Name: 毛果杨树皮内生和附生细菌微生物组定量评估的工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: 了解毛果杨树皮内生和附生细菌微生物组的定量评估工作流程。本方法涵盖样品采集、基因组DNA提取、PCR扩增及高通量测序技术，为研究林木微生物组提供可靠的实验框架。

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我们感谢 David Anthony Atherton 先生提供视频解说，并感谢 B.N. 实验室成员提出的宝贵建议。本工作由国家自然科学基金（项目编号 32071741 [致 BN]）和重点研发计划&amp;新疆维吾尔自治区“十四五”计划项目（项目编号 2022B02014）， &#34;天池人才&#34; 引言 计划（至BN），国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（项目编号 2021YFD2200203 [负责人：GQ]）以及林木遗传育种国家重点实验室（东北林业大学）创新项目（项目编号 2019A01 [负责人：BN]）资助。

1.样品采集
<ol>
	<li>在人工气候室中培养3个月大的P. trichocarpa幼苗（温度21–25°C；光照周期为16小时光照/8小时黑暗，使用三波段线性荧光灯[T5 28 W 6400 K]提供约300 μEm−2 s−1的补光；相对湿度60–80%）26。</li>
	<li>使用灭菌修枝剪从灭菌土壤表面以上2–12 cm处截取10 cm长的P. trichocarpa茎段（图1A），并将茎段置于灭菌的方形培养皿（13 cm × 13 cm）中。 
	注意：本研究共选取六株大小一致的植株，其中三株用于每对引物的PCR扩增。</li>
</ol>
2. 样品处理
<ol>
	<li>使用无菌棉签蘸取0.1% Tween 20，在已灭菌的方形培养皿中反复擦拭茎秆表皮，以更高效地收集定植在树皮表面的微生物（图1B）。 
	注意：应使用湿度适中的无菌棉签收集附着于茎表面的微生物。擦拭茎表面时，避免使用过干或过湿的棉签。Tween 20 是一种表面活性剂，能够降低表面张力，有助于从植物表面获取更多的微生物样本27,28。</li>
	<li>用无菌刀片切下棉签头部，将含有附生微生物样本的每个棉签头放入无菌的1.5 mL离心管中。将样本储存于−80 °C。</li>
	<li>在擦拭完茎表面后，使用无菌解剖刀切开之前采集附生微生物的树皮区域，剥离树皮并将其置于方形培养皿中。</li>
	<li>用无菌解剖刀将步骤2.3中剥离的树皮切成约1 cm长的片段（图1C）。</li>
	<li>将片段浸入70%（v/v）乙醇中消毒2分钟。随后，将片段浸入含0.1% Tween 80的次氯酸钠溶液（有效氯含量2.5%）中处理5分钟。</li>
	<li>将步骤2.5获得的片段在70%（v/v）乙醇中再次消毒30秒29。然后，用无菌蒸馏水清洗所有样本三次，并将其置于洁净工作台中风干。 
	注意：使用无菌镊子来回搅动树皮样本，以确保表面充分灭菌。</li>
	<li>将每段表面灭菌后的茎皮样本（内生菌样本）分别存放在无菌的2 mL离心管中，并于−80 °C保存。</li>
</ol>
3. 基因组DNA提取
<ol>
	<li>进行以下步骤以对样品进行DNA提取前的预处理。
	<ol>
		<li>将2.7步骤中获得的表面灭菌的茎皮片段放入无菌的5 mL硬管中，并在每根管中加入三颗无菌的钢珠（4 mm）。 
		注意：此步骤应在超净工作台中进行，以防止微生物污染。2.2步骤中制备的棉球（附生样品）无需预处理，可直接用于基因组DNA提取。</li>
		<li>将含有样品的硬管在液氮中冷冻10分钟。</li>
		<li>使用珠磨机对树皮样品研磨5分钟。然后再次将硬管在液氮中冷冻1分钟，并重复珠磨步骤5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取基因组DNA。 
	注意：使用市售DNA提取试剂盒从内生和附生样品中分离基因组DNA。
	<ol>
		<li>将破碎的P. trichocarpa茎皮以及沾附有附生细菌群落的棉球（各0.25 g）分别加入珠磨管中。然后加入60 µL商业试剂盒提供的C1溶液，并通过轻轻颠倒混匀。</li>
		<li>接下来，使用珠磨机对内生和附生样品进行均质化处理，共进行四次，每次1分钟。每次运行后，将样品置于冰上冷却30秒。</li>
		<li>在10,000 x&#160;g条件下离心1分钟。</li>
		<li>按照试剂盒说明书（见材料表）提取内生和附生样品中的DNA。</li>
		<li>向白色滤膜中心加入30 µL C6溶液，在25 °C孵育5分钟。</li>
		<li>在室温下以10,000 x&#160;g离心1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. PCR 扩增
<ol>
	<li>标准化提取的DNA浓度。
	<ol>
		<li>使用微量分光光度计测定从附生和内生样品中提取的基因组DNA的浓度。</li>
		<li>用无菌ddH2O将每个DNA样品稀释至2 ng/μL，以获得用于PCR扩增的DNA模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增这些DNA样品。
	<ol>
		<li>使用正向引物799F（5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’）和反向引物1193R（5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’）扩增细菌16S rRNA基因的V5–V7区域10。使用正向引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和反向引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增细菌16S rRNA基因的V4区域30。 
		注意：每个样品提取的基因组DNA作为三次重复PCR扩增反应的模板，另设一个不含DNA的反应作为阴性对照。每个样品的PCR反应体系体积为25 μL。对于引物对799F/1193R，每个反应包含12 μL PCR水、1 μL正向引物（10 μM）、1 μL反向引物（10 μM）、1 μL DNA模板和10 μL混合溶液。对于引物对515F/806R，每个反应包含12 μL PCR水、1 μL正向引物（10 μM）、1 μL反向引物（10 μM）、1 μL DNA模板和10 μL混合溶液。使用引物对799F/1193R的PCR反应程序如下：98 °C预变性5 min，随后进行25个循环（98 °C变性30 s、53 °C退火30 s、72 °C延伸45 s），最后72 °C延伸5 min。使用引物对515F/806R的PCR反应程序如下：94 °C预变性3 min，随后进行35个循环（94 °C变性45 s、50 °C退火60 s、72 °C延伸90 s），最后72 °C延伸10 min。</li>
		<li>充分混匀每个样品，并离心以消除气泡。</li>
		<li>在热循环仪上对细菌16S rRNA基因的V5–V7或V4区域进行扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测扩增产物。
	<ol>
		<li>取5 µL每种扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶，于120 V电压下电泳30 min。</li>
		<li>在紫外光下观察凝胶，验证PCR扩增是否成功。使用引物对799F/1193R和515F/806R获得的PCR产物大小应分别约为430 bp和400 bp。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 扩增子测序文库的制备
<ol>
	<li>混合扩增产物并测定其浓度。
	<ol>
		<li>将每个样本的三份PCR扩增产物在PCR管中混合。</li>
		<li>根据试剂盒说明书（见材料表），向96孔微孔板的一个孔中加入5 μL PCR产物和195 μL工作液。接着，向同一微孔板的另一孔中加入10 μL标准DNA（试剂盒中浓度分别为0、5、10、20、40、60、80和100 ng/μL的DNA试剂）和190 μL工作液。完成此步骤后，测定PCR产物和标准DNA的荧光强度。</li>
		<li>使用微孔板读数仪测量荧光强度。 
		注意：采用标准荧光素的激发/发射波长（480/530 nm）来测定每个样本中双链DNA的含量。</li>
		<li>利用标准DNA溶液的已知浓度（0、5、10、20、40、60、80和100 ng/μL）及其对应的荧光强度，建立DNA浓度与荧光强度的标准曲线。将各PCR产物的荧光强度值代入该标准曲线，计算出PCR产物的DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建扩增子测序文库。
	<ol>
		<li>根据步骤5.1.4中检测到的浓度，将使用相同引物对扩增得到的剩余PCR产物按等浓度混合，以构建扩增子测序文库。 
		注意：用于通过荧光强度测定双链DNA浓度的那部分PCR产物不包含在扩增子测序文库中；测序文库由同一样本的剩余PCR产物构建而成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行凝胶回收。
	<ol>
		<li>使用电泳装置进行琼脂糖凝胶电泳。简要而言，配制1.3%琼脂糖凝胶（即在100 mL 1×&#160;TAE缓冲液中加入1.3 g琼脂糖粉末）。 
		注意：需确保凝胶中的加样孔数量足够容纳所有PCR产物和DNA标记物；本研究中，通过将1.3 g琼脂糖粉末溶解于100 mL 1×&#160;TAE缓冲液中制备1.3%琼脂糖凝胶。</li>
		<li>待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入含有1×&#160;TAE缓冲液的电泳槽中。然后，向每5体积单位的PCR产物中加入1体积单位的6×&#160;橙色上样缓冲液，每个加样孔上样100 µL。在一个加样孔中加入30 µL DNA标记物。连接正负极导线后，在80 V电压下电泳50分钟。 
		注意：本研究中，采用凝胶回收法纯化扩增子测序文库，该文库对应于使用引物对515F/806R或799F/1193R扩增出的约400 bp或430 bp条带。</li>
		<li>使用洁净且锋利的手术刀从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段。</li>
		<li>称量凝胶切片并转移至无色离心管中，加入缓冲液使其完全浸没。 
		注意：每个离心柱所能处理的最大凝胶量为400 mg。每1体积单位的凝胶切片需加入3体积单位的缓冲液。</li>
		<li>按照试剂盒说明书，使用凝胶回收试剂盒（见材料表）进行凝胶回收。 
		注意：通过本方法获得用于测序内生和表生细菌群落的扩增子文库，该文库由靶向细菌16S rRNA基因的PCR产物构建而成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认纯化后的扩增子测序文库质量。
	<ol>
		<li>按照制造商的操作说明，使用商用试剂盒（见材料表）并通过荧光计测定步骤5.3.5中获得的纯化扩增子测序文库中双链DNA的浓度（图2）。</li>
		<li>按照制造商的操作说明，使用商用芯片和试剂盒的核酸质量控制分析系统测定步骤5.3.5中获得的扩增子测序文库的目标DNA片段大小（见材料表）。 
		注意：确保片段大小处于预期范围内，并且扩增子测序文库中无引物二聚体存在。</li>
		<li>按照制造商的操作说明，使用商用试剂盒（见材料表）通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定步骤5.3.5中获得的测序文库的有效浓度。</li>
		<li>将扩增子测序文库稀释至符合测序平台推荐的上样浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 序列处理与统计分析
<ol>
	<li>在使用测序平台对步骤5.4.4中获得的扩增子文库进行测序后（参见 材料表)31在工作目录中创建一个名为 emp-paired-end-sequences 的文件夹，并将压缩的 fastq 格式测序文件保存至该文件夹中。然后打开 Ubuntu，激活 conda 环境以及 Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.</li>
	<li>编写一个映射文件并将其保存为文本文件。文件内容如下所示 表2.</li>
	<li>使用测序数据的比对文件拆分扩增子测序文库获得的测序数据，并去除测序数据中的引物序列。
	<ol>
		<li>使用以下命令拆分测序数据：time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza</li>
		<li>使用以下命令去除引物：time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F 或 515F --p-front-r 1193R 或 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 DADA2 流程筛选并去除所有嵌合体33将过滤后的序列在99%相似度下聚类为扩增子序列变体（ASVs）。
	<ol>
		<li>使用以下命令筛选并去除嵌合体，同时将序列聚类为ASV：time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza --o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 SILVA 数据库（v138）基于参考序列进行分类学注释34.
	<ol>
		<li>使用以下命令对步骤 6.4 中获得的 ASV 进行注释：time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 QIIME2（v2021.2）中使用以下命令创建 ASV 表： 
	qiime tools export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table 
	qiime tools 导出 --输入路径 taxonomy.qza --输出路径 exported-feature_table 
	biom 添加元数据 -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taxonomy --sc-separated taxonomy 
	biom 转换 -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key 分类学 
	注意：这些命令将生成一个表格，其中包含每个样本中所有ASV的序列读取数量。</li>
	<li>分别使用引物对 799F/1193R 和 515F/806R 计算内生和表生细菌群落产生的 ASV 数量及测序读长数量。
	<ol>
		<li>通过计数，计算在步骤6.6获得的ASV表中每个样本在门、纲、目、科和属水平上分别具有≥1条读长的ASV总数。</li>
		<li>根据步骤6.6获得的ASV表中所有ASV的读数数量之和，计算每个样本的总读数。</li>
		<li>使用第6.6步获得的ASV表中注释为叶绿体或线粒体的ASVs的读段数，通过计数计算每个样本中的植物读段数量。</li>
		<li>使用以下公式计算每个样本中的细菌序列读取数量： 
		细菌序列读取数 = 总序列读取数 − 植物序列读取数。</li>
		<li>使用 Excel (2019) 和 Prism (v8.0) 软件，计算并可视化由引物对 799F/1193R 和 515F/806R 扩增得到的内生和表生细菌群落的平均 ASV 数量（分别在门、纲、目、科和属水平上）或读长数量（总计，以及分别针对植物和细菌的读长数量）。</li>
		<li>使用Student’s t检验评估引物对799F/1193R与515F/806R在门、纲、目、科和属水平上扩增产生的ASV数量，以及总序列数、植物序列数和细菌序列数之间的差异显著性 t在 Prism（v8.0）软件中进行检验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下命令过滤注释为叶绿体和线粒体的序列读段：time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza</li>
	<li>使用以下命令构建系统发育树：time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza</li>
	<li>计算并可视化内生菌群和 使用 QIAME2（v2021.2）和 R（v4.0.5）中的 ‘ggplot2’ 软件包分析附生细菌群落35.
	<ol>
		<li>使用以下命令计算α多样性：time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth 所有样本中最低的测序读长数 --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算内生和表生细菌群落在门水平上的相对丰度。使用以下 QIIME2（v2021.2）命令生成名为“taxa-bar-plots”的 qzv 格式文件：time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
	<ol>
		<li>在 https://view.qiime2.org/ 网站在线打开文件 taxa-bar-plots.qzv。下载并保存从 level2 新生成的文件。使用 R（v4.0.5）按照以下公式计算相对丰度： 
		每个细菌门的相对丰度（%）=（每个样本中每个细菌门的读取数 / 每个样本的总读取数）×&#160;100 %. 
		使用 R（v4.0.5）中的 ggplot2、RColorBrewer、reshape 和 ggalluvial 包对数据进行可视化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析各优势门（定义为相对丰度超过某一阈值的门）相对丰度差异的显著性 &#62; 在STAMP软件中，使用799F/1193R引物对扩增的内生和表生细菌群落中，通过单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验（显著性水平为0.05）检测到的相对丰度差异（>0.5%）36.</li>
</ol>

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<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16s+rrna+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere%2C+and+roots+in+perennial+grass+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments.</a> J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dada2%3A+High-resolution+sample+inference+from+illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data.</a> Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Pruesse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+online+resource+for+quality+checked+and+aligned+ribosomal+RNA+sequence+data+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB.</a> Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).</li>
<li>Ginestet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Stat+Soc+Ser+A+Stat+Soc%22%5BJournal%5D)">Ggplot2: Elegant graphics for data analysis.</a> J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).</li>
<li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamp%3A+Statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform%22%5BJournal%5D)">Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).</li>
<li>Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+sequence+variants+should+replace+operational+taxonomic+units+in+marker-gene+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis.</a> ISME J. 11, 2639-2643 (2017).</li>
<li>Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+diversity+indices+for+the+characterization+of+the+soil+prokaryotic+community+by+metagenomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eurasian+Soil+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis.</a> Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).</li>
<li>Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+specialized+for+microbial+DNA+extraction+from+living+poplar+wood%5BTitle%5D)+AND+%22Not+Bot+Horti+Agrobot+Cluj+Napoca%22%5BJournal%5D)">A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood.</a> Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).</li>
<li>Jeffrey, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bark-dwelling+methanotrophic+bacteria+decrease+methane+emissions+from+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees.</a> Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).</li>
<li>Chelius, M. K., Triplett, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+archaea+and+bacteria+in+association+with+the+roots+of+zea+mays+l%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l.</a> Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于已发表的树皮微生物群研究方法7,18，我们提出的工作流程为鉴定和表征木本植物树皮的内生和表生微生物组提供了通用指导。该方法包括样本采集与处理、基因组DNA提取、PCR扩增、扩增子测序文库制备以及测序数据分析等步骤，可作为设计研究木本植物树皮微生物组实验方案的潜在蓝图。
在树皮微生物组研究中，一个常见问题是样本采集方法，即通常忽视了树皮中表生微生物与内生微生物样本之间的区别1。这限制了我们对木本植物树皮中表生和内生微生物组组成及功能的理解。在本方案中，通过棉签擦拭茎干树皮表面获得表生微生物样本，而经表面灭菌后的树皮中提取的微生物基因组DNA则被定义为内生微生物组。该简易方案可有效区分P. trichocarpa树皮的表生与内生样本，避免来自其他组织中隐匿微生物的偏差与干扰。该方法有助于对木本植物茎干微生物组开展更精细的研究。
...

树皮是木本植物茎的最外层，指维管形成层以外的所有组织，包括韧皮部和周皮1,2。大量研究表明，树皮在水分和碳水化合物的转运、保护树木免受火灾和机械损伤3，以及适应非生物4和生物胁迫5方面发挥着关键作用。更重要的是，作为树木与周围空气之间的界面，树皮还为微生物提供了独特的栖息环境6。值得注意的是，已证实与树皮相关的微生物具有促进寄主生长7、协助树木获取养分8、增强植物激素合成9以及保护寄主免受植物病原体侵染5等功能。然而，相较于叶际和根际微生物群落，目前对定殖于树皮上的微生物群落的关注仍十分有限10,11。关于树皮微生物组生物学特征的认识仍然十分匮乏。本方法学论文的目的是为研究人员提供一套用于描述木本植物树皮内生和表生细菌微生物组多样性与组成的方法流程。
基于已发表的树皮微生物群研究方法12,13，本研究设计并测试了一套基于16S rRNA基因扩增子测序分析的精细工作流程，用于探究定植于Populus trichocarpa（一种在木本植物生物学中广泛使用的重要模式生物14）茎皮内部组织或表面的细菌微生物组。P. trichocarpa具有生长迅速15、实验操作相对简便16、易于遗传转化等特点，并因其在木材生产中的广泛应用而著称17。具体而言，本研究所提出的方法首先详细描述了P. trichocarpa茎皮内生和附生微生物群的采样过程。在采集定植于树皮表面的微生物组后，通过加入以酒精和次氯酸钠对树皮进行表面灭菌的步骤，本研究建立了一种可同时且独立收集树皮内部结构中（内生菌）和树皮外表面（附生菌）微生物的实验流程。据我们所知，在已发表的关于木本植物树皮微生物组的研究中，尚无研究基于树皮内外生态位的明确区分，对同一树皮样本中的内生与附生微生物群落进行过联合分析18,19,20。因此，本研究开发的方法将使研究人员能够以更精确和全面的方式分析定植于树皮中的细菌群落的多样性和组成。此外，本研究还详细描述了基因组DNA提取、聚合酶链式反应（PCR）扩增、16S rRNA基因扩增子测序文库构建21以及测序数据分析的实验步骤。特别地，本研究采用了一对靶向细菌16S rRNA基因V5-V7高变区的引物，以减少对宿主植物线粒体和叶绿体序列的非特异性扩增22，从而获得无偏倚的树皮相关微生物组谱型。α多样性采用Shannon指数23进行评估，该指数是生态学研究中广泛使用的一种多样性指数；门水平的分类组成则在Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME）24和R软件25中进行计算与可视化。结合先前研究中已建立的树皮微生物群研究方法1,6，本研究的方法可为其他木本植物物种，特别是具有重要经济价值的森林树木的树皮微生物组研究提供协议设计的参考蓝图。

<table><tbody><tr><td>仪器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>珠磨机</td><td>DHS Life Science</td><td>401265</td><td></td></tr><tr><td>适用于1.5 mL离心管的离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002440</td><td></td></tr><tr><td>适用于PCR管的离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>8040528</td><td></td></tr><tr><td>微量分光光度计 Nanodrop</td><td>DHS Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>2010/2020&amp;nbsp;</td><td>微量分光光度计</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>Q33216</td><td>荧光计&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冰箱（-80℃）</td><td>Panasonic Healthcare Co., Ltd</td><td>17060107</td><td></td></tr><tr><td>T100 温控循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>温控循环仪</td></tr><tr><td>Tanon EPS-600&amp;nbsp;</td><td>Tanon</td><td>A-179047-2313</td><td>用于电泳</td></tr><tr><td>LabChip GX Touch HT</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS138625</td><td>文库DNA片段分布检测、核酸质量控制分析</td></tr><tr><td>Applied Biosystems QuantStudio 12K</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>文库定量</td></tr><tr><td>Illumina Novaseq6000</td><td>Illumina&amp;nbsp;</td><td></td><td>文库测序</td></tr><tr><td>材料：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>任意品牌</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯吸头 10 &amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>TF-300-R-S</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯吸头 20&amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯吸头 200&amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯吸头 1000&amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>离心管 1.5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96孔黑底透明平底微孔板</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>ZHENDE MEDICAL</td><td>76606</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil 试剂盒</td><td>QIAGEN&amp;nbsp;</td><td>12888-100</td><td>用于DNA提取</td></tr><tr><td>无酶离心管 1.5 ml</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1415-2600</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>天津永大化学试剂有限公司</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>硬管（5 ml）</td><td>DHS Life Science</td><td>0401261-17</td><td></td></tr><tr><td>Hot Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Quanta Bio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 2.0 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>PCR级水</td><td>QIAGEN&amp;nbsp;</td><td>17000-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>用于凝胶回收</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA 宽范围检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>用于扩增产物及纯化扩增子文库的浓度测定</td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>常德柏曼生物科技有限公司</td><td>110301014</td><td></td></tr><tr><td>钢珠</td><td>上虞市益新钢球工业有限公司</td><td>YXB36985</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>天津市北联精细化学品开发有限公司&amp;nbsp;</td><td>7681-52-9</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>纳川生物技术工作室</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Dual Protocol DNA High Sens 试剂盒</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS760672</td><td>DNA文库检测</td></tr><tr><td>VAHTS Illumina文库定量试剂盒</td><td>诺唯赞生物科技有限公司</td><td>NQ104</td><td>文库定量</td></tr></tbody></table>

一种定量评估populus trichocarpa树皮内生和表生细菌微生物组的工作流程

A Workflow for the Quantitative Assessment of the Endophytic and Epiphytic Bacterial Microbiomes of the Bark of Populus trichocarpa

定殖于植物表面及内部组织的微生物可能具有促进植物生长与健康的重要功能。然而，关于木本植物树皮组织微生物组的研究仍较为有限，尤其是杨属（Populus）树皮的内生和表生细菌群落。为弥补这一不足，我们建立了一套工作流程，用于定量分析Populus trichocarpa树皮中内生和表生细菌群落的组成与多样性。简言之，使用浸有0.1% Tween 20的棉球反复擦拭P. trichocarpa茎部表皮，以获取表生细菌样品；剥离后的表皮经表面灭菌后，分别利用液氮反复冻融和珠磨仪破碎，以收集内生细菌样品。从棉球粘附的表生细菌群落及破碎的P. trichocarpa树皮中提取基因组DNA，并采用针对细菌16S rRNA基因高变区V5-V7和V4区的引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。将每份内生或表生样品所得PCR产物的三个重复等浓度混合，构建扩增子文库，随后进行测序。对获得的序列进行拼接、质量过滤、嵌合体去除及分类学注释等分析。综上所述，我们建立了一套从样品采集到数据分析可靠且高效的工作流程，可用于通过16S rRNA基因测序解析P. trichocarpa树皮内生与表生细菌微生物组。结合先前研究中建立的树皮定殖微生物群落研究方法，本方法可为探索其他木本植物物种（尤其是具有重要经济价值的森林树木）树皮微生物组的研究方案设计提供参考蓝图。

采用优化后的实验方案（表1）成功获得了杨树（P. trichocarpa）树皮中内生和表生细菌微生物组的高质量基因组DNA。对全部12个样本进行PCR扩增后，均得到单一且清晰的条带，大小正确（图3）。两对引物799F/1193R和515F/806R分别在约400 bp和430 bp处成功扩增出内生或表生树皮组织样本中的目标产物。所构建的扩增子文库呈现单一峰值，DNA片段大小合格，无引物二聚体，浓度为22.16 nM，体积为100 μL，符合测序前的质量要求（图4）。
测序分析显示，使用引物对 799F/1193R 和 515F/806R 分别从 P. trichocarpa 树皮内生微生物组中获得了 178,781 和 131,362 条高质量序列（图 5A）...

本方案提供了一种从样品采集到数据分析的可靠且高效的流程，用于分析存在于三角叶杨（Populus trichocarpa）树皮中的内生和表生细菌微生物组。

一种定量评估Populus trichocarpa树皮内生和表生细菌微生物组的工作流程

定殖于植物表面和内部组织的微生物可能具有促进植物生长和健康等有益功能。然而，相关信息……

[Presenter] 一种对杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生细菌微生物组进行定量评估的工作流程。本研究设计并验证了一套详细的工作流程，用于研究定植于杨树（Populus trichocarpa）树皮内部组织或表面的微生物组。该流程详细描述了杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生微生物组的采样、样品处理、基因组DNA提取、目标区域PCR扩增、DNA文库构建，以及通过高通量测序技术对内生和表生细菌微生物组进行测序的全过程。我们还提供了对所得测序数据的简要分析流程。这一经过验证的工作流程将为实证研究杨树（Populus trichocarpa）及其他林木物种树皮的内生和表生微生物组群落提供有效方法。在人工气候室中培养三个月大的杨树（Populus trichocarpa）幼苗，使用灭菌修枝剪从灭菌土壤表面以上2至12厘米处截取10厘米长的茎段。将茎段放入灭菌的方形培养皿中。在灭菌的方形培养皿上，用含0.1% Tween 20的无菌棉球反复擦拭茎段表皮。将每块沾有微生物的棉球（表生样品）分别置于无菌1.5毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。完成茎段表面擦拭后，用无菌解剖刀切开树皮，剥离树皮并放入方形培养皿中。用无菌解剖刀将剥离的树皮切成约1厘米长的片段。通过以下步骤对片段表面进行灭菌：先在70%乙醇中浸泡2分钟，再在含0.1% Tween 80的次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，最后在70%乙醇中浸泡30秒。随后，用无菌蒸馏水清洗所有样品三次，并置于洁净工作台上风干。将每份灭菌后的茎皮内生样品分别放入无菌2毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。将树皮片段放入无菌5毫升硬质离心管中，每管加入三颗灭菌钢珠。将装有样品的硬质管在液氮中冷冻10分钟。使用珠磨仪研磨树皮样品5分钟。再次将硬质管在液氮中冷冻1分钟，重复珠磨步骤5分钟。向每根珠磨管中分别加入0.25克杨树（Populus trichocarpa）研磨后的茎皮和沾附有表生细菌群落的棉球，并加入60微升商业试剂盒提供的C1溶液，轻轻颠倒混匀。接着，使用珠磨仪对内生和表生样品进行均质化处理，共进行四次，每次1分钟，每次运行后将样品置于冰上冷却30秒。以10,000 × g离心1分钟，随后按照试剂盒说明书提取内生和表生样品。向白色滤膜中心加入30微升试剂盒提供的C6溶液，在25摄氏度孵育5分钟。室温下以10,000 × g离心1分钟。使用微量分光光度计测定从表生和内生样品中提取的基因组DNA浓度。用无菌ddH₂O将每份DNA样品稀释至2纳克/微升，作为PCR扩增的DNA模板。使用正向引物799F和反向引物1193R扩增细菌16S rRNA基因的V5至V7区域；同时使用正向引物515F和反向引物806R扩增细菌16S rRNA基因的V4区域。充分混匀每份样品后离心以去除气泡。在PCR仪上进行细菌16S rRNA基因V5至V7或V4区域的扩增反应。取每份样品5微升扩增产物，加载至1%琼脂糖凝胶，在120伏电压下电泳30分钟。在紫外灯下观察凝胶，确认PCR扩增是否成功。对每份样品，将三份PCR扩增产物在PCR管中混合。根据制造商说明书，使用商业试剂盒测定扩增产物的浓度。使用酶标仪检测荧光值。绘制标准DNA曲线，并据此计算扩增产物的DNA浓度。根据测定浓度，将来自杨树（Populus trichocarpa）树皮的内生或表生样品的PCR产物等浓度混合，构建扩增子文库。使用电泳装置进行琼脂糖凝胶电泳。简要步骤如下：配制1.3%琼脂糖凝胶（1.3克琼脂糖粉末溶于100毫升1×TAE缓冲液）。凝胶凝固后取出梳子，将凝胶置于含1×TAE缓冲液的电泳槽中。向每5体积单位的PCR产物中加入1体积单位的6×橙色上样缓冲液，每孔上样100微升，并在一孔中加入30微升DNA分子量标记。连接正负极后，以80伏电压电泳50分钟。使用洁净锋利的解剖刀从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段。称量凝胶切片并转移至无色离心管中。加入缓冲液浸没凝胶切片。按照试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒进行DNA回收。根据制造商方案，使用商业试剂盒在荧光计上测定纯化后的扩增子文库浓度，用于测序分析。使用荧光计读取标准品和样品检测管，通过观察单一条带确认文库质量。使用CHAM II分析并注释16S rRNA基因序列。根据参考序列，利用SILVA数据库进行分类学注释。使用R语言中的ggplot2包可视化分析结果。成功获得了杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生细菌微生物组的高质量基因组DNA。所有12个样品的PCR扩增均产生单一且强度高的正确大小条带。扩增子文库呈现单一峰型，符合测序前的质量要求。对于内生微生物组，使用引物对799F/1193R和515F/806R均获得了高质量测序读长。引物对799F/1193R产生的植物来源扩增序列显著更少。使用799F/1193R引物对时，杨树（Populus trichocarpa）树皮表生微生物组的ASV数量显著高于使用515F/806R引物对的结果。使用引物对799F/1193R分析发现，树皮表生细菌群落的Shannon指数低于内生细菌群落。进一步使用引物对799F/1193R探究了杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生部分细菌群落的分类学特征。本研究建立了一套从样品采集到数据分析的可靠且高效的工作流程，用于量化杨树（Populus trichocarpa）树皮内生和表生细菌微生物组的组成与多样性。本方案可为研究木本植物树皮微生物组提供参考路径，有助于更深入理解其他木本植物中定植细菌群落的特征。

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