Name: 将配体建模为源自电子冷冻显微镜的图谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解如何在冷冻电镜图谱中对小分子配体进行建模，以研究膜蛋白结构并促进药物发现。本方案详细介绍了使用单颗粒冷冻电镜技术进行三维重建和配体拟合的完整流程。

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SJ 是 DAE-TIFR 博士奖学金的获得者，特此致谢相关资助。KRV 感谢 DBT B-Life 项目（项目编号：DBT/PR12422/MED/31/287/2014）以及印度政府原子能部在项目编号 RTI4006 下提供的支持。

Modeling Small Molecule Ligands in CryoEM Maps of Macromolecules

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，显微镜硬件和软件的进步使得冷冻电镜（cryoEM）结构的数量显著增加。尽管目前单颗粒冷冻电镜所能达到的最高分辨率为1.2 Å57,58,59，但大多数结构的分辨率仍集中在3–4 Å范围内。在中等至低分辨率的密度图中构建配体模型具有挑战性，常常存在不确定性。鉴于冷冻电镜在学术界和制药行业广泛应用于转化研究和药物发现，确保配体模型的准确性与无歧义至关重要。因此，通过计算Q分数60来量化配体原子的可分辨性是合理且必要的做法，目前该指标已作为评估密度图质量和模型拟合度的参数，被整合至EMDB数据库和Chimera软件中。
在第一个示例中，使用 ChimeraX 计算结核分枝杆菌（M. tuberculosis）烯醇化酶中脱辅基状态与配体结合状态在实空间中的差异图。在较高阈值下出现的额外电子密度提示配体磷酸烯醇式丙酮酸（phospho...

细胞通过同时且独立地进行无数化学反应来实现其功能，每个反应都受到精细调控，以确保细胞在响应环境信号时的生存与适应能力。这种调控通过分子识别实现，即生物分子（尤其是蛋白质）能够与其他大分子以及小分子或配体形成瞬时或稳定的复合物1。因此，蛋白质-配体相互作用是所有生物学过程的基础，包括蛋白质表达和活性的调控、酶对底物和辅因子的识别，以及细胞对信号的感知与传递1,2。深入理解蛋白质-配体复合物的动力学、热力学和结构特性，有助于揭示配体相互作用的分子机制，同时也可通过优化药物的结合能力与特异性，推动合理药物设计的发展。研究蛋白质-配体相互作用的一种经济且快速的方法是采用分子对接，这是一种计算方法，可对多种小分子进行虚拟筛选，并预测这些配体与靶标蛋白的结合模式和亲和力3。然而，来自X射线衍射（XRD）、核磁共振（NMR）或冷冻电子显微镜（cryoEM）测定的高分辨率结构的实验证据，为这些预测提供了必要的验证，并有助于开发针对特定靶标的新型且更有效的激活剂或抑制剂。本文使用缩写“cryoEM”，因为该技术通常如此称呼。然而，关于正确命名法的选择目前仍存在争议，最近有建议提出应使用低温样品电子显微镜（cryoEM）这一术语，以表明样品处于低温条件下并使用电子成像4。类似地，由cryoEM获得的图谱曾被称为电子势、静电势或库仑势，为简便起见，本文统一使用“cryoEM图谱”这一说法5,6,7,8,9,10。
尽管XRD一直是蛋白质-配体复合物高分辨率结构测定的金标准技术，但分辨率革命之后11 冷冻电镜技术已获得显著发展，这一点已有所体现&#160;由电子显微镜数据库（EMDB）中存储的库仑势能图或冷冻电镜图的激增12,13 在过去的几年中14由于样品制备、成像及数据处理方法的进步，蛋白质数据库（PDB）中的条目数量14 2010年至2020年间，采用冷冻电镜（cryoEM）解析的结构占比从0.7%上升至17%，其中约50%在2020年报道的结构分辨率达到3.5 Å或更高15,16冷冻电镜技术已被结构生物学界（包括制药行业）迅速采纳，因为它能够以接近原子级的分辨率研究具有柔性和非晶态特性的生物大分子，尤其是膜蛋白和多蛋白复合物，从而克服了X射线衍射（XRD）进行高分辨率结构解析所必需的结晶过程以及获得良好衍射晶体的难题。
在冷冻电镜图谱中精确地构建配体模型至关重要，因为这为蛋白质-配体复合物在分子水平上的结构提供了蓝图。X射线晶体学中使用了多种自动化的配体构建工具&#160;，这些工具依赖于配体电子密度的形状和拓扑特征，以将配体拟合或构建到电子密度中17,18,19,20。然而，当分辨率低于3 Å时，这些方法往往产生较差的结果，因为其所依赖用于识别和构建的拓扑特征变得不够清晰。在许多情况下，这些方法在将配体准确建模到冷冻电镜图谱中已被证明效果不佳，因为这些图谱通常处于中低分辨率范围，一般在3.5 Å–5 Å之间17。
通过冷冻电镜（cryoEM）测定蛋白质-配体复合物三维结构的第一步，是将配体与蛋白质共纯化（当配体对蛋白质具有高结合亲和力时），或在制备载网前将蛋白质溶液与配体孵育特定时间。随后，取少量样品滴加至经等离子体清洗的带孔透射电镜（TEM）载网上，迅速在液态乙烷中冷冻，最终使用冷冻透射电镜（cryo-TEM）进行成像。来自数十万至数百万个单颗粒的二维投影图像经平均处理后，重建出该大分子的三维（3D）库仑势图。在许多情况下，由于图谱中分辨率各向异性（即在整个大分子范围内分辨率不均一）、配体结合区域的柔性以及数据中的噪声等因素，识别并建模配体和溶剂分子仍面临重大挑战。许多原本为X射线衍射（XRD）开发的建模、精修和可视化工具，目前正被逐步适配用于冷冻电镜的相同目的18, 19, 20, 21。本文综述了当前用于识别配体、构建模型以及精修冷冻电镜所得坐标的各种方法和软件，并提供了一套逐步操作流程，以具体蛋白质-配体复合物为例，展示在不同分辨率和复杂程度下进行配体建模的过程。
在冷冻电镜图谱中对配体进行建模的第一步是识别图谱中的配体密度（非蛋白质部分）。如果配体结合未引起蛋白质发生任何构象变化，则通过计算蛋白-配体复合物与脱辅基蛋白之间的简单差值图谱，即可突出显示额外密度区域，从而提示配体的存在。此类差异可直接观察到，仅需两套图谱即可实现，甚至在三维精修过程中的中间图谱也可用于检测配体是否存在。此外，若分辨率足够高（&#60;3.0 Å），差值图谱还可提供与配体及蛋白质残基相互作用的水分子以及离子位置的信息。
在缺乏脱辅基蛋白（apo-protein）图谱的情况下，现在可以使用 Servalcat22，该工具既可作为独立程序使用，也已集成到 CCP-EM 软件套件23,24 中，作为 Refmac 精修程序的一部分，并包含在 CCP4 8.0 版本25,26 中。Servalcat 可利用未锐化处理的半图谱（half-maps）和脱辅基蛋白模型作为输入，计算 FSC 加权的差值图（Fo-Fc 图）。Fo-Fc 略过图（omit map）表示实验图谱（Fo）与模型衍生图谱（Fc）之间的差异。当模型中不存在配体时，Fo-Fc 图中与实验 EM 图谱重叠的正密度通常提示配体的存在。此处的假设是蛋白质主链在图谱中已得到良好拟合，因此残余的正密度指示了配体的位置。然而，必须仔细检查该正密度是否源于建模误差，例如蛋白质侧链构象（rotamer）错误所致。
第二步涉及利用现有的化学信息获取或构建具有明确定义几何结构的配体笛卡尔坐标文件。标准配体（例如 ATP 和 NADP+) 已在 CCP4 单体库中提供的组分，可通过获取其坐标文件和几何文件用于精修 通过 其单体入库代码。然而，对于未知或非标准配体，可使用多种工具生成几何文件。其中一些示例包括 eLBOW27 （电子配体构建与优化工作台）在 Phenix 中28Lidia — Coot 软件内置工具29, JLigand/ACEDRG30,31，CCP-EM23,24，Ligprep32- 使用 Schrodinger 套件中的 Glide 模块。随后，配体坐标文件在 Coot 中依据实验获得的冷冻电镜密度图和差值图进行拟合。接着在 Phenix 中进行实空间精修。28 或在 Refmac 中进行互易精修33一台配备高性能显卡和上述软件的Linux工作站或笔记本电脑是必需的。这些程序中的大多数包含在各种软件套件中。CCP-EM24&#160;和 Phenix28 可免费供学术用户使用，包含本文所用的多种工具，如 Coot、Refmac533,34,35,36、Servalcat、phenix.real_space_refine 等。同样地，&#160;嵌合体37，以及 ChimeraX38 为学术用户提供免费许可。

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>学术用户免费使用，包含 Coot 及为 X 射线晶体学开发的一系列工具</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>学术用户免费使用，包含 Coot、Relion 及其他多种软件</td></tr><tr><td>Coot&amp;nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td>通用的模型构建软件，也可作为上述其他软件套件的一部分使用</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Phenix 软件包中用于将模型对接到冷冻电镜图谱的工具</td></tr><tr><td>电子显微镜数据库&amp;nbsp;</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td><td>电子显微镜图谱的公共存储库</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>商业产品，Thermo Fisher 生产的相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phenix&amp;nbsp;</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>学术用户免费使用，包含 Coot</td></tr><tr><td>蛋白质数据库</td><td>多家机构组成的联盟</td><td>https://rcsb.org</td><td>大分子结构的公共数据库</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td><td>分子可视化工具。教育版免费，但功能受限；完整版需支付少量费用获取。</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>用于冷冻电镜图像处理的软件，也可通过 CCP-EM 获取</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp;amp;&lt;br/&gt; gad_source=1&amp;amp;gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA&lt;br/&gt; AkZesWC4FYQSwIQRk&lt;br/&gt; ZApkj08MfYG040DtiiuL8&lt;br/&gt; RihoCebEQAvD_BwE</td><td>商业产品，Thermo Fisher 生产的冷冻透射电子显微镜</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>用于显示、分析等用途的通用软件</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td><td>用于显示、分析等用途的通用软件</td></tr></tbody></table>

将配体建模至电子冷冻显微镜解析的密度图中

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

解析大分子复合物中的蛋白质-配体相互作用对于理解分子机制、基本生物学过程以及药物开发至关重要。近年来，冷冻样品电子显微镜技术（cryoEM）已成为确定大分子结构并研究配体结合模式的一种强大手段，其分辨率可达到近原子级别。由于目标分子在不同方向上的分辨率各向异性以及数据本身固有的噪声，识别和建模cryoEM密度图中的非蛋白质分子通常具有挑战性。本文向读者介绍了当前用于配体识别、模型构建以及原子坐标精修的多种软件和方法，并以若干选定的大分子为例进行说明。以烯醇化酶为例，识别配体存在的最简单方法之一是将有配体与无配体状态下获得的两个密度图相减，配体的额外密度在差值图中即使在较高阈值下也往往清晰可见。然而，也存在无法生成此类简单差值图的情况，例如代谢型谷氨酸受体mGlu5的研究实例所示。近年来提出的一种Fo-Fc缺失图推导方法，可作为验证并展示配体存在性的有效工具。最后，以研究较为深入的β-半乳糖苷酶为例，分析了分辨率对在cryoEM密度图中建模配体及溶剂分子的影响，并展望了cryoEM在药物发现中的应用前景。

示例 1 
结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的烯醇化酶催化糖酵解的倒数第二步反应，将2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），而PEP是多种代谢途径中必需的中间产物44,45。对无配体烯醇化酶（apo-enolase）和PEP结合态烯醇化酶样品的冷冻电镜数据在相同的1.07 Å像素尺寸下采集，图像处理使用Relion 3.1软件完成46,47。无配体烯醇化酶和PEP结合态烯醇化酶结构的分辨率分别为3.1 Å和3.2 Å48。相关电子密度图和原子模型已存入EMDB和PDB数据库49,50（EMD-30988、EMD-30989、PDB-7e4x和PDB-7e51）。该...

本方案介绍了在大分子冷冻电镜图谱中对小分子配体进行建模可用的工具。

解析大分子复合物中蛋白质与配体的相互作用对于理解其潜在的生物学分子机制至关重要……

我们致力于研究细胞内发生的各种生理过程，特别是细胞膜界面处的生理活动。我们主要采用冷冻电镜技术，致力于解决多个有趣且具有挑战性的生物学问题，研究多种大分子复合物。几十年前，测定膜蛋白及其他不稳定复合物的结构仍是一项极具挑战性的工作。然而，冷冻电镜（cryoEM）技术的进步以及新型去垢剂和类脂模拟环境的发展，为这些复合物的快速结构解析铺平了道路。如今，这些结构可实现高分辨率解析，并有望用于药物发现。在单颗粒冷冻电镜技术中，面临的挑战包括获得稳定且均一的样品、将样品以随机取向包埋于薄冰层中、处理大量低信噪比的图像，以及在三维重构过程中准确确定颗粒的角取向并进行分类。由于数据本身存在噪声、各向同性及低分辨率、样品异质性以及配体的柔性，识别和建模配体-蛋白复合物的冷冻电镜（cryoEM）图谱中的小分子具有挑战性。本实验方案旨在提供逐步指导，用于在中低分辨率的冷冻电镜图谱中识别和建模配体及溶剂分子。首先，从EMDB数据库的附加数据中下载未锐化的半图谱（apo-enolase的半图谱）。然后打开 ChimeraX，点击工具栏中的“Open”。选择去辅因子烯醇化酶（apo-enolase）的两个半图（half maps）。在命令行中输入以下命令，以合并两个半图并获得去辅因子烯醇化酶的未锐化图（unsharpened map）。将图谱的阈值调整为 0.0595 以减少噪声。然后输入此命令以重命名合并后的图谱。点击“打开”。选择PEP烯醇化酶未锐化半图，并在命令行中输入此命令。将图的阈值调整为0.0721以降低噪声，并重命名该图。然后显示apo-烯醇化酶和PEP烯醇化酶未锐化图，在图层面板中点击拟合（Fit），以计算差值图。在命令行中输入此命令，从apo-烯醇酶图谱中减去PEP烯醇酶图谱并调整阈值。将相减后的图谱着色为绿色，表示正密度。接下来，打开PDB并下载结核分枝杆菌八聚体烯醇酶的坐标文件。然后在 ChimeraX 中，单击工具栏上的“Open”并选择文件名。点击“Molecule Display”（分子显示），隐藏原子（Hide Atoms），显示卡通图（Show Cartoon）。输入以下命令以重命名模型。从模型面板中选择模型。点击工具栏中的鼠标右键，然后选择“移动模型”，并将模型定位到接近 PEP 烯醇化酶图谱的位置。将模型与图谱对齐。在命令行中输入此命令，将该模型拟合到未锐化的 PEP 烯醇化酶图谱中。检查拟合情况。调整颜色和结构表示方式。在终端中输入 coot 命令以打开 Coot。点击文件（File），然后选择打开坐标（Open Coordinates），并选择 Apo-enolase.pdb。接下来，从 EMDB 下载 PEP 结合型烯醇化酶的锐化图谱。通过点击“文件”并选择“打开地图”，在 Coot 中显示此地图。滚动鼠标中键，将阈值设置为 7.00 si

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