将配体建模至电子冷冻显微镜解析的密度图中

我们致力于研究细胞内发生的各种生理过程，特别是细胞膜界面处的生理活动。我们主要采用冷冻电镜技术，致力于解决多个有趣且具有挑战性的生物学问题，研究多种大分子复合物。几十年前，测定膜蛋白及其他不稳定复合物的结构仍是一项极具挑战性的工作。

然而，冷冻电镜（cryoEM）技术的进步以及新型去垢剂和类脂模拟环境的发展，为这些复合物的快速结构解析铺平了道路。如今，这些结构可实现高分辨率解析，并有望用于药物发现。在单颗粒冷冻电镜技术中，面临的挑战包括获得稳定且均一的样品、将样品以随机取向包埋于薄冰层中、处理大量低信噪比的图像，以及在三维重构过程中准确确定颗粒的角取向并进行分类。

由于数据本身存在噪声、各向同性及低分辨率、样品异质性以及配体的柔性，识别和建模配体-蛋白复合物的冷冻电镜（cryoEM）图谱中的小分子具有挑战性。本实验方案旨在提供逐步指导，用于在中低分辨率的冷冻电镜图谱中识别和建模配体及溶剂分子。首先，从EMDB数据库的附加数据中下载未锐化的半图谱（apo-enolase的半图谱）。

然后打开 ChimeraX，点击工具栏中的“Open”。选择去辅因子烯醇化酶（apo-enolase）的两个半图（half maps）。在命令行中输入以下命令，以合并两个半图并获得去辅因子烯醇化酶的未锐化图（unsharpened map）。

将图谱的阈值调整为 0.0595 以减少噪声。然后输入此命令以重命名合并后的图谱。点击“打开”。

选择PEP烯醇化酶未锐化半图，并在命令行中输入此命令。将图的阈值调整为0.0721以降低噪声，并重命名该图。然后显示apo-烯醇化酶和PEP烯醇化酶未锐化图，在图层面板中点击拟合（Fit），以计算差值图。

在命令行中输入此命令，从apo-烯醇酶图谱中减去PEP烯醇酶图谱并调整阈值。将相减后的图谱着色为绿色，表示正密度。接下来，打开PDB并下载结核分枝杆菌八聚体烯醇酶的坐标文件。

然后在 ChimeraX 中，单击工具栏上的“Open”并选择文件名。点击“Molecule Display”（分子显示），隐藏原子（Hide Atoms），显示卡通图（Show Cartoon）。输入以下命令以重命名模型。

从模型面板中选择模型。点击工具栏中的鼠标右键，然后选择“移动模型”，并将模型定位到接近 PEP 烯醇化酶图谱的位置。

将模型与图谱对齐。在命令行中输入此命令，将该模型拟合到未锐化的 PEP 烯醇化酶图谱中。检查拟合情况。

调整颜色和结构表示方式。在终端中输入 coot 命令以打开 Coot。点击文件（File），然后选择打开坐标（Open Coordinates），并选择 Apo-enolase.pdb。接下来，从 EMDB 下载 PEP 结合型烯醇化酶的锐化图谱。

通过点击“文件”并选择“打开地图”，在 Coot 中显示此地图。滚动鼠标中键，将阈值设置为 7.00 sigma。然后点击“验证”，选择“未建模的斑点”。

在新窗口中，输入 7.00 作为 RMSD 值，然后点击 Find Blobs。在活性位点残基丝氨酸-42、赖氨酸-386 和精氨酸-364 附近找到未建模的配体电子密度。接着，点击 File，选择 Get Monomer，并输入 PEP，以从 Coot 单体库中获取 PEP 单体模型文件。

使用侧边栏菜单中的“旋转/平移区域链分子”选项，将PEP分子移至密度图中。然后点击侧边栏菜单中的“实空间精修区域”以拟合PEP分子与密度图。评估拟合效果，完成后点击“接受”。

在“编辑”选项卡中使用“合并分子”选项，将拟合后的配体与脱辅基烯醇化酶模型合并，并将模型保存为 pep-enolase.pdb。然后点击“计算”、“NCS 工具”，接着选择“NCS 配体”，以向坐标文件中的其余单体添加配体。对于具有 NCS 选项的蛋白质，选择坐标文件 apo-enolase。

以 pdb 及链 ID A 作为 NCS 主链。接下来，对于含有配体的分子，选择 apo-烯醇酶 pdb 作为坐标文件，链 ID J，残基编号 1 至 1。

单击“查找候选位点”。单击各个候选配体，目视分析其结合情况。然后通过单击“在指针处放置原子”并在指针原子类型列表中选择 Mg，在活性位点的电子密度中构建两个镁离子模型。

同时，在对称相关的单体中添加镁离子。评估对称相关镁原子的拟合情况。单击文件，然后选择保存坐标，选择文件名，并输入 Enolase+PEP+Mg.pdb 来保存模型。

然后打开 Phenix 图形界面。使用保存的模型和 PEP 结合态的锐化密度图，以默认参数运行实空间 refinement 任务。为可视化建模的配体，打开 PyMOL。

单击“文件”然后选择“打开”，以加载来自 Phenix 优化作业的优化后模型。同时加载 PEP 结合态的锐化图谱。通过单击“操作”然后选择“重命名”，将该图谱重命名为 PEP-锐化。

然后通过点击“Display”后选择“Sequence”来选定配体。在命令行中输入此命令，然后按回车。这将围绕选定区域切割出电子密度图。

单击网格配体对象旁边的最后一个方框 C，将配体网格的颜色更改为蓝色。以棍状-球状表示法显示与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和镁离子相互作用的活性位点残基，以卡通表示法显示烯醇酶。设置网格大小。

在命令行中输入此命令以执行光线追踪，并将图像保存为 PNG 文件。在糖酵解过程中，烯醇化酶将 2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，后者是多种代谢途径中的重要中间产物。脱辅酶与磷酸烯醇式丙酮酸结合酶的差值图显示了明显的配体电子密度。

此外，在模拟蛋白质的活性位点中观察到额外的电子密度。在配体附近观察到的电子密度区域中，建模了磷酸烯醇式丙酮酸和两个镁离子。磷酸烯醇式丙酮酸与多个活性位点残基（如赖氨酸-386和精氨酸-364）形成了氢键。

镁离子与天冬氨酸-241、谷氨酸-283、天冬氨酸-310以及磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基团形成了金属配位键。