）突出显示激动剂L-quisqualate在差值图谱中的拟合情况。L-quisqualate与多个mGlu5残基相互作用，包括Tyr-64、Trp-100、Ser-151、Thr-175和Gly-280。氢键相互作用以红色虚线表示。在（C）中，Asn-210附近出现额外电子密度，该位置位于受体的胞外区，据此建模了N-乙酰葡糖胺分子（NAG）。为清晰起见，本图中NAG未与Asn连接。（D）显示在受体脂质暴露表面附近呈绿色的胆固醇半琥珀酸酯（CHS）的差值密度图。CHS分子以棍状表示，并基于该密度进行建模。（E）显示mGlu5受体结构（PDB-7fd9）与拮抗剂LY341495结合的卡通表示。（F）中，在胞外区lobe I与lobe II铰链处的Fo-Fc差值图谱中观察到额外密度，提示拮抗剂的存在。拮抗剂周围的關鍵残基（Tyr-64、Trp-100、Ser-152、Ser-173、Thr-175和Tyr-223）以棍状表示，与拮抗剂可能形成的氢键相互作用以红色虚线表示。（G）显示在拮抗剂结合结构中Asn-210附近存在NAG分子的差值密度提示（注：为清晰起见，图中NAG未与Asn连接）。图像由Pymol生成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66310/66310fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质复合物示意图、结构分析、原子结合相互作用、电子密度图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66310/66310fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在β-半乳糖苷酶高分辨率图谱（EMD-10563）中鉴定、建模并优化一个小分子抑制剂和溶剂分子。 （A）显示了以卡通形式表示的β-半乳糖苷酶模型，分辨率为2.3 Å（PDB: 6tsh），每个单体以不同颜色着色。灰色框标示了配体结合位点。（B）展示了酶活性位点中来自Servalcat的Fo-Fc差值密度（绿色网格）。密度差异提示活性位点中存在抑制剂（DGN）和多个溶剂分子。（C）表明在Fo-Fc图谱引导下，将脱氧半乳糖-诺吉林霉素（deoxygalacto-nojirimycin, DGN）建模至活性位点。该建模配体以棍状形式显示，并包裹在Servalcat生成的Fo密度（蓝色网格）中。观察到DGN与多个蛋白残基（包括Tyr-503和His-540）之间存在氢键相互作用。配体周围额外的Fo-Fc差值密度（绿色）提示存在溶剂分子。（D）图中显示在确认每个溶剂分子均与蛋白残基（Glu-416、His-418和Glu-461）或配体残基成键后，将多个溶剂分子（包括水分子和Mg2+）建模至活性位点，分别以红色和紫色球体表示。水分子和Mg2+均被包裹在Fo密度（蓝色网格）中。Mg2+通过一个水分子与配体DGN发生相互作用。图（B, C）中的Fo-Fc图谱（绿色网格）等高线水平设为6σ，而图C和D中的Fo密度（蓝色网格，来自建模后的Servalcat优化）等高线水平设为3σ。图（A–D）由Pymol生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66310/66310fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质-配体结合示意图及电子密度图；结构生物学可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66310/66310fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：分辨率对β-半乳糖苷酶中配体建模的影响。 使用EMD-10563的半图作为Relion后处理步骤的输入，并将合并后的后处理图谱分别用不同的B因子过滤至2.3 Å、3.0 Å和3.5 Å分辨率。所有图中图谱的等高线均设定为6σ。为清晰起见，图A、B和C中仅显示蛋白质主链，未显示侧链、配体或溶剂分子。（A）图谱被过滤至3.5 Å分辨率，显示β-半乳糖苷酶的活性位点。在此分辨率下可见一个类似配体DGN的电子密度团块，周围还伴随几个较小的团块。由于图谱中缺乏明确的特征，将配体以正确取向建模具有挑战性。（B）图谱被过滤至3.0 Å分辨率。此时，配体的密度团块略为清晰，但总体上仍缺乏细节特征。此外还可观察到更多提示为溶剂分子的小团块。（C）图谱被过滤至2.3 Å分辨率，配体的电子密度呈现出明显特征，特别是清晰显示出亚氨基糖的椅式构象。在此分辨率下还观察到大量对应于水分子的小团块。Relion后处理中的自动B因子估计/锐化功能对过滤至3 Å和3.5 Å的图谱给出-18 Å2的B因子值，而对过滤至2.3 Å的图谱则为-52 Å2。EM图谱的不同B因子锐化也可在Coot中进行，并有助于模型构建。（D）该图显示在2.3 Å分辨率下，于活性位点建模的配体DGN（棍状表示）、Mg2+以及水分子（球状表示），以及围绕这些原子的蓝色网格表示的锐化图谱。图（A-D）使用Pymol生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66310/66310fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了在大分子冷冻电镜图谱中对小分子配体进行建模可用的工具。

解析大分子复合物中蛋白质与配体的相互作用对于理解其潜在的生物学分子机制至关重要……

我们致力于研究细胞内发生的各种生理过程，特别是细胞膜界面处的生理活动。我们主要采用冷冻电镜技术，致力于解决多个有趣且具有挑战性的生物学问题，研究多种大分子复合物。几十年前，测定膜蛋白及其他不稳定复合物的结构仍是一项极具挑战性的工作。然而，冷冻电镜（cryoEM）技术的进步以及新型去垢剂和类脂模拟环境的发展，为这些复合物的快速结构解析铺平了道路。如今，这些结构可实现高分辨率解析，并有望用于药物发现。在单颗粒冷冻电镜技术中，面临的挑战包括获得稳定且均一的样品、将样品以随机取向包埋于薄冰层中、处理大量低信噪比的图像，以及在三维重构过程中准确确定颗粒的角取向并进行分类。由于数据本身存在噪声、各向同性及低分辨率、样品异质性以及配体的柔性，识别和建模配体-蛋白复合物的冷冻电镜（cryoEM）图谱中的小分子具有挑战性。本实验方案旨在提供逐步指导，用于在中低分辨率的冷冻电镜图谱中识别和建模配体及溶剂分子。首先，从EMDB数据库的附加数据中下载未锐化的半图谱（apo-enolase的半图谱）。然后打开 ChimeraX，点击工具栏中的“Open”。选择去辅因子烯醇化酶（apo-enolase）的两个半图（half maps）。在命令行中输入以下命令，以合并两个半图并获得去辅因子烯醇化酶的未锐化图（unsharpened map）。将图谱的阈值调整为 0.0595 以减少噪声。然后输入此命令以重命名合并后的图谱。点击“打开”。选择PEP烯醇化酶未锐化半图，并在命令行中输入此命令。将图的阈值调整为0.0721以降低噪声，并重命名该图。然后显示apo-烯醇化酶和PEP烯醇化酶未锐化图，在图层面板中点击拟合（Fit），以计算差值图。在命令行中输入此命令，从apo-烯醇酶图谱中减去PEP烯醇酶图谱并调整阈值。将相减后的图谱着色为绿色，表示正密度。接下来，打开PDB并下载结核分枝杆菌八聚体烯醇酶的坐标文件。然后在 ChimeraX 中，单击工具栏上的“Open”并选择文件名。点击“Molecule Display”（分子显示），隐藏原子（Hide Atoms），显示卡通图（Show Cartoon）。输入以下命令以重命名模型。从模型面板中选择模型。点击工具栏中的鼠标右键，然后选择“移动模型”，并将模型定位到接近 PEP 烯醇化酶图谱的位置。将模型与图谱对齐。在命令行中输入此命令，将该模型拟合到未锐化的 PEP 烯醇化酶图谱中。检查拟合情况。调整颜色和结构表示方式。在终端中输入 coot 命令以打开 Coot。点击文件（File），然后选择打开坐标（Open Coordinates），并选择 Apo-enolase.pdb。接下来，从 EMDB 下载 PEP 结合型烯醇化酶的锐化图谱。通过点击“文件”并选择“打开地图”，在 Coot 中显示此地图。滚动鼠标中键，将阈值设置为 7.00 sigma。然后点击“验证”，选择“未建模的斑点”。在新窗口中，输入 7.00 作为 RMSD 值，然后点击 Find Blobs。在活性位点残基丝氨酸-42、赖氨酸-386 和精氨酸-364 附近找到未建模的配体电子密度。接着，点击 File，选择 Get Monomer，并输入 PEP，以从 Coot 单体库中获取 PEP 单体模型文件。使用侧边栏菜单中的“旋转/平移区域链分子”选项，将PEP分子移至密度图中。然后点击侧边栏菜单中的“实空间精修区域”以拟合PEP分子与密度图。评估拟合效果，完成后点击“接受”。在“编辑”选项卡中使用“合并分子”选项，将拟合后的配体与脱辅基烯醇化酶模型合并，并将模型保存为 pep-enolase.pdb。然后点击“计算”、“NCS 工具”，接着选择“NCS 配体”，以向坐标文件中的其余单体添加配体。对于具有 NCS 选项的蛋白质，选择坐标文件 apo-enolase。以 pdb 及链 ID A 作为 NCS 主链。接下来，对于含有配体的分子，选择 apo-烯醇酶 pdb 作为坐标文件，链 ID J，残基编号 1 至 1。单击“查找候选位点”。单击各个候选配体，目视分析其结合情况。然后通过单击“在指针处放置原子”并在指针原子类型列表中选择 Mg，在活性位点的电子密度中构建两个镁离子模型。同时，在对称相关的单体中添加镁离子。评估对称相关镁原子的拟合情况。单击文件，然后选择保存坐标，选择文件名，并输入 Enolase+PEP+Mg.pdb 来保存模型。然后打开 Phenix 图形界面。使用保存的模型和 PEP 结合态的锐化密度图，以默认参数运行实空间 refinement 任务。为可视化建模的配体，打开 PyMOL。单击“文件”然后选择“打开”，以加载来自 Phenix 优化作业的优化后模型。同时加载 PEP 结合态的锐化图谱。通过单击“操作”然后选择“重命名”，将该图谱重命名为 PEP-锐化。然后通过点击“Display”后选择“Sequence”来选定配体。在命令行中输入此命令，然后按回车。这将围绕选定区域切割出电子密度图。单击网格配体对象旁边的最后一个方框 C，将配体网格的颜色更改为蓝色。以棍状-球状表示法显示与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和镁离子相互作用的活性位点残基，以卡通表示法显示烯醇酶。设置网格大小。在命令行中输入此命令以执行光线追踪，并将图像保存为 PNG 文件。在糖酵解过程中，烯醇化酶将 2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，后者是多种代谢途径中的重要中间产物。脱辅酶与磷酸烯醇式丙酮酸结合酶的差值图显示了明显的配体电子密度。此外，在模拟蛋白质的活性位点中观察到额外的电子密度。在配体附近观察到的电子密度区域中，建模了磷酸烯醇式丙酮酸和两个镁离子。磷酸烯醇式丙酮酸与多个活性位点残基（如赖氨酸-386和精氨酸-364）形成了氢键。镁离子与天冬氨酸-241、谷氨酸-283、天冬氨酸-310以及磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基团形成了金属配位键。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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