一种定量评估Populus trichocarpa树皮内生和表生细菌微生物组的工作流程

[Presenter] 一种对杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生细菌微生物组进行定量评估的工作流程。本研究设计并验证了一套详细的工作流程，用于研究定植于杨树（Populus trichocarpa）树皮内部组织或表面的微生物组。该流程详细描述了杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生微生物组的采样、样品处理、基因组DNA提取、目标区域PCR扩增、DNA文库构建，以及通过高通量测序技术对内生和表生细菌微生物组进行测序的全过程。我们还提供了对所得测序数据的简要分析流程。这一经过验证的工作流程将为实证研究杨树（Populus trichocarpa）及其他林木物种树皮的内生和表生微生物组群落提供有效方法。在人工气候室中培养三个月大的杨树（Populus trichocarpa）幼苗，使用灭菌修枝剪从灭菌土壤表面以上2至12厘米处截取10厘米长的茎段。将茎段放入灭菌的方形培养皿中。在灭菌的方形培养皿上，用含0.1% Tween 20的无菌棉球反复擦拭茎段表皮。将每块沾有微生物的棉球（表生样品）分别置于无菌1.5毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。完成茎段表面擦拭后，用无菌解剖刀切开树皮，剥离树皮并放入方形培养皿中。用无菌解剖刀将剥离的树皮切成约1厘米长的片段。通过以下步骤对片段表面进行灭菌：先在70%乙醇中浸泡2分钟，再在含0.1% Tween 80的次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，最后在70%乙醇中浸泡30秒。随后，用无菌蒸馏水清洗所有样品三次，并置于洁净工作台上风干。将每份灭菌后的茎皮内生样品分别放入无菌2毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。将树皮片段放入无菌5毫升硬质离心管中，每管加入三颗灭菌钢珠。将装有样品的硬质管在液氮中冷冻10分钟。使用珠磨仪研磨树皮样品5分钟。再次将硬质管在液氮中冷冻1分钟，重复珠磨步骤5分钟。向每根珠磨管中分别加入0.25克杨树（Populus trichocarpa）研磨后的茎皮和沾附有表生细菌群落的棉球，并加入60微升商业试剂盒提供的C1溶液，轻轻颠倒混匀。接着，使用珠磨仪对内生和表生样品进行均质化处理，共进行四次，每次1分钟，每次运行后将样品置于冰上冷却30秒。以10,000 × g离心1分钟，随后按照试剂盒说明书提取内生和表生样品。向白色滤膜中心加入30微升试剂盒提供的C6溶液，在25摄氏度孵育5分钟。室温下以10,000 × g离心1分钟。使用微量分光光度计测定从表生和内生样品中提取的基因组DNA浓度。用无菌ddH₂O将每份DNA样品稀释至2纳克/微升，作为PCR扩增的DNA模板。使用正向引物799F和反向引物1193R扩增细菌16S rRNA基因的V5至V7区域；同时使用正向引物515F和反向引物806R扩增细菌16S rRNA基因的V4区域。充分混匀每份样品后离心以去除气泡。在PCR仪上进行细菌16S rRNA基因V5至V7或V4区域的扩增反应。取每份样品5微升扩增产物，加载至1%琼脂糖凝胶，在120伏电压下电泳30分钟。在紫外灯下观察凝胶，确认PCR扩增是否成功。对每份样品，将三份PCR扩增产物在PCR管中混合。根据制造商说明书，使用商业试剂盒测定扩增产物的浓度。使用酶标仪检测荧光值。绘制标准DNA曲线，并据此计算扩增产物的DNA浓度。根据测定浓度，将来自杨树（Populus trichocarpa）树皮的内生或表生样品的PCR产物等浓度混合，构建扩增子文库。使用电泳装置进行琼脂糖凝胶电泳。简要步骤如下：配制1.3%琼脂糖凝胶（1.3克琼脂糖粉末溶于100毫升1×TAE缓冲液）。凝胶凝固后取出梳子，将凝胶置于含1×TAE缓冲液的电泳槽中。向每5体积单位的PCR产物中加入1体积单位的6×橙色上样缓冲液，每孔上样100微升，并在一孔中加入30微升DNA分子量标记。连接正负极后，以80伏电压电泳50分钟。使用洁净锋利的解剖刀从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段。称量凝胶切片并转移至无色离心管中。加入缓冲液浸没凝胶切片。按照试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒进行DNA回收。根据制造商方案，使用商业试剂盒在荧光计上测定纯化后的扩增子文库浓度，用于测序分析。使用荧光计读取标准品和样品检测管，通过观察单一条带确认文库质量。使用CHAM II分析并注释16S rRNA基因序列。根据参考序列，利用SILVA数据库进行分类学注释。使用R语言中的ggplot2包可视化分析结果。成功获得了杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生细菌微生物组的高质量基因组DNA。所有12个样品的PCR扩增均产生单一且强度高的正确大小条带。扩增子文库呈现单一峰型，符合测序前的质量要求。对于内生微生物组，使用引物对799F/1193R和515F/806R均获得了高质量测序读长。引物对799F/1193R产生的植物来源扩增序列显著更少。使用799F/1193R引物对时，杨树（Populus trichocarpa）树皮表生微生物组的ASV数量显著高于使用515F/806R引物对的结果。使用引物对799F/1193R分析发现，树皮表生细菌群落的Shannon指数低于内生细菌群落。进一步使用引物对799F/1193R探究了杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生部分细菌群落的分类学特征。本研究建立了一套从样品采集到数据分析的可靠且高效的工作流程，用于量化杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生细菌微生物组的组成与多样性。本方案可为研究木本植物树皮微生物组提供参考路径，有助于更深入理解其他木本植物中定植细菌群落的特征。