蛋白质-蛋白质相互作用中潜在多特异性肽结合结构域的氨基酸偏好计算预测

我们提出了一种用于计算预测更特异性蛋白质-蛋白质相互作用中氨基酸偏好的实验方案。该方案可被视为设计这些相互作用介导分子的第一步。我们的研究目标是将这些介导分子用作免疫学技术中特定相互作用的潜在抑制剂。

用于表征特定结合位点间氨基酸偏好的现有方法成本高昂且操作繁琐。我们的方案是一种基于高效性和系列化操作的生物技术支持的技术。该策略有望处理大量序列，提供全面且一致的氨基酸偏好差异信息。

本方案通过处理大量DNA序列，提供了一种经济高效的专业方法，相较于网络实验室方法通常受限的序列数量及其处理能力，本方案更具优势。除了免疫学相关产物抑制剂的开发外，我们还希望将该方法的性能与其他产品系列进行比较。这将有助于我们更深入地理解多特异性的结构基础，不仅限于免疫学范畴，还包括信号传导与细胞间通讯等其他细胞功能。

首先下载蛋白质-蛋白质复合物的结构。为此，请进入蛋白质数据库主页，在主搜索框中输入 PDB ID。在该结构的主页面上，点击“下载文件”，然后点击“生物组装 1”以 PDB gz 格式下载文件。

在 UCSF Chimera 中打开下载的结构。依次导航至“工具”（Tools）、“结构编辑”（Structure Editing），然后点击“更改链 ID”（Change Chain IDs）。将最初标记为 A 的第二条链重命名为 B。接着，点击“收藏夹”（Favorites），然后选择“模型面板”（Model Panel）。

选择包含两条链的模型，然后点击分组/取消分组按钮，将每条链分离为不同的模型。接着，选中这两个模型，点击复制/合并按钮。为合并后的模型输入新的名称。

勾选“关闭源模型”，然后点击“确定”。点击“选择”，再选择“链”，并确认二聚体中的链现在已标识为 A 和 B。点击“文件”并保存 PDB，将编辑后的结构另存为新的 PDB 文件。为了识别配体蛋白中的目标片段，请访问 BUDE 丙氨酸扫描服务器。在“结构上传”部分下方点击“选择文件”按钮，并上传已保存的 PDB 文件。

在下一页，检查结构是否已正确加载，并在服务器中为该任务输入名称。将链 A 设置为受体，链 B 设置为配体，然后点击“开始扫描”按钮以提交任务。任务完成后，点击“显示结果”以打开结果页面。

从残基列表中选择一段被预测能更好地与目标结合表面相互作用的残基。根据本方案，预测出一段氨基酸片段可与IRF5结合表面发生相互作用。通过计算性丙氨酸扫描突变分析，预测得到一段由第424至436位共13个氨基酸组成的片段，其中pLxIS基序从第432位精氨酸开始。

首先，为进行序列多样化，准备蛋白质-多肽界面。在 Chimera 中打开 PDB 文件，并确保目标亚基的结构完整，无任何缺失的原子或化学键。若需从结构中移除所有非必需分子，请点击“Select”，然后选择“Residues”，再选中除标准氨基酸以外的所有分子。

然后依次点击“操作”和“Adams/Bonds”，并删除。接着，在“序列”中点击“收藏”，然后点击被视为配体的链。通过删除所选位置之外的所有残基，将配体链裁剪至已确定的相互作用片段。

单击“文件”并保存 PDB，将编辑后的结构另存为不同的 PDB 文件。将此文件复制到 Rosetta 应用程序可访问的 Linux 位置。运行此命令，使用 Rosetta 的 fixedbb 应用程序在序列多样化之前对基础结构的所有氨基酸侧链进行重新包装。

然后使用以下命令将重新包装的 PDB 文件重命名为带有 _repack 后缀的文件。接着，以设计模式运行 pepspec，使用此命令执行序列多样化。然后，使用 gen pepspec pwm 生成 pwm。

包含在 Rosetta 套件中的 py 脚本。要运行此脚本，请使用以下命令。要创建序列标志图，使用首选的文本编辑器打开上一步生成的包含肽序列的文件，并复制所有序列。

前往 WebLogo 服务器，将序列粘贴到“多重序列比对”文本框中。根据输入序列的长度选择所需的标志图格式和大小，然后单击“创建标志图”。通过该方案，可预测 IRF5 结合表面中保守的 p L x IS 基序的氨基酸偏好性。

序列多样化后生成的位置、权重矩阵和序列标志图显示，在432位点优先选择谷氨酸，而在433和435位点优先选择亮氨酸和异亮氨酸。通常由丝氨酸占据的427、429和436位点对天冬氨酸和谷氨酸表现出更高的偏好，突显了磷酸化及IRF5二聚化的作用。425位点对丝氨酸具有高度偏好，提示其在未磷酸化状态下参与蛋白质-蛋白质相互作用。